GW501516對(duì)低氧致肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響及機(jī)制 Δ

陳昌貴，易春峰，余志華，王 棟，李立為，賀立群 （武漢市第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，武漢 430022）

低氧性肺動(dòng)脈高壓（hypoxic pulmonary hypertension，HPH）是低氧所致的肺動(dòng)脈高壓，屬于肺動(dòng)脈高壓的第三大類。持續(xù)的低氧可引起肺血管重構(gòu)，進(jìn)而導(dǎo)致HPH，長期過高的肺動(dòng)脈壓力會(huì)誘發(fā)患者出現(xiàn)難以控制的右心衰竭而死亡。肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（pulmonary artery endothelial cells，PAECs）在低氧肺血管重構(gòu)中起至關(guān)重要的作用，一旦PAECs 發(fā)生損傷，肺血管重構(gòu)過程即同步啟動(dòng)，表現(xiàn)為血管收縮與舒張功能紊亂、肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞異常遷移與增殖、細(xì)胞外基質(zhì)合成增加，最終導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓[1]。此外低氧還可誘導(dǎo)PAECs產(chǎn)生氧化應(yīng)激，進(jìn)而損傷PAECs，導(dǎo)致低氧肺血管重構(gòu)和HPH[1]。因此，具有逆轉(zhuǎn)低氧致PAECs 損傷作用的藥物，可能會(huì)改善低氧肺血管重構(gòu)。

過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator-activated receptors，PPARs）是一種核受體，在配體激活時(shí)充當(dāng)轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄，包含PPARα、PPARγ和PPARδ 3種亞型。既往研究發(fā)現(xiàn)，PPARδ具有抑制炎癥反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激、改善內(nèi)皮細(xì)胞功能、抗動(dòng)脈粥樣硬化等作用[2]。GW501516 是一種人工合成的PPARδ 激動(dòng)劑，已被用于治療肥胖癥、脂質(zhì)紊亂和心血管疾病。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，每天以3 mg/kg GW501516 喂食低密度脂蛋白受體基因敲除小鼠，可減輕小鼠高脂飲食誘導(dǎo)的血管重構(gòu)[3]；體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，GW501516能夠改善內(nèi)皮細(xì)胞功能[4]。活性氧（reactive oxygen species，ROS）是參與氧化應(yīng)激的主要分子之一，在血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞肥大模型中，GW501516可抑制血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生ROS[5]。由此推測(cè)GW501516可能通過抑制氧化應(yīng)激，保護(hù)PAECs，從而在低氧肺血管重構(gòu)中發(fā)揮保護(hù)作用。因此，本研究從GW501516 調(diào)控氧化應(yīng)激的角度探討了其對(duì)低氧致PAECs損傷的影響及機(jī)制，以期為GW501516用于臨床治療HPH提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究使用的主要儀器包括Dmil Led 型倒置熒光顯微鏡（德國Leica 公司）、3131 型和311 型細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）、Synergy HT型多功能酶標(biāo)儀（美國Bio-Tek 公司）、NovoCyte 型流式細(xì)胞儀（美國ACEA Biosciences 公司）、ChemiDoc XRS 型化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

1.2 主要藥品與試劑

GW501516（批號(hào)SML1491）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（批號(hào)D2625）、抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）（批號(hào)A0150000）均購自美國Sigma-Aldrich 公司，純度均≥98%；核因子E2 相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）激活劑富馬酸二甲酯（dimethyl fumarate，DMF）（批號(hào)S2586）、Nrf2 抑制劑ML385（批號(hào)S8790）均購自美國Selleck 生物科技有限公司，純度均≥99%；CCK-8 試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所；Annexin Ⅴ-FITC/PI 凋亡檢測(cè)試劑盒（批號(hào)556547）購自美國BD 公司；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）（批號(hào)C0017）、ROS（批號(hào)S0033S）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）（批號(hào)S0101S）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）（批號(hào)S0058）、過氧化氫酶（catalase，CAT）（批號(hào)S0051）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）（批號(hào)S0131S）檢測(cè)試劑盒、BCA 試劑盒（批號(hào)P0012S）、細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒（批號(hào)P0028）均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；兔源PPARδ（批號(hào)74076）、Nrf2（批號(hào)12721）、血紅素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1）（批號(hào)43966）、裂解型胱天蛋白酶3（cleaved-caspase-3，C-caspase-3）（批號(hào)9661）、核纖層蛋白B1（Lamin B1）（批號(hào)13435）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）（批號(hào)5174）等一抗均購自美國Cell Signaling Technology 公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗人IgG二抗（批號(hào)ab6858）購自英國Abcam公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

