熊果酸調(diào)控TLR4/MyD88/NF-κB通路改善GDM大鼠糖脂代謝及炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激

羅 艷,李玉林,尹 恒

(湖北省婦幼保健院,湖北 武漢 430070)

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)是指在妊娠期間發(fā)病或首次發(fā)現(xiàn)的糖耐量異常,妊娠期間胰島素抵抗以及胰腺β細(xì)胞功能障礙均可引起的妊娠期糖尿病,對(duì)妊娠過(guò)程及胎兒的發(fā)育造成不良影響,也影響著孕婦的健康[1]。引起胰島素抵抗的因素復(fù)雜多樣,其中肥胖導(dǎo)致的血糖血脂水平過(guò)高、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)均會(huì)產(chǎn)生并加重胰島素抵抗,而胰島素抵抗會(huì)導(dǎo)致GDM發(fā)生發(fā)展[2]。GDM患者發(fā)生炎癥反應(yīng)會(huì)進(jìn)一步加重胰島素抵抗,從而加劇GDM嚴(yán)重程度,Toll樣受體4(toll-like receptor 4,TLR4),髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)及核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)通路被認(rèn)為是常見(jiàn)的炎癥通路。已有研究表明TLR4和MyD88的蛋白低表達(dá)以及NF-κB的磷酸化水平的降低,可以降低炎癥因子TNF-α的表達(dá)進(jìn)而改善胰島素抵抗[3]。

熊果酸(ursolic Acid,UA)提取于中藥植物熊果,是天然三萜類(lèi)化合物,具有抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等生物活性[4]。目前研究證明,UA可以降低由高脂飲食和鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠的血糖和血脂的水平,緩解胰腺組織中的氧化應(yīng)激效應(yīng),并促進(jìn)胰腺β細(xì)胞的再生,以確保胰島素的合成與分泌,從而發(fā)揮預(yù)防和治療糖尿病的積極作用[5]。另外,UA通過(guò)抑制TLR4/MyD88/NF-κB炎癥通路可能改善胰島素抵抗,達(dá)到緩解GDM的目的。因此,本研究基于UA的抗炎、抗氧化活性,探討UA介導(dǎo)TLR4/MyD88/NF-κB炎癥通路,對(duì)GDM大鼠糖脂代謝、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)使用SPF級(jí)SD雌性大鼠65只,6周齡,體重約為160～180g和雄性大鼠130只,6周齡,體重約為200～220g,所有實(shí)驗(yàn)大鼠均購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司上海分公司,許可證號(hào):SCXK(滬)2022-0007。所有實(shí)驗(yàn)大鼠均飼養(yǎng)于本院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,自由飲食水,12/12h光暗交替培養(yǎng),國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)一周,經(jīng)檢查無(wú)異常后,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 試劑與儀器

試劑:UA(分析標(biāo)準(zhǔn)品,HPLC≥98%)、STZ購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司,白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白細(xì)胞介素-2(interleukin-2,IL-2)、白細(xì)胞介素-4(interleukin-4,IL-4)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的酶聯(lián)免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒均購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司,丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過(guò)氧化氫酶(catalase,CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathion peroxidase,GSH-Px)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司,一抗過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator activated receptor γ,PPARγ)、TLR4、MyD88、p-NF-κB p65、NF-κB p65、β-actin和二抗均購(gòu)自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司。

儀器:全自動(dòng)酶標(biāo)儀購(gòu)自賽默飛世爾科技中國(guó)有限公司,全自動(dòng)生化儀購(gòu)自北京普朗新技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 造模與分組

