鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯致人臍靜脈內皮細胞氧化損傷及白藜蘆醇的修復作用

王子璇, 劉偉, 藺博涵, 李濤, 楊琴, 虞綺雯, 朱偉, 孫曉春

(1. 江蘇大學醫學院, 江蘇 鎮江 212013; 2. 江蘇大學第四附屬醫院婦女保健科, 江蘇 鎮江 212000)

鄰苯二甲酸酯是一種廣泛用于聚氯乙烯塑料中的增塑劑,可通過食物鏈和水循環進入人體[1］。鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(di-2-ethylhexyl phthalate,DEHP)是最常見的鄰苯二甲酸酯類型,通常存在于聚合物產品中,可使塑料變得柔韌。DEHP用于大量常見的家庭生活用品,例如包裝食品和飲料、玩具、床墊、浴簾、雨衣、地磚以及化妝品和個人護理產品[2］。此外,DEHP還存在于許多醫療器械中,例如靜脈袋、血袋、導管以及透析袋[3］。由于與塑料中的聚合物為非共價結合,DEHP逐漸從聚合物基質中釋放到環境中,成為一種廣泛存在的環境污染物,大量暴露于普通人群之中[4］。研究表明,DEHP通過促進氧化應激對細胞造成損傷[5］,從而對肝臟[6］、腎臟[7］、神經系統[8］、生殖系統[9］等產生不良影響。作為一種高暴露率的毒物,DEHP在體內循環時間長,因此心血管系統很有可能受到DEHP的氧化損傷。

白藜蘆醇是一種天然存在的多酚和植物抗毒素,富含于桑葚、葡萄和紅酒中[10］。白藜蘆醇以其作為活性氧清除劑的抗氧化特性而聞名,例如清除羥基、超氧化物和金屬誘導的自由基[11］。此外,白藜蘆醇因其在低等生物體中觀察到的抗衰老作用以及抗癌作用而得到廣泛關注[12］。

本研究擬觀察DEHP在人臍帶內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)中通過氧化應激途徑造成細胞生物學特性的改變,以及白藜蘆醇對該損傷的修復作用。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞與器材

HUVEC(中國科學院上海細胞庫);DEHP(上海羅恩試劑公司);H-DMEM培養基、胎牛血清(德國Viva Cell公司);二甲基亞砜溶液(上海生工公司);胰酶(美國Gibco公司);細胞凋亡檢測試劑盒、青霉素-鏈霉素溶液(上海碧云天公司);PBS溶液(北京Biosharp公司);丙二醛檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒、線粒體膜電位檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所);活性氧檢測試劑盒(大連美倫生物);CCK8試劑盒(南京諾唯贊公司);抗Bax、Bcl-2抗體(美國Cell Signaling Technology公司);HRP標記羊抗兔IgG(上海愛必信公司);白藜蘆醇(北京索萊寶公司);基質膠(上?？祵幑?。

實驗所用CO2細胞培養箱為美國Thermo公司產品;倒置顯微鏡為日本Olympus公司產品;酶標儀為美國Biotek公司產品。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 HUVEC在H-DMEM培養基中培養,該培養基補充了10%熱滅活胎牛血清、青霉素(100 IU/mL)、鏈霉素(100 mg/mL)和2 mmol/L L-谷氨酰胺,在37 ℃、5% CO2的加濕培養箱中進行培養。細胞保持對數生長期,每隔3～4 d傳代1次。

1.2.2 CCK8實驗檢測細胞活性 將HUVEC接種到96孔板中24 h,然后添加不同濃度的DEHP(0、10、20、40和80 μmol/L)或白藜蘆醇(0、5、10、20和40 μmol/L),24 h后將CCK8溶液(每孔10 μL)添加到96孔板中。細胞在37 ℃下孵育1 h,用酶標儀測定450 nm處的光密度。細胞增殖率=(實驗孔光密度-空白孔光密度)/(對照孔光密度-空白孔光密度)。依據結果挑選出合適的處理濃度,使用CCK8試劑盒檢測各組HUVEC處理后的細胞活性。