人PAECs 購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心，批號(hào)為GPC0037。

2 方法

2.1 GW501516對(duì)PAECs的細(xì)胞毒性檢測(cè)

2.1.1 實(shí)驗(yàn)分組與給藥

將細(xì)胞分為對(duì)照組和GW501516 組，對(duì)照組給予0.1%DMSO 孵育12、24、48 h，GW501516 組給予100 nmol/L GW501516[6]孵育12、24、48 h。

2.1.2 PAECs相對(duì)存活率的檢測(cè)

采用CCK-8 試劑盒檢測(cè)細(xì)胞相對(duì)存活率，評(píng)估GW501516 的細(xì)胞毒性。細(xì)胞以5×103個(gè)/孔均勻接種于96孔板，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。按“2.1.1”項(xiàng)下方法分組及給藥后，按照試劑盒說明書加入CCK-8 溶液，同時(shí)設(shè)置空白組（培養(yǎng)基 100 μL+CCK-8 溶液 10 μL），繼續(xù)孵育3 h 后于450 nm 波長處測(cè)定吸光度（OD）值。細(xì)胞的相對(duì)存活率＝（實(shí)驗(yàn)組OD－空白組OD）/（對(duì)照組OD－空白組OD）×100%。

2.2 低氧條件下PAECs 中PPARδ 蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)

2.2.1 實(shí)驗(yàn)分組與給藥

將細(xì)胞分為對(duì)照組（常氧+0.1%DMSO）、低氧組（低氧+0.1%DMSO）、GW501516 干預(yù)組（低氧+100 nmol/L GW501516），低氧刺激時(shí)間為24 h。低氧刺激前1 h 用GW501516 孵育PAECs，當(dāng)PAECs 融合度達(dá)到80%～90%時(shí)，1∶2 傳代培養(yǎng)。各組細(xì)胞在低氧刺激前用不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h使細(xì)胞同步化。模擬低氧條件為含1%O2、5%CO2和94%N2的空氣，模擬常氧為含5%CO2的空氣（下同）。

2.2.2 PAECs中PPARδ蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)

采用Western blot 法檢測(cè)PPARδ 蛋白的表達(dá)水平。細(xì)胞以1.5×105個(gè)/孔均勻接種于6 孔板，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。按“2.2.1”項(xiàng)下方法分組及給藥后，使用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白，通過BCA 試劑盒檢測(cè)細(xì)胞總蛋白濃度。采用沸水浴滅活蛋白，上樣前將各組細(xì)胞蛋白稀釋成相同濃度，每個(gè)樣本取15 μg總蛋白加樣，并用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，再轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜中，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST 緩沖液洗膜，接著加入PPARδ、GAPDH 一抗（稀釋比分別為1∶1 000、1∶5 000），4 °C 孵育過夜；洗膜后加入二抗（稀釋比為1∶10 000），然后于室溫下孵育1 h，TBST 緩沖液洗膜后，滴加ECL混合溶液，暗室中曝光，測(cè)定蛋白條帶灰度值。以PPARδ 和GAPDH 條帶灰度值的比值表示PPARδ蛋白的表達(dá)水平。

2.3 低氧條件下PAECs 的凋亡率、細(xì)胞活力、LDH 活性和ROS水平的檢測(cè)

2.3.1 實(shí)驗(yàn)分組與給藥

將細(xì)胞分為對(duì)照組（常氧+0.1%DMSO）、低氧組（低氧+0.1%DMSO）、NAC 干預(yù)組（陽性對(duì)照，低氧+10 mmol/L NAC[7]）、GW501516 干預(yù)組（低氧+100 nmol/L GW501516）。各藥物干預(yù)組在低氧刺激前1 h給予不同藥物孵育PAECs，低氧刺激時(shí)間為24 h。

2.3.2 細(xì)胞凋亡率的檢測(cè)

采用Annexin Ⅴ-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒聯(lián)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。細(xì)胞以1.5×105個(gè)/孔均勻接種于6 孔板，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。按“2.3.1”項(xiàng)下方法分組及給藥后，以胰酶消化收集細(xì)胞，取約1×106個(gè)細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌后，依次加入PBS 200 μL、Annexin Ⅴ-FITC 10 μL 和PI 10 μL 重懸細(xì)胞，4 ℃避光孵育30 min后加入PBS 200 μL，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，使用NovoExpress軟件分析數(shù)據(jù)。