造模參考以往研究[6]進(jìn)行,雌性大鼠經(jīng)過(guò)高糖高脂喂養(yǎng)8周后與雄性大鼠1∶2合籠制備孕鼠,第二天檢查陰道涂片,觀察到精子記為妊娠第1天(共60只雌鼠檢測(cè)到精子),在妊娠第5天,腹腔注射35mg/kg STZ構(gòu)建GDM模型,注射STZ后的24h和72h檢測(cè)空腹血糖(fasting blood glucose,FBG),若FBG值>13.5mmol/L,即為造模成功。將造模大鼠隨機(jī)分為模型組(GDM組)、UA低劑量組(UA-L組)、UA中劑量組(UA-M組)、U高劑量組(UA-H組)[7]和二甲雙胍組[8],另設(shè)置普通飼料喂養(yǎng)的大鼠作為正常組(NC組),每組10只。GDM組和NC組給予生理鹽水灌胃,UA-L、M、H組分別給予對(duì)應(yīng)劑量的25mg/kg、50mg/kg和100mg/kg UA,二甲雙胍組給予200mg/kg的二甲雙胍。一天一次,連續(xù)給藥16天。

1.3.2 樣本采集

末次給藥結(jié)束后,禁食12h,麻醉大鼠,采集腹主動(dòng)脈全血,離心后,保留血清備用。采血結(jié)束后,處死大鼠,剝離胎盤(pán)組織,凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 血糖指標(biāo)檢測(cè)

取保存的血清,利用血糖儀測(cè)定空腹血糖(FBG)水平和放射免疫法測(cè)定空腹胰島素(fasting insulin,FINS)水平。

1.3.4 血脂指標(biāo)檢測(cè)

取保存的血清,利用全自動(dòng)生化儀測(cè)定甘油三酯(triglyceride,TG)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)。脂代謝相關(guān)酶,即肝酯酶(hepatic lipase,HL)和脂蛋白酯酶(lipoprotein lipase,LPL)檢測(cè)采用ELISA法。

1.3.5 血清炎癥因子檢測(cè)

取保存的血清,根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定血清中TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-4水平。

1.3.6 氧化應(yīng)激因子檢測(cè)

取保存的血清,使用各因子對(duì)應(yīng)的試劑盒,按照微量法檢測(cè)MDA、SOD、GSH-Px、CAT水平。

1.3.7 Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)

取保存的胎盤(pán)組織剪碎,液氮研磨后,加入RIPA裂解液,反應(yīng)一段時(shí)間后,離心收集上清,測(cè)定總蛋白含量。取30μg蛋白上樣,進(jìn)行SDS-PAGE電泳,電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素酶膜,脫脂牛奶封閉后,洗膜加入一抗PPARγ(1∶1 000)、TLR4(1∶1 000)、MyD88(1∶1 000)、p-NF-κB p65(1∶1 000)、NF-κB p65(1∶1 000)、內(nèi)參β-actin(1∶5 000),4℃孵育過(guò)夜,洗膜,加入二抗(1∶2 000),室溫孵育2h后,PBS緩沖液清洗,加入ECL顯色,各蛋白與內(nèi)參的條帶灰度比值為蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 UA對(duì)大鼠血糖和胰島素水平的影響

與NC組比較,GDM組大鼠FBG水平升高,FINS水平下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與GDM組比較,UA-M、H組與二甲雙胍組大鼠FBG水平均下降,FINS水平升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。UA-L組與GDM組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),二甲雙胍組與UA-H組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血糖和胰島素水平比較

2.2 UA對(duì)大鼠血脂水平的影響

與NC組比較,GDM組大鼠TG、TC、LDL-C水平升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與GDM組比較,UA-M、H組與二甲雙胍組大鼠TG、TC、LDL-C水平均下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。UA-L組與GDM組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),二甲雙胍組與UA-H組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),各組HDL-C水平差異性比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血脂水平比較

2.3 UA對(duì)大鼠脂代謝酶水平的影響

與NC組比較,GDM組大鼠HL、LPL水平下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與GDM組比較,UA-M、H組與二甲雙胍組大鼠HL、LPL水平升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。UA-L組與GDM組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),二甲雙胍組與UA-H組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠脂代謝酶水平比較

