木本果樹組織培養主要難點及對策分析

羅一然 李雄軍

（大理農林職業技術學院，云南大理 671003）

植物的組織培養技術發源于20世紀，經過100年的發展，已經成為生物技術的基礎，不僅運用于科學領域，也廣泛運用于農業、林業的生產實踐。組織培養技術在草本植物特別是花卉種苗繁殖生產中已經得到廣泛運用，但木本植物理化性質復雜，組織培養的難度更大且需要更多的時間摸索，即便培養成功，在推廣應用時也要考慮生產成本，從而導致產業化應用難度大。目前，木本植物組織培養過程中往往伴隨著滅菌難、褐化、生根難等問題，且大多木本植物組培技術之間還未找到可普遍遵循的規律[1]。隨著木本果樹需求量的迅速增加，其組織培養和快速繁育技術研究越來越受重視。現代生物技術還能以組織培養為基礎，結合細胞融合及基因工程技術對優良樹種進行轉基因[2]。因此，有必要對木本果樹植物組織培養中存在的難點進行概括和分析，為木本果樹植物組織培養研究提供理論參考。

1 外植體消毒

1.1 外植體選擇

木本植物選擇合適的外植體進行組織培養可以有效的控制污染。選擇幼嫩、木質化較低的莖段、腋芽或者在種子外皮包裹下的胚、子葉等材料作為外植體進行培養，可以提高組織培養脫毒的機率。馮金玲等[3]以錐栗的胚、腋芽、韌皮部、葉子和莖段作為外植體，研究不同外植體和消毒方法對組織培養的影響，結果表明，胚為污染率最低且成活率最高的外植體。汪靈丹等[4]比較了大葉櫸的頂芽、腋芽、莖段、葉片等外植體，得出在每年3月采集的頂芽是理想的外植體，能獲得比較好的消毒效果且萌芽率在95%以上，選擇適宜植物生長的季節以及晴朗干燥的日子，可以減少污染。陳澤雄和婁娟[5]在酷熱干燥的盛夏午后以半木質化的柑桔帶芽莖段為外植體，顯著降低了污染率，最終將污染率控制在10%之內。

1.2 木本植物外植體消毒方式

對于大多數草本植物來說，只需進行表面消毒即可，通過試驗篩選出一個合適的消毒時間就能達到較好的滅菌效果。而木本植物本身攜帶許多內生菌，加之外植體材料木質化，在表面消毒的同時往往還需要進行其他處理。常用于植物組織培養的消毒劑有許多（表1），針對不同植物不同部位的外植體，選擇一種恰當的消毒方法，才能達到滅菌效果。

表1 不同消毒劑效果比較

木本植物外植體攜帶的內生菌往往比表面細菌更多且更復雜，僅僅使用一種消毒劑消毒難以達到滅菌效果。所以木本植物消毒時，要采用消毒劑組合的方式來消毒，常見的組合消毒方式為酒精+升汞、酒精+次氯酸鈉。張學英等[6]在研究白樺組織培養時，先將外植體沖洗20 min，然后在超凈工作臺上，用75%酒精浸泡30 s，再用0.15%的升汞浸泡10 min，無菌水沖洗5次，達到了較為理想的消毒效果。陳雪蓮等[7]對黃連木莖段進行消毒時，采用70%乙醇滅菌5 s，再用0.1%的氯化汞滅菌8～12 min，效果最好，污染率和褐變率都最低。但有些木本植物的外植體，使用組合消毒劑消毒也很難根除細菌，如酚類分泌量比較大的漆樹、阿月渾子等。針對這一類植物外植體，消毒前要增加一步結合消毒劑的沖洗操作，以漆樹為例，用加入潔爾滅的流水沖洗2 h，再進行組合式消毒，可以取得較好的殺菌效果。

2 褐化的發生與抑制措施

2.1 外植體選擇

與草本植物相比，木本植物更容易發生褐變，因為它們木質素和單寧含量較高，這兩種物質是酚類糖苷化合物合成的前體，在離體培養過程中容易發生褐變。鞠志國[8]對果實成分進行提取檢測，發現果實內總酚含量與褐變有直接關系。陳正華[9]在以多種基因型的香蕉花藥為對象培養時觀察到，木質化低的歐洲栗外植材料褐變較輕，木質化較高的外植體褐變現象較為普遍且較重，其內部酚類物質隨外植體的木質化程度升高而增加。如1月的歐洲栗芽較幼嫩，培養時酚類物質形成少，5-6月份，芽逐漸木質化，酚類物質增多。由此可見，外植體材料的基因型或者材料的年齡差異，導致褐變水平也有很大差異。

2.2 合理選擇抑制劑

在培養基制作過程中混合一定量的抗氧化劑和其他抑制劑，可有效減輕外植體在離體培養中的褐化程度。維生素C的還原性還可以使多酚氧化酶失活，阻礙酚類物質進行氧化反應。黃霞等[10]發現香蕉莖尖培養時，在培養基中加入適量活性炭與維生素C，可有效防止外植體的褐變，這是因為維生素C在酶的催化下會吸收掉培養基中的部分氧，使酚類有害物質因缺氧減弱氧化。另外，水解酪蛋白、PVP、半胱氨酸、硫脲、氰化鉀、部分氨基酸等物質都可作為抑制劑來控制褐變率[11]。