2.3.3 細(xì)胞活力的檢測(cè)

采用CCK-8 試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活力。細(xì)胞以5×103個(gè)/孔均勻接種于96孔板，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。按“2.3.1”項(xiàng)下方法分組及給藥后，按“2.1.2”項(xiàng)下方法操作，檢測(cè)細(xì)胞存活率。

2.3.4 LDH活性的檢測(cè)

使用LDH檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞中LDH活性。細(xì)胞以5×103個(gè)/孔均勻接種于96孔板，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。按“2.3.1”項(xiàng)下方法分組及給藥后，每孔加入LDH 釋放液10 μL，孵育1 h后以400×g 離心5 min，取上清液，按試劑盒說明書加入LDH 檢測(cè)液后，于450 nm 波長處測(cè)定OD，檢測(cè)LDH活性。

2.3.5 ROS水平的檢測(cè)

采用二乙酰二氯氫化熒光素（DCFH-DA）探針聯(lián)合熒光酶標(biāo)儀測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS水平。細(xì)胞以3×104個(gè)/孔均勻接種于24孔板，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。按“2.3.1”項(xiàng)下方法分組及給藥后，吸出培養(yǎng)基，加入10 μmol/L無血清培養(yǎng)基稀釋的DCFH-DA，37 ℃孵育20 min后將培養(yǎng)基吸出，PBS 洗滌3 次后，置于熒光酶標(biāo)儀（激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為525 nm）下檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平。

2.4 GW501516對(duì)低氧致PAECs損傷的作用機(jī)制研究

2.4.1 實(shí)驗(yàn)分組與給藥

將細(xì)胞分為對(duì)照組（常氧+0.1%DMSO）、低氧組（低氧+0.1%DMSO）、DMF 干預(yù)組（陽性對(duì)照，低氧+75 μmol/L DMF[8]）、GW501516 干預(yù)組（低氧+100 nmol/L GW501516）、GW501516+ML385 干預(yù)組（低氧+100 nmol/L GW501516+5 μmol/L ML385[9]）。各藥物干預(yù)組在低氧刺激前1 h 給予不同藥物孵育PAECs，低氧刺激時(shí)間為24 h。

2.4.2 PAECs中HO-1蛋白和細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)

采用Western blot 法檢測(cè)HO-1 蛋白和Nrf2 蛋白的表達(dá)水平。細(xì)胞以1.5×105個(gè)/孔均勻接種于6 孔板，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。按“2.4.1”項(xiàng)下方法分組及給藥后，使用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白，使用細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒提取細(xì)胞核蛋白。按“2.2.2”項(xiàng)下方法檢測(cè)HO-1蛋白和Nrf2蛋白的表達(dá)水平，HO-1、Nrf2、Lamin B1 和GAPDH 的稀釋比例分別為1∶1 000、1∶1 000、1∶2 000、1∶5 000，以HO-1蛋白與GAPDH蛋白的灰度值比值表示HO-1 蛋白的表達(dá)水平，以Nrf2 蛋白與Lamin B1 蛋白的灰度值比值表示Nrf2 蛋白的表達(dá)水平。

2.4.3 PAECs 中SOD、GPx、CAT、MDA、ROS 水平的檢測(cè)

采用ELISA 法檢測(cè)PAECs 中SOD、GPx、CAT、MDA水平；采用DCFH-DA探針聯(lián)合熒光酶標(biāo)儀測(cè)定細(xì)胞中ROS 水平。細(xì)胞以1.5×105個(gè)/孔均勻接種于6 孔板，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。按“2.4.1”項(xiàng)下方法分組及給藥后，按試劑盒說明書檢測(cè)PAECs 中SOD、GPx、CAT、MDA水平；細(xì)胞中ROS水平的檢測(cè)方法同“2.3.5”。

