不同香菇品種拮抗反應·ISSR標記與農藝性狀分析

張玉鐸 郭永杰 張東雷 徐凱

摘要 為區分常用香菇品種L808和申香215，以香菇武香一號為對照，對3個品種進行了拮抗試驗、ISSR分析和農藝性狀比較，結果表明：武香一號與L808和申香215拮抗反應明顯，L808與申香215品種間無明顯拮抗反應；在農藝性狀比較方面，同一栽培條件下，品種L808和申香215在形狀、顏色性狀上無明顯區別，但是在菌絲體長速、生長發育各個階段時間節點、子實體大小、單菇重、生物學效率等性狀上存在明顯差異；在ISSR分子標記中申香215和L808存在特異性條帶，能夠有效區分2個品種。

關鍵詞 香菇；品種比較；拮抗反應；分子標記

中圖分類號 S646 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2024）02-0040-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.02.009

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Analysis of Antagonistic Reaction， ISSR Marker and Agronomic Traits of Different Lentinus edodes Varieties

ZHANG Yu-duo， GUO Yong-jie， ZHANG Dong-lei et al

（Fangshan District Extension Station of Planting Technology， Beijing 102446）

Abstract In order to distinguish the commonly used Lentinus edodes varieties L808 and Shenxiang 215 in Fangshan， Beijing area， the strain Wuxiang 1 was used as check cultivars， the antagonism test， ISSR analysis ， and agronomic traits comparison of the 3 varieties were carried out. The results showed that the antagonism reaction was obviously existed between the strain Wuxiang 1 and L808，similarly existed between Wuxiang 1 and Shenxiang 215， but there was no antagonism reaction between the strain L808 and Shenxiang 215. In agronomic traits comparison experiments， under the same cultivation conditions， there was no significant difference in fruit body shape and color traits between L808 and Shenxiang 215， but there were significant differences in agronomic traits such as mycelium growth speed， growth time in each development stage， fruit body size， single fruit body weight， biological efficiency etc. There were specific amplification bands in strain L808 and Shenxiang 215 by ISSR molecular marker analysis， which could effectively distinguish them.

Key words Lentinus edodes;Variety comparison;Antagonistic reaction;Molecular marker

作者簡介 張玉鐸（1982—），男，河北威縣人，高級農藝師，碩士，從事食用菌栽培技術研究推廣和遺傳育種工作。

收稿日期 2023-01-29

香菇（Lentinus edodes（Berk.）Sing.）是我國栽培歷史最長、栽培規模最大的食用菌之一，由于其肉質細嫩，味道鮮美，風味獨特，而且含有豐富的蛋白質、氨基酸、香菇多糖、礦物質元素及多種維生素等，深受消費者歡迎。香菇是房山區第二大設施食用菌栽培種類，也是林下食用菌主栽種類，在帶動農村勞動就業、發展林下經濟及保證市場供應中具有舉足輕重的作用。

香菇L808是麗水市大山菇業研究開發有限公司選育品種，申香215是上海農業科學院選育品種，近幾年作為北京房山區秋冬季日光溫室栽培和高海拔山區夏秋季林下拱棚栽培的常用品種，其菇型好，質地優，產量高，但是這2個品種在子實體顏色、形態特征上比較相似，容易混淆。付顯鋒從菌絲長速和子實體農藝性狀方面對2個品種進行了對比試驗，申香215單朵鮮菇重量和菌蓋更大，菌蓋更厚，菌柄更粗短。但是，在食用菌種質資源遺傳多樣性研究中，子實體表型標記，易受到環境等客觀因素及檢測者的主觀因素影響。DNA分子標記則不受外界環境和生長階段限制，對品種的識別明顯高于形態學和生理生化指標，且操作簡便，特異性好，準確性高。目前對這2個品種分子標記研究鮮見報道。ISSR是由加拿大蒙特利爾大學Zietkiewicz等于1994年創建的一種分子標記技術，具有很好的穩定性、多態性和重復性，且有操作簡便、安全，成本低等特點。ISSR標記技術在食用菌品種鑒定和遺傳多樣性分析方面得到廣泛的應用。筆者以武香一號為對照，通過拮抗試驗、農藝性狀比較和ISSR分析，對這2個品種做了系統鑒別，明確了兩者的特征與區別，也為栽培管理過程中如轉色、催菇等時間節點的掌控提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株。L808來源于江蘇省高郵市食用菌研究所，申香215來源于上海農業科學院，武香一號來源于北京市農林科學院。