活性炭(AC)是一種高效的天然吸附劑，可以有效吸附植物分泌到培養基中的酚、醌等促褐變物質，從而提高外植體成活率[12]。但其吸附能力強，在吸附有害成份的同時也會吸附培養基中的外源激素和營養成份，使培養基效力降低，影響外植體的正常發育。因此，活性炭的用量要適度，同時調整激素配比，在防止褐變的同時，確保外植體正常發育。

2.3 其他抑制褐變方式

對于易褐變的外植體材料，可以在組培時持續進行轉瓶操作，改變外植體與培養基的接觸面，或者更換新的培養基來消弱酚類物質的毒害。所以定期地將外植體轉移一次新培養基，是一種有效抑制褐變的手段。

對外植體材料預處理也可以有效減輕醌類物質對培養物的毒害作用。許多外植體經過低溫處理后再接入培養基，可以有效降低褐化率。也可以使用液體培養基對外植體進行懸浮培養，待組織中的酚類物質部分滲入培養液中后，再將外植體取出，接入到固體培養基中，也能有效抑制褐化現象[13]。

通過總結前人研究經驗，可以把組織培養褐變歸結為是酚類物質被氧化的結果。褐變的引發是由多種因素協同作用影響的，從外植體材料內部來看，其生理狀態、基因型、培養條件、營養狀況和年齡均會影響褐變的產生，培養基成分、外源激素含量及比例、培育環境條件等也會影響褐變的產生，所以褐變并不是單純由某個因素促成，它的發生需要考慮多個環節，從關鍵環節阻斷褐變源，才是控制褐變的有效手段。

3 木本植物生根誘導

木本植物再生植株生根較困難[9]，生根問題仍然是目前組織培養完整體系建立和高效快繁的瓶頸。為解決木本植物生根困難的問題，目前國內外學者均對不同植物開展了大量的研究工作。

3.1 合理的激素配比

適當的外源激素能夠促進生根，主要的作用機理是能有效刺激細胞分裂，打破細胞休眠，加快分裂進程。NAA與IBA常被用在植物組織培養的生根環節，裴東等[14]以幾種不同基因型的核桃嫩莖為外植體進行生根誘導研究，在培養基中加入適量濃度的IBA，顯著提高了組培苗的生根率。董社琴等[15]以紫龍角的不同器官為外植體材料，添加不同濃度的NAA，篩選出了最佳生根培養基1/2MS + NAA 2.5 mg/L。郝愛麗等[16]在對青榨槭組培時發現，培養基中加入適量NAA、IBA和GA3后均能提高青榨槭的生根效率，并且獲得根系發達的完整植株。

3.2 微嫁接

微嫁接是一種建立在組織培養基礎上的嫁接技術，在試管內將砧木與接穗進行嫁接，主要針對目前生根難的木本植物品種。先以實生種子培養砧木，通過微嫁接的方式，嫁接組培苗，最后獲得微嫁接苗，提高成活率。在蘋果上，先利用種子在培養基上生根發芽，然后切去主芽，保留根段作為砧木，將較難生根的蘋果品種組培苗嫁接于該根段上，克服了生根難、成活率低的難題[9]。同樣的技術在柑橘組培研究中也有類似文獻報道[17]。

3.3 光照強度對生根的影響

謝耀堅[18]發現桉樹愈傷組織在光照周期為12 h/d條件下，容易誘導出不定根，在無光照條件下卻不能誘導出根系。而James[19]等人則認為，暗培養是部分木本植物不定根發生的前提，避光培養不僅可以改善根系弱小的問題，也能促使植株長出更多須根、側根，這大概與暗培養使得植株的內部生理狀態的發生改變有關。

3.4 合理的基本培養基選擇

合理的培養基選擇，是促進木本植物生根的關鍵，除了基本營養元素的添加外，還應該注意培養基的物理性質。國外學者Chaum[20]將澳洲堅果不定芽接入以蛭石代替瓊脂為基質的MS培養基中誘導生根，這種培養基通氣性良好，成功誘導出了生根苗。

在組織培養生根時，一般使用1/2甚至1/4無機鹽濃度的培養基，姚瑞玲等[21]在對松樹進行不定根誘導時以1/2量的WPM、改良的MS和DCR等不同基本培養基開展試驗，最后篩選出1/2改良的MS培養基作為試驗的生根培養基。尹麗莎等[22]發現北美紅杉組培苗生根誘導時，不同量的MS培養基生根率從高到低依次為：1/4MS＞1/2MS＞MS，而且1/4MS培養基中北美紅杉根系發達且生長良好。

在土壤中低磷素環境下，山龍眼科植物的根系為了增加磷素吸收而伸長發育。杜建斌[23]在對山龍眼科植物根發育生理效應研究中發現，在高磷土壤中，山龍眼根很少發育。筆者在對山龍眼科植物澳洲堅果進行組織培養時，曾選用更適合木本植物的組織培養的WPM培養基，但其磷素水平與MS培養基一樣（170 mg/L），生根效果不佳，后改用1/2MS培養基，獲得了良好的生根效果，這也驗證了前人的結論。在誘導木本植物組培苗生根時，要從植物生理因素、培養基理化因素等多個方面進行分析，在綜合條件共同作用下誘導生根是解決問題的關鍵。

4 結語

當前木本果樹植物組織培養研究工作的重點是建立起和草本果樹植物一樣高效的再生體系，這樣更有利于全面研究木本植物植株離體再生機制，深入了解植物的遺傳變異。同時還要摸索更多木本植物再生的其他方式，多角度分析影響木本植物組織培養的問題，靈活尋找解決辦法。筆者相信，合理利用各種科學技術，發揮組織培養優點，木本植物組織培養實現工廠化繁育只是時間問題。