2.4 UA對(duì)大鼠血清炎性因子水平的影響

與NC組比較,GDM組大鼠TNF-α、IL-2、IL-1β水平上升,IL-4水平下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與GDM組比較,二甲雙胍組與UA-L、M、H組大鼠TNF-α、IL-2、IL-1β水平下降,IL-4水平上升,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。二甲雙胍組與UA-H組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠血清炎性因子水平比較

2.5 UA對(duì)大鼠氧化應(yīng)激水平的影響

與NC組比較,GDM組大鼠MDA水平上升,SOD、GSH-Px、CAT水平下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與GDM組比較,二甲雙胍組與UA-L、M、H組大鼠MDA水平下降,SOD、GSH-Px、CAT水平升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。二甲雙胍組與UA-H組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表5。

表5 各組大鼠氧化應(yīng)激因子水平比較

2.6 UA對(duì)大鼠PPARγ及TLR4/MyD88/NF-κB通路蛋白表達(dá)水平的影響

大鼠PPARγ及TLR4/MyD88/NF-κB通路蛋白條帶,見(jiàn)圖1。與NC組比較,GDM組大鼠PPARγ蛋白表達(dá)下降,TLR4、MyD88、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表達(dá)上升,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與GDM組比較,二甲雙胍組與UA-L、M、H組大鼠PPARγ蛋白表達(dá)上升,TLR4、MyD88、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表達(dá)下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。二甲雙胍組與UA-H組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表6。

圖1 大鼠PPARγ及TLR4/MyD88/NF-κB通路蛋白條帶

表6 各組大鼠PPARγ及TLR4/MyD88/NF-κB通路蛋白水平比較

3 討論

3.1 GDM與UA

GDM和2型糖尿病具有一定的關(guān)聯(lián)性,許多研究認(rèn)為患有GDM的女性未來(lái)患2型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)升高,并且它也是孕婦及其后代未來(lái)患上代謝綜合征、心血管疾病、惡性腫瘤、眼科、精神和腎臟疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[9],因此研究GDM的發(fā)病機(jī)制,尋找治療藥物具有重大臨床意義。目前關(guān)于GDM的病理學(xué)機(jī)制尚不明確,主要與胰島素水平降低、胰島素抵抗、代謝紊亂相關(guān)[10]。研究表明UA可以顯著改善糖尿病大鼠的肥胖、胰島素抵抗、血脂水平,降低炎性細(xì)胞因子表達(dá)[11],提示UA具有抗炎特性和調(diào)節(jié)糖脂代謝的潛力。

3.2 UA與糖脂代謝

LPL是一種可以水解TG脂蛋白的脂肪酶,介導(dǎo)TG在組織中的傳遞。HL是肝脂肪酶,LPL可通過(guò)HL作為配體,促進(jìn)肝細(xì)胞攝取膽固醇,降低血漿中TC和TG濃度,發(fā)揮調(diào)節(jié)機(jī)體脂質(zhì)代謝的作用[12]。本研究利用高脂高糖飼料喂養(yǎng)并且注射STZ的方式建立GDM大鼠模型,研究結(jié)果顯示GDM組血糖和血脂水平顯著高于模型組,胰島素水平顯著下降,脂代謝酶LPL和HL活性也顯著下降,出現(xiàn)糖脂代謝紊亂現(xiàn)象,說(shuō)明造模成功。經(jīng)過(guò)UA處理后血糖、血脂水平顯著下降,胰島素水平顯著上升,LPL和HL活性顯著上升,提示UA可以改善GDM大鼠的糖脂代謝紊亂現(xiàn)象。