1.1.2 儀器、試劑及其來源。

PCR儀（Eppendorf Mastercycler Gradient）、凝膠成像系統（Bio-Rad）、紫外可見分光光度計（LabtechUV9100）、電泳儀（北京六一DYY-Ⅲ-12B）、電子分析天平（奧豪斯）、臺式高速冷凍離心機（Eppendorf 5415R）、移液器（Eppendorf）等。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂粉（BD difco）、蛋白胨（OXIOD）、磷酸二氫鉀、硫酸鎂等化學試劑均為分析純試劑，購自國藥集團北京化學試劑公司；DNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN，德國）。2×Taq PCR MasterMix購自北京艾德萊生物科技有限公司；瓊脂糖購自西班牙Biowest公司；所有引物由上海生工生物公司（Sangon）合成。

硬雜木屑購自承德；輕質碳酸鈣生產廠家為靈壽縣江晨礦產品加工廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 拮抗試驗。

將3個品種母種轉接到同一個PDA平皿上，接種塊大小3 mm×3 mm×3 mm，呈三角形接種，接種塊間距3 cm，3次重復，置于25 ℃條件下培養，觀察其生長和拮抗情況。

1.2.2 栽培試驗。

試驗設計：試驗品種L808和申香215，對照武香一號，單因素隨機區組試驗，3次重復，每處理300棒。

栽培料配方：硬雜木屑82%，麥麩16%，輕質碳酸鈣2%，含水量52%。

栽培方法：日光溫室熟料栽培，采用15.000 cm×55.000 cm×0.005 cm聚乙烯折角塑料袋，每袋濕料重2.0 kg，折合干料重0.96 kg，常壓滅菌方式進行滅菌，日光溫室內搭建接種帳進行無菌操作接種，就地培養，接種7 d后，去掉外套袋，倒垛并進行井字形擺放。整個發菌期間設施內溫度在20～26 ℃，菌絲生理成熟后打孔通氧一次，轉色完成脫袋出菇，靠背人字形擺放，按照常規出菇管理方式進行出菇管理，共注水3次，整個出菇期設施內溫度在6～25 ℃。

1.2.3 數據測定與記錄。每個品種每個處理隨機選取 50 個栽培袋測定以下指標。

菌絲長速測定：接種10 d后，在接種口菌絲生長末端劃線做記號，10 d后再次在菌絲生長末端劃線做記號，測量2條線之間的長度，計算菌絲日均生長速率。

菌絲滿袋時間：當所有接種塊連接，菌絲布整個菌袋時，記錄時間，計算從接種到滿袋的時間。

起瘤時間：當90%接種口周圍開始起瘤，記錄時間，計算從接種到起瘤的時間。

生理成熟時間：60%菌棒開始出現褐色斑點或斑塊，記錄時間，計算從接種到生理成熟時間。

轉色完成時間：當全部菌棒表面由白色轉為紅褐色，形成一層紅褐色有韌性的菌膜時，轉色結束，記錄時間，計算從接種到轉色結束的時間。

原基形成時間：當90%菌棒表面出現原基時，記錄時間，計算從接種到原基形成的時間。

子實體形態特性測定：第1潮菇第1次采收，每處理隨機抽取50個子實體，觀察記錄形態、顏色，測量菌蓋直徑、菌蓋厚度、菌柄長度、菌柄粗度。

單菇重統計：統計前二潮菇單菇重，每個處理隨機抽取50個子實體稱重，計算單菇重。

生物學效率：測定每個處理四潮菇總產量。

生物學效率=鮮菇產量/原料干重=每個處理總產量（kg）/（300棒×0.96 kg）×100%

數據統計分析：對試驗所得數據采用SPSS 20.0軟件LSD法進行統計分析。

1.2.4 ISSR分子標記。

1.2.4.1 菌絲生長供試培養基。

綜合PDA培養基：馬鈴薯200.0 g，瓊脂20.0 g，葡萄糖20.0 g，蛋白胨5.0 g，KHPO 3.0 g，MgSO 1.5 g，V10 mg，水1 L。