2.4.4 PAECs 的凋亡率、細(xì)胞活力、LDH 活性和Ccaspase-3蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)

按“2.4.1”項(xiàng)下方法分組及給藥后，按“2.3.2”項(xiàng)下方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；按“2.1.2”項(xiàng)下方法檢測(cè)細(xì)胞活力；按“2.3.4”項(xiàng)下方法檢測(cè)LDH 活性；按“2.2.2”項(xiàng)下方法檢測(cè)C-caspase-3 蛋白表達(dá)水平，其中C-caspase-3 一抗稀釋比例為1∶1 000，以C-caspase-3與GAPDH條帶灰度值的比值表示C-caspase-3蛋白的表達(dá)水平。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 GW501516對(duì)PAECs的細(xì)胞毒性

GW501516 組PAECs 孵育12、24、48 h 后的細(xì)胞相對(duì)存活率[（98.37±2.14）%、（102.10±4.61）%、（103.24±3.66）%]與對(duì)照組PAECs孵育12、24、48 h后的細(xì)胞相對(duì)存活率[（100.00±2.68）%、（100.00±3.75）%、（100.00±4.23）%]比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3.2 低氧條件下GW501516 對(duì)PAECs 中PPARδ 蛋白表達(dá)水平的影響

與對(duì)照組比較，低氧組PAECs中PPARδ蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；與低氧組比較，GW501516 干預(yù)組PAECs 中PPARδ 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見圖1。

圖1 低氧條件下GW501516 對(duì)PAECs 中PPARδ 蛋白表達(dá)的影響

3.3 低氧條件下GW501516 對(duì)PAECs 的凋亡率、細(xì)胞活力、LDH活性和ROS水平的影響

與對(duì)照組比較，低氧組PAECs的凋亡率、LDH活性、ROS 水平均顯著升高（P＜0.05），細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.05）；與低氧組比較，NAC干預(yù)組和GW501516干預(yù)組細(xì)胞凋亡率、LDH活性、ROS水平均顯著降低（P＜0.05），細(xì)胞活力均顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見圖2、表1。

表1 低氧條件下PAECs 的凋亡率、細(xì)胞活力、LDH 活性和ROS水平的檢測(cè)結(jié)果（±s）

表1 低氧條件下PAECs 的凋亡率、細(xì)胞活力、LDH 活性和ROS水平的檢測(cè)結(jié)果（±s）

a：與對(duì)照組比較，P＜0.05；b：與低氧組比較，P＜0.05。

組別對(duì)照組低氧組NAC干預(yù)組GW501516干預(yù)組ROS水平（n＝6）1.00±0.15 8.85±0.96a 2.14±0.38b 3.81±0.27b細(xì)胞凋亡率（n＝3）/%6.03±1.34 20.42±4.47a 13.55±2.06b 11.37±1.85b細(xì)胞活力（n＝6）/%100.00±5.67 70.91±5.23a 85.13±4.25b 88.86±5.92b LDH活性（n＝6）1.00±0.12 6.26±0.51a 3.32±0.23b 2.14±0.27b

圖2 各組細(xì)胞的凋亡流式圖

3.4 GW501516對(duì)低氧致PAECs損傷的作用機(jī)制

3.4.1 PAECs中HO-1蛋白和細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果

與對(duì)照組比較，低氧組PAECs 中HO-1 蛋白和細(xì)胞核內(nèi)Nrf2 蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）；與低氧組比較，DMF干預(yù)組和GW501516干預(yù)組PAECs中HO-1 蛋白和細(xì)胞核內(nèi)Nrf2 蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）；與GW501516 干預(yù)組比較，GW501516+ML385 干預(yù)組PAECs中HO-1蛋白和細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見圖3。

3.4.2 PAECs 中SOD、GPx、CAT、MDA、ROS 水平的檢測(cè)結(jié)果

與對(duì)照組比較，低氧組PAECs中SOD、GPx、CAT水平均顯著降低（P＜0.05），MDA、ROS 水平均顯著升高（P＜0.05）；與低氧組比較，DMF干預(yù)組和GW501516干預(yù)組PAECs 中SOD、GPx、CAT 水平均顯著升高（P＜0.05），MDA、ROS 水平均顯著降低（P＜0.05）；與GW501516 干預(yù)組比較，GW501516+ML385 干預(yù)組PAECs 中SOD、GPx、CAT 水平均顯著降低，MDA、ROS水平均顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見表2。

表2 PAECs 中SOD、GPx、CAT、MDA、ROS 水平的檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝6）