3.3 UA與炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激

母體患妊娠糖尿病會(huì)對(duì)胎盤(pán)產(chǎn)生很多不良影響,胎盤(pán)暴露于GDM產(chǎn)生的炎癥和氧化應(yīng)激環(huán)境中,影響胎盤(pán)發(fā)育,可能導(dǎo)致胎兒后期生長(zhǎng)發(fā)育異常以及代謝和心血管異常[13]。因此改善炎癥和氧化應(yīng)激狀態(tài)對(duì)于治療GDM具有重要意義。GDM的發(fā)生發(fā)展伴隨著全身炎癥,臨床體現(xiàn)在血清細(xì)胞因子的變化,TNF-α、IL-2、IL-1β等。促炎細(xì)胞因子大量釋放會(huì)使炎性細(xì)胞生成,進(jìn)而促進(jìn)炎性因子釋放,導(dǎo)致胰島素微循環(huán)障礙,引起胰島素抵抗。炎性因子的刺激還會(huì)導(dǎo)致過(guò)量ROS產(chǎn)生,導(dǎo)致患者肝臟,胰腺和大腦損傷,具體為脂質(zhì)過(guò)氧化物質(zhì)MDA過(guò)量生成,消耗具有抗氧化和清除自由基能力的SOD、GSH-Px、CAT,導(dǎo)致機(jī)體抗氧化體系失衡,產(chǎn)生氧化應(yīng)激[14]。本研究結(jié)果中,GDM組大鼠促炎因子TNF-α、IL-2、IL-1β水平上升,抗炎因子IL-4水平下降,且過(guò)氧化物MDA含量上升,抗氧化酶SOD、GSH-Px、CAT水平下降,與前人研究一致[14]。經(jīng)過(guò)UA處理后,促炎細(xì)胞因子水平下降,抗炎因子水平上升,并且抗氧化酶活性也顯著上升,說(shuō)明UA發(fā)揮了抗炎和抗氧化作用。

3.2 UA與PPARγ及TLR4/MyD88/NF-κB通路

胎盤(pán)在妊娠期大鼠母體內(nèi)發(fā)揮重要的物質(zhì)傳遞和轉(zhuǎn)換作用,其中PPARγ在胎盤(pán)中可以促進(jìn)脂肪酸攝取、甘油三酯的形成和脂滴的儲(chǔ)存,從而增加胰島素敏感性和葡萄糖代謝,對(duì)于糖脂代謝平衡具有重要作用,并且PPARγ還參與代謝紊亂疾病中的抗炎和抗氧化反應(yīng)[15]。有研究表明PPARγ通過(guò)TLR4/MyD88/NF-κB通路,調(diào)節(jié)脂多糖誘導(dǎo)的細(xì)胞炎性損傷和氧化應(yīng)激,主要途徑是上調(diào)PPARγ表達(dá),影響抗氧化平衡,抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路蛋白表達(dá),進(jìn)而抑制炎性細(xì)胞因子釋放和炎性細(xì)胞生成[16]。在本研究中,GDM大鼠PPARγ蛋白表達(dá)下調(diào),而TLR4/MyD88/NF-κB炎性通路蛋白上調(diào),同時(shí)機(jī)體炎性細(xì)胞因子大量釋放,并且出現(xiàn)高氧化應(yīng)激狀態(tài)。經(jīng)過(guò)UA處理后,UA各組大鼠PPARγ蛋白表達(dá)上調(diào),而TLR4/MyD88/NF-κB炎性通路蛋白下調(diào),同時(shí)機(jī)體炎性細(xì)胞因子水平降低,恢復(fù)氧化平衡,說(shuō)明了UA可以通過(guò)上調(diào)PPARγ表達(dá),抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路來(lái)發(fā)揮抗炎和抗氧化作用。

綜上所述,UA可能通過(guò)抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路表達(dá),同時(shí)在PPARγ蛋白的參與下,發(fā)揮對(duì)于GDM大鼠代謝紊亂、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激的改善作用。UA的抗炎和抗氧化機(jī)制較為復(fù)雜,是否涉及其他蛋白的參與,有待進(jìn)一步深入研究,以期為UA作為GDM的臨床藥物提供更為全面的理論參考。