1.2.4.2 DNA提取。

分別刮取平皿上的申香215、武香一號、L808菌絲100 μg左右于1.5 mL的離心管中，加入2種大小的氧化鋯珠子各1～2勺，加400 μL AP1，放在破碎儀內5 min，破碎后使用DNeasy Plant Mini Kit提取試劑盒提取樣品DNA。

1.2.4.3 引物。

所用引物由上海生工（Sangon）合成，具體引物編號對應的序列見表1。

1.2.4.4 ISSR擴增。

采用25 μL擴增體系：1.0 μL模板（含25～50 ng DNA），2.5 μL 10×buffer緩沖液，0.6 μL dNTP（10 mmol/L），1.0 μL Primer（10 μmol/L），0.3 μL Taq DNA Polymerase（5 U/μL），ddHO補至25 μL。

ISSR擴增反應程序：94 ℃預變性5 min；循環參數為94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，運行35個循環后，72 ℃終延伸10 min。SRAP程序：94 ℃預變性5 min；第1個循環參數為94 ℃變性1 min，35 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，運行5個循環；第2次循環參數為94 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃終延伸1.5 min，運行35個循環，72 ℃終延伸10 min。

1.2.4.5 瓊脂糖凝膠電泳。

取10 μL反應產物，加入含有2% SYBR Safe DNA gel staid（invitrogen）的瓊脂糖凝膠中，在120 U電壓下進行電泳40 min，并置于紫外凝膠成像系統上觀察并拍照記錄。

1.2.5 數據統計。以上試驗每個引物3次重復，以保證數據采集和分析的準確性。

2 結果與分析

2.1 拮抗試驗

3個品種拮抗試驗結果見圖1、2，平板正反面可見武香一號與L808和申香215均產生了明顯的溝型拮抗線，拮抗反應明顯。L808和申香215平板正反面未出現明顯的隆起型、溝型或者隔離型拮抗反應形態類型和色素帶，拮抗反應不明顯，需要從農藝性狀和分子水平上進一步進行比較鑒定。

2.2 農藝性狀比較

2.2.1 栽培袋菌絲體階段菌絲長速和各階段時間節點。

3個品種菌絲體階段長速和各階段時間節點見表2，在菌絲長速方面，3個品種表現出顯著差異，對照品種武香一號介于L808和申香215之間，長速最快的品種是L808，平均2.18 mm/d，最慢的品種是申香215，均值為1.91 mm/d。在菌絲滿袋時間上3個品種與菌絲長速表現一致。在表面起瘤、生理成熟、轉色完成、原基形成等每個節點時間上，武香一號都表現出了早熟特性，每個節點用時都快于L808和申香215。品種L808和申香215相比，每個節點L808都比申香215所需時間短。從該試驗看，品種L808從播種到原基形成的時間為101 d，申香215為113 d，兩者差異最大的階段是轉色完成所需時間，品種L808從生理成熟到轉色完成所需時間為33 d，申香215所需時間為41 d，相差8 d，其次是菌絲滿袋時間，品種L808比申香215提前5 d，其他階段差異不大。

2.2.2 子實體形態特性。

3個品種子實體形態特性見表3，對照品種武香一號在形態上與L808和申香215表現出明顯區別，形狀不同，顏色不同，子實體偏小，肉薄，柄細長。品種L808和申香215在形狀和菌蓋顏色方面差異不大，難以進行區分，但是在個體大小上兩者差異比較明顯，品種申香215在菌蓋直徑、菌蓋厚度、菌柄長度、菌柄直徑方面平均數值均大于品種L808，尤其是菌蓋直徑，申香215比L808大17.89%。