表2 PAECs 中SOD、GPx、CAT、MDA、ROS 水平的檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝6）

a：與對(duì)照組比較，P＜0.05；b：與低氧組比較，P＜0.05；c：與GW501516干預(yù)組比較，P＜0.05。

組別對(duì)照組低氧組DMF干預(yù)組GW501516干預(yù)組GW501516+ML385干預(yù)組SOD 1.00±0.08 0.48±0.05a 0.95±0.06b 0.87±0.07b 0.34±0.03c GPx 1.00±0.15 0.15±0.01a 0.76±0.05b 0.58±0.07b 0.12±0.02c CAT 1.00±0.09 0.30±0.04a 0.75±0.05b 0.94±0.10b 0.25±0.03c MDA 1.00±0.08 7.56±0.81a 2.38±0.38b 3.66±0.26b 6.15±0.52c ROS 1.00±0.12 7.62±0.56a 2.53±0.15b 2.79±0.11b 5.81±0.47c

3.4.3 PAECs 的凋亡率、細(xì)胞活力、LDH 活性和Ccaspase-3蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果

與對(duì)照組比較，低氧組PAECs的凋亡率、C-caspase-3蛋白表達(dá)水平、LDH活性均顯著升高，細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.05）；與低氧組比較，DMF干預(yù)組和GW501516干預(yù)組PAECs 的凋亡率、C-caspase-3 蛋白表達(dá)水平、LDH活性均顯著降低，細(xì)胞活力均顯著升高（P＜0.05）；與GW501516 干預(yù)組比較，GW501516+ML385 干預(yù)組PAECs 的凋亡率、C-caspase-3 蛋白表達(dá)水平、LDH 活性均顯著升高，細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見圖4、表3、圖5。

表3 機(jī)制研究中PAECs 的凋亡率、細(xì)胞活力、LDH 活性的檢測(cè)結(jié)果（±s）

表3 機(jī)制研究中PAECs 的凋亡率、細(xì)胞活力、LDH 活性的檢測(cè)結(jié)果（±s）

a：與對(duì)照組比較，P＜0.05；b：與低氧組比較，P＜0.05；c：與GW501516干預(yù)組比較，P＜0.05。

LDH活性（n＝6）1.00±0.09 8.65±0.81a 4.67±0.35b 3.26±0.51b 8.05±0.78c組別對(duì)照組低氧組DMF干預(yù)組GW501516干預(yù)組GW501516+ML385干預(yù)組細(xì)胞凋亡率（n＝3）/%4.69±0.82 21.55±3.13a 12.94±2.06b 9.24±1.86b 22.92±3.54c細(xì)胞活力（n＝6）/%100.00±6.06 73.85±4.58a 87.11±6.23b 84.86±5.82b 73.04±4.24c

圖4 機(jī)制研究中各組細(xì)胞的凋亡流式圖

圖5 GW501516 對(duì)低氧條件下PAECs 中C-caspase-3蛋白表達(dá)水平的影響

4 討論

低氧能夠誘導(dǎo)PAECs 損傷，使其凋亡增加，抑制PAECs 損傷和凋亡能夠逆轉(zhuǎn)HPH[1]。正常條件下LDH不能穿透細(xì)胞膜，但當(dāng)細(xì)胞受損或死亡后，LDH 可以釋放到細(xì)胞外，其釋放水平能夠反映細(xì)胞損傷程度[10]。caspase-3 是調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵介質(zhì)，可被外源性（死亡配體）和內(nèi)源性（線粒體）凋亡途徑激活，是最重要的胱天蛋白酶。caspase-3 激活后生成的C-caspase-3 是細(xì)胞凋亡的主要執(zhí)行者之一，亦是細(xì)胞凋亡的標(biāo)志蛋白[11]。研究發(fā)現(xiàn)，PPARδ合成型激動(dòng)劑L-165041能夠抑制H2O2誘導(dǎo)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，抑制其凋亡，而PPARδ的沉默逆轉(zhuǎn)了這種作用[2]。此外，PPARδ可通過激活磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B通路來抑制缺氧誘導(dǎo)的內(nèi)皮祖細(xì)胞凋亡[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，在低氧刺激下，PAECs 中PPARδ 蛋白表達(dá)水平降低，細(xì)胞凋亡率升高，C-caspase-3表達(dá)水平升高，細(xì)胞活力降低，LDH活性升高；而GW501516 可上調(diào)PPARδ 蛋白的表達(dá)，抑制低氧誘導(dǎo)的PAECs 損傷，且實(shí)驗(yàn)濃度的GW501516 對(duì)PAECs無明顯細(xì)胞毒性。因此，本課題組推測(cè)低氧通過抑制PPARδ蛋白表達(dá)來損傷內(nèi)皮細(xì)胞，GW501516則通過激活PPARδ來發(fā)揮保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的作用。