1.2.3 實驗分組及處理 將DEHP溶解在DMSO中作為儲備溶液,DEHP工作溶液在給藥前即時制備。HUVEC細胞在板中培養24 h后,對照組用0.1% DMSO處理,損傷組和修復組加入80 μmol/L DEHP,繼續孵育24 h。隨后對照組和損傷組更換為正常培養液(0.1% DMSO),處理組更換為含有40 μmol/L白藜蘆醇的培養液孵育24 h。

1.2.4 化學比色法檢測丙二醛水平和SOD活性 按“1.2.3”的方案于12孔板中培養并收集細胞,用RIPA緩沖液裂解細胞,提取細胞總蛋白檢測濃度后備用。根據試劑說明書操作,使用丙二醛檢測試劑盒、SOD檢測試劑盒檢測HUVEC的丙二醛水平(nmol/mgprot)和SOD活性(U/mgprot)。每個樣本設3個復孔,實驗獨立重復3次。

1.2.5 DHE探針檢測活性氧水平 按“1.2.3”的方案于12孔板中培養細胞,使用無血清的DMEM高糖培養基稀釋DHE探針使其終濃度為2 μmol/L,棄去板內培養基并用PBS清洗各孔1次,再于各孔加入含有探針的培養基500 μL,將細胞在37 ℃下孵育20 min。PBS洗滌3次后,立即將板放入熒光顯微鏡下進行熒光檢測和拍照。

1.2.6 JC-1探針檢測線粒體膜電位變化 按“1.2.3”的方案于12孔板中培養細胞,按照JC-1染液(200×)∶去離子水=1∶160的比例稀釋JC-1染液,充分溶解并混勻,之后按混合液∶JC-1緩沖液(5×)=4∶1的比例加入JC-1緩沖液(5×)配置成JC-1工作液,棄去板內培養基并用PBS清洗各孔1次,將細胞在37 ℃下孵育20 min。使用JC-1緩沖液(1×)洗滌3次后,立即將板放入熒光顯微鏡下進行熒光檢測和拍照。

1.2.7 劃痕實驗檢測HUVEC遷移能力 按“1.2.3”的方案于6孔板中培養細胞,調整細胞濃度為5×105/孔,用200 μL的槍頭對不同處理組的HUVEC垂直于6孔板劃線,用PBS清洗劃線脫落的細胞,加入無血清的H-DMEM培養液,用倒置顯微鏡觀察劃痕并拍照記錄(0 h),繼續放入37 ℃、5% CO2加濕培養箱中培養24 h,用倒置顯微鏡觀察劃痕(24 h)相對于0 h的愈合情況。通過Image J分析劃痕面積,計算劃痕愈合率。

1.2.8 Transwell遷移實驗檢測HUVEC遷移能力 將“1.2.3”中處理后的HUVEC進行消化,并用無血清H-DMEM細胞培養液重懸細胞,調整細胞種板數量為1×105個/小室并種于Transwell小室中。于24孔細胞培養板中按分組各加入600 μL含有10% 胎牛血清的H-DMEM細胞培養液,置于37 ℃、5% CO2加濕培養箱中12 h。取出小室后用PBS清洗2～3次,使用4%多聚甲醛溶液固定30 min,PBS清洗2～3次,使用結晶紫溶液于室溫染色30 min,最后用PBS清洗2～3次,洗凈殘余物質后用棉簽將上室細胞擦拭干凈,室溫晾干后在鏡下隨機觀察小室底部細胞遷移情況,進行相應組別小室細胞的拍照與計數。

1.2.9 體外成管實驗檢測HUVEC體外成管能力 按“1.2.3”的方案培養細胞后,制備細胞懸液,調整細胞密度為1×106個/mL。按照每孔50 μL將細胞懸液滴加到預先涂有基質膠的96孔板中,分為對照組、損傷組和修復組。輕輕振蕩,使細胞分布均勻,在培養箱中常規培養4 h。倒置顯微鏡觀察拍攝細胞成管情況,Image J軟件分析圖片結果,定義至少3條管的交匯處為1個交點,以交點數目表示各組成管結果。

1.2.10 流式細胞實驗檢測HUVEC凋亡率 在6孔板中按“1.2.3”的方案培養細胞。處理結束后,用不含乙二胺四乙酸的胰酶消化并收集細胞。細胞用預冷的PBS漂洗2次后,用100 μL結合緩沖液重懸細胞,加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI染色液室溫避光孵育10 min。孵育結束后加入400 μL結合緩沖液,輕輕混勻。將對照組、損傷組和修復組細胞分別進行Annexin V-FITC和PI單染。于1 h內用流式細胞儀檢測細胞樣品,在雙色流式細胞儀散點圖上,早期凋亡細胞散在分布于右下象限,晚期凋亡細胞散在分布于右上象限。存活細胞和壞死細胞分別散布在左下象限和左上象限。凋亡率計算公式:凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。