2.2.3 產量性狀比較。

3個品種產量性狀見表4，從子實體單重上比較，3個品種間差異明顯，并且3個品種一潮菇和二潮菇單菇重順序一致，均表現為申香215＞L808＞武香一號。對照品種武香一號一潮菇和二潮菇單菇重均值分別為21.34和17.42 g，顯著輕于L808和申香215。申香215一潮菇和二潮菇單菇重均值分別為68.87和43.57 g，一潮菇平均單菇重比L808重77.36%，二潮菇平均單菇重比L808重47.40%，二者間差異顯著。在生物學效率上，表現為L808＞申香215＞武香一號，分別為98.65%、91.96%和76.14%，品種L808和申香215間生物學效率差異顯著，且均顯著高于對照品種武香一號。

2.3 ISSR分子標記分析

以武香一號為對照，從DNA水平上分析品種L808和申香215的種質遺傳差異性，分別提取了武香一號、申香215和L808基因組DNA，利用20個UBC-ISSR引物對其進行PCR擴增，結果顯示，對照品種武香一號在20個引物PCR擴增圖譜中，與L808和申香215均存在特異性條帶。經篩選發現，品種L808和申香215有4個引物（圖3～6），且擴增圖譜呈現明顯的多態性，存在特異性條帶，說明這2個品種在DNA水平上存在差異。

3 結論與討論

拮抗反應可作為食用菌種內鑒別菌株異同的重要標志，被廣泛應用于品種比較或者鑒別試驗中，但是拮抗反應有無的判斷需要更多的觀察經驗，存在一定的主觀因素。在進行品種區別鑒定時，菌株之間無拮抗反應或拮抗反應極不明顯，并不能確定是同一菌株。該試驗中，品種L808和申香215未產生明顯的拮抗反應，難以對這2個品種進行有效區分。因此，筆者利用農藝性狀比較和ISSR分析進行了進一步鑒別。

在農藝性狀比較中，在同一栽培條件下，栽培袋菌絲長速上，品種L808顯著快于申香215，品種L808和申香215在子實體形狀、顏色性狀上無明顯區別，但是在子實體大小、單菇重、生物學效率等數量性狀上都產生了明顯差異，其中在子實體大小和單菇重方面與付顯鋒的研究結果一致。申香215都表現出了個體大的特征，這2個性狀在一定程度上能夠區分2個品種，并能夠為從業人員在品種選擇時提供參考。

品種L808和申香215菌絲體生長發育各個階段時間節點比較表明，品種L808播種至原基形成所用的時間比申香215短12 d，其中，從生理成熟到轉色完成，L808所需時間比申香215少8 d，差異明顯，這不僅能夠科學區分2個品種，而且可以為香菇精準化管理提供科學依據。在栽培中可以根據2個品種的轉色完成時間特點進行差異化管理，科學準時地進入出菇階段，有效避免轉色不完全或者過度轉色情況發生，對提高產量和品質提供保障，因為菌棒轉色的好壞直接影響香菇生產的質量和產量。

在ISSR分子標記試驗中，有4個引物的擴增圖譜有明顯的多態性，L808和申香215品種間存在特異性條帶，表明2個品種現在DNA水平上存在差異，ISSR分子標記能夠對這2個品種進行有效區分。申香215是通過L808優良子實體經組織分離系統篩選得到的一個出菇穩產高產的優異菌株。在選擇育種工作中，最有效和最常用的方法之一是子實體組織分離法，該方法所獲得的純培養遺傳性狀穩定、變異小，為了明確原始品種和選育品種的差異，可以結合生理生化特征和農藝形狀特征，進一步在DNA水平上進行鑒別。據秦蓮花等研究報道，Qingke20和939均是從菌株9015中選育出的，L241-4 是從 L241中選育出的，經ITS、ISSR、RAPD、SRAP等方法進行分析，結果表明，原始品種與分離獲得的品種的親緣關系都比較近，同一原始菌株獲得的不同后代（Qingke20和939）親緣關系也比較近，但是也都存在特異性條帶，能夠進行有效區分。筆者結合農藝性狀、拮抗試驗，采用分子標記也獲得了類似的結論，為品種選擇、栽培管理中諸如轉色、催菇等時間節點的掌控提供了科學依據。

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