低氧能夠誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，導(dǎo)致PAECs 的損傷和凋亡，抑制氧化應(yīng)激可抑制PAECs 損傷及HPH 的形成[1,13―14]。有研究表明，PPARδ能夠抑制高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮功能障礙及ROS 的產(chǎn)生[15]。在動(dòng)脈粥樣硬化的動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)，PPARδ 可減少ROS 的產(chǎn)生，從而發(fā)揮保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的作用[16]。另有研究表明，GW501516 能夠通過抑制ROS 產(chǎn)生而抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞肥大[5]。本研究發(fā)現(xiàn)，GW501516 及NAC 均可抑制低氧誘導(dǎo)的PAECs損傷及ROS產(chǎn)生。因此，本課題組推測(cè)GW501516 可通過抑制氧化應(yīng)激來抑制低氧誘導(dǎo)的PAECs損傷。

Nrf2是一種參與氧化應(yīng)激的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，其在細(xì)胞核內(nèi)可與抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合，來促進(jìn)下游抗氧化酶或蛋白的表達(dá)，從而發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用。CAT、GPx、HO-1 和SOD 是Nrf2 通路下游的主要抗氧化酶。其中，HO-1 可降解血紅素，產(chǎn)生一氧化碳、亞鐵和膽綠素，而HO-1以及血紅素分解代謝產(chǎn)物均具有抗氧化作用，并能夠緩解肺血管重構(gòu)[17]；SOD可將超氧化自由基分解為H2O2，促進(jìn)氧自由基的清除，上調(diào)SOD活性，減輕肺血管重構(gòu)[18]；GPx可催化谷胱甘肽與H2O2或其他過氧化物的反應(yīng)，生成氧化型谷胱甘肽和H2O，從而消除ROS[11]；CAT 能催化H2O2生成H2O 與O2。氧化應(yīng)激能導(dǎo)致細(xì)胞脂質(zhì)過氧化，MDA是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，其水平與氧化應(yīng)激呈負(fù)相關(guān)。Nrf2 激活劑能夠通過上調(diào)肺動(dòng)脈組織內(nèi)SOD、HO-1 活性，降低MDA 及ROS 水平，抑制低氧誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，從而緩解大鼠低氧肺血管重構(gòu)[19]。在高糖誘導(dǎo)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激的細(xì)胞模型中發(fā)現(xiàn)，PPARδ 激動(dòng)劑GW0742 和L165041 可激活Nrf2，并以濃度依賴的方式上調(diào)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)HO-1 蛋白和mRNA 的表達(dá)，抑制ROS 產(chǎn)生，從而發(fā)揮保護(hù)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用[20]。在內(nèi)皮細(xì)胞中，GW0742通過誘導(dǎo)SOD、CAT等抗氧化酶的表達(dá)，減少腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生ROS[2]。內(nèi)皮細(xì)胞特異性PPARδ基因敲除小鼠主動(dòng)脈內(nèi)CAT 和GPx 的表達(dá)降低，氧化應(yīng)激增強(qiáng)[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2 激活劑DMF 和GW501516 均可升高Nrf2 蛋白、HO-1 蛋白的表達(dá)水平及SOD、GPx、CAT 水平，降低MDA、ROS 水平，減輕低氧誘導(dǎo)的PAECs 損傷，且Nrf2 抑制劑ML385 能夠逆轉(zhuǎn)GW501516 的上述作用。這說明GW501516 可通過抑制氧化應(yīng)激，減輕低氧誘導(dǎo)的PAECs 損傷，其機(jī)制可能與激活Nrf2有關(guān)。

綜上所述，GW501516可通過激活Nrf2，抑制氧化應(yīng)激來減輕低氧誘導(dǎo)的PAECs 損傷。本研究僅從細(xì)胞水平探討了GW501516 對(duì)低氧誘導(dǎo)PAECs 損傷及氧化應(yīng)激的影響，本課題組將在后續(xù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中觀察GW501516 對(duì)低氧誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓大鼠內(nèi)皮細(xì)胞功能、氧化應(yīng)激及肺血管重構(gòu)的影響。