1.2.11 蛋白質印跡實驗檢測HUVEC內凋亡相關蛋白表達 按“1.2.3”的方案培養細胞后,收集細胞,使用RIPA緩沖液裂解細胞,提取蛋白以供后續實驗使用。配制電泳膠,于電泳設備中加入蛋白樣本,70 V電泳30 h后加壓至110 V繼續電泳直至不同分子量蛋白分離,在200 mA下將蛋白轉至PVDF薄膜上并使用BSA封閉液封閉2 h,相關一抗孵育過夜,標記二抗后于化學發光儀器中曝光后進行結果分析。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 DEHP濃度篩選和HUVEC細胞增殖能力變化

使用不同濃度的DEHP處理HUVEC 24 h后,80 μmol/L處理組的細胞增殖率為0.81±0.05,增殖率被明顯抑制(t=5.18,P<0.01),其余各組未出現抑制現象,故選用80 μmol/L作為后續DEHP損傷的處理濃度。使用不同濃度白藜蘆醇處理24 h后,各組HUVEC的細胞增殖能力均未受到抑制,參考先前研究白藜蘆醇的處理濃度以及為了后續結果的顯著性,選用40 μmol/L作為后續白藜蘆醇修復的處理濃度。后續實驗中,對照組細胞增殖率為1.00±0.02,損傷組為0.76±0.04,修復組為0.92±0.04,說明DEHP對HUVEC的增殖能力有抑制作用(t=5.41,P<0.01),同時白藜蘆醇可以修復該種損傷(t=3.72,P<0.05)。見圖1。

圖1 不同濃度DEHP與白藜蘆醇處理HUVEC后細胞增殖能力的比較

2.2 HUVEC內丙二醛水平和SOD活性變化

結果顯示,相比對照組,損傷組HUVEC的丙二醛水平明顯上升(t=10.81,P<0.01),SOD活性明顯上升(t=6.29,P<0.01)。修復組相比損傷組,HUVEC的丙二醛水平明顯下降(t=5.56,P<0.01),SOD活性明顯下降(t=4.16,P<0.05)。見圖2。

圖2 HUVEC中丙二醛水平和SOD活性的變化

2.3 HUVEC中活性氧水平變化

結果顯示,損傷組HUVEC的活性氧水平明顯高于對照組(t=10.16,P<0.01),修復組HUVEC的活性氧水平明顯低于損傷組(t=6.55,P<0.01)。見圖3。

圖3 各組HUVEC中活性氧水平的變化(×400)

2.4 HUVEC中線粒體膜電位變化

結果表明,損傷組HUVEC細胞的線粒體膜電位相比對照組有明顯損失(t=21.72,P<0.01),而修復組HUVEC細胞的線粒體膜電位相比損傷組有明顯上升(t=13.64,P<0.01)。見圖4。

圖4 各組HUVEC中線粒體膜電位的變化(×400)

2.5 HUVEC遷移能力變化

損傷組HUVEC的劃痕愈合能力相較于對照組明顯下降(t=7.71,P<0.01),修復組HUVEC相較于損傷組該能力得到了較大提升(t=7.22,P<0.01)。損傷組HUVEC在Transwell小室中遷移能力相較于對照組明顯下降(t=10.47,P<0.01),修復組HUVEC相較于損傷組該能力得到了較大提升(t=8.64,P<0.01)。見圖5、圖6。

圖5 各組HUVEC劃痕愈合能力的變化(×100)

圖6 各組HUVEC在Transwell小室中遷移能力的變化(×200)

2.6 HUVEC血管形成能力變化

對照組與修復組細胞多為拉長的梭形,互相連接成網狀,形成的管狀結構在6 h時趨于穩定,隨著時間的延長逐漸崩解。損傷組細胞有較多孤立的圓形、卵圓形,散亂分布在視野中。量化結果后,損傷組分支點形成數明顯低于對照組(t=8.93,P<0.01),而修復組分支點形成數明顯高于損傷組(t=8.88,P<0.01)。見圖7。

圖7 HUVEC血管形成能力的變化(×100)

2.7 HUVEC凋亡情況

細胞流式實驗結果表明,損傷組HUVEC細胞凋亡率相較對照組明顯升高(t=20.50,P<0.01),修復組HUVEC細胞凋亡率相較損傷組明顯下降(t=13.97,P<0.01)。蛋白質印跡實驗結果表明,損傷組HUVEC相較對照組,Bax表達水平升高(t=4.02,P<0.05),Bcl-2表達水平下降(t=5.07,P<0.01),Bcl-2/Bax比值下降(t=18.55,P<0.01);修復組HUVEC相較損傷組Bax表達水平下降(t=3.04,P<0.05),Bcl-2表達水平上升(t=3.47,P<0.05),Bcl-2/Bax比值上升(t=30.76,P<0.01)。見圖8、圖9。

圖8 HUVEC細胞凋亡率的變化

圖9 HUVEC凋亡相關蛋白相對表達的變化

3 討論

DEHP是美國食品和藥物協會批準的醫療器械中最常用的增塑劑,應用于儲血袋、管道回路、腸內營養管、氣管插管等[3］。生活中進入人體的DEHP的量與生活方式和醫療器械的使用情況相關,接受醫療措施患者的血液DEHP濃度往往較高[13］。DEHP可對人體造成多種損傷,如甲狀腺損傷、肝臟損傷、神經系統損傷和生殖系統損傷等[14］。本文以HUVEC為觀察對象,研究DEHP對心血管系統的不利影響。

氧化應激是由自由基在體內產生的一種負面作用,自由基可以直接或間接氧化或損傷DNA、蛋白質和脂質,進而誘發基因突變、蛋白質變性和脂質過氧化[15］。細胞膜中脂質過氧化的增加還可能引發基因表達量的改變,從而引發細胞凋亡[16］。丙二醛是由活性氧和自由基誘導的脂質過氧化的最終產物之一,其水平反映細胞氧化損傷程度[17-18］。線粒體在啟動細胞凋亡中至關重要,過氧化氫可誘導線粒體通透性增加、線粒體膜電位破壞,從而誘導細胞的凋亡[19］。

本研究建立了DEHP暴露后的HUVEC體外模型,模擬DEHP在進入人體后對心血管系統造成損傷的微環境,初步探究了DEHP對HUVEC損傷的機制。結果顯示,相較于對照組,損傷組中HUVEC的活性氧和丙二醛水平明顯升高,SOD活性明顯增強,線粒體膜電位水平明顯下降,這說明DEHP對HUVEC造成了氧化損傷,使HUVEC處于氧化應激狀態。損傷組HUVEC的Bax表達量上升,Bcl-2表達量下降,Bcl-2/Bax比值下降,這說明DEHP對HUVEC的氧化損傷,通過改變HUVEC中凋亡相關蛋白的表達,誘導細胞凋亡。多項實驗結果表明,DEHP對HUVEC的氧化損傷抑制了HUVEC的增殖、遷移和血管形成等能力。

白藜蘆醇是具有生物學活性的多酚類化合物,由于其分子結構中含有羥基基團,是天然的自由基清除劑[20］,研究表明白藜蘆醇具有保護心血管的功能[21］。本研究中在DEHP損傷HUVEC后使用白藜蘆醇進行修復。相較于損傷組,修復組HUVEC中的活性氧被白藜蘆醇有效清除;丙二醛水平和SOD活性下降,線粒體膜電位回升,說明白藜蘆醇的抗氧化作用有效緩解了HUVEC的氧化應激狀態。凋亡相關蛋白結果表明,白藜蘆醇的抗氧化作用一定程度上抑制了HUVEC的凋亡。

綜上所述,本研究初步證明了DEHP可通過氧化應激途徑抑制HUVEC的增殖、遷移和成管能力并誘導其發生凋亡,同時白藜蘆醇可以發揮其抗氧化作用以修復該種損傷。由于氧化應激涉及的信號通路十分復雜,體內實驗研究尚未完善,DEHP在體內組織中的代謝、代謝產物對心血管系統影響的具體機制以及白藜蘆醇對該類損傷的修復作用還有待進一步研究。