紫鉚因通過(guò)激活SIRT1介導(dǎo)FOXO1/NF-κB信號(hào)通路改善坐骨神經(jīng)損傷

車敏，張輝

（沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院手外一科，沈陽(yáng) 110024）

周圍神經(jīng)損傷 （peripheral nerve injury，PNI） 后神經(jīng)的再生與功能恢復(fù)是一個(gè)涉及多機(jī)制的復(fù)雜過(guò)程［1］。隨著細(xì)胞生物學(xué)與分子生物學(xué)研究的不斷深入，臨床已采用藥物治療、自體或異體神經(jīng)移植、神經(jīng)導(dǎo)管或支架及基因治療等多種方法和手段治療PNI，然而，即使患者經(jīng)過(guò)較為科學(xué)的治療，仍會(huì)留下程度不一的后遺癥［2-3］。因此，深入研究神經(jīng)損傷后的病理機(jī)制、尋求新的治療靶點(diǎn)，以及開(kāi)發(fā)有效的治療新藥物仍是亟待解決的問(wèn)題。紫鉚因是沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1 （silence information regulator factor 2 related enzyme 1，SIRT1） 的激活劑，具有抗氧化、抗炎、抗癌、抗糖尿病、降壓和神經(jīng)保護(hù)等廣泛的藥理作用。研究［4］發(fā)現(xiàn)，紫鉚因能有效地防止谷氨酸誘導(dǎo)的氧化損傷和脂多糖 （lipopolysaccharide，LPS） 誘導(dǎo)的炎癥激活，這可能與其通過(guò)磷脂酰肌醇-3-激酶 （phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K） /蛋白激酶B （protein kinase B，Akt） 信號(hào)通路誘導(dǎo)血紅素加氧酶-1 （heme oxygenase-1，HO-1） 和核因子E2相關(guān)因子2 （nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2） 激活有關(guān)。然而，關(guān)于紫鉚因是否可作為改善PNI的潛在治療藥物目前尚無(wú)研究。本研究通過(guò)建立大鼠坐骨神經(jīng)損傷模型，探究紫鉚因?qū)ψ巧窠?jīng)損傷大鼠神經(jīng)損傷的改善作用及其潛在機(jī)制，為其作為PNI的潛在治療藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

HE染色試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、RIPA裂解液、BCA試劑盒和ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；BDNF、MBP、GAP-43、SIRT1、FOXO1、Keap1和核因子κB （nuclear factor-κB，NF-κB）抗體均購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。光學(xué)顯微鏡購(gòu)自日本奧林巴斯公司；熒光顯微鏡購(gòu)自日本尼康公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)購(gòu)自上海天能科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、處理及取材：雄性SD大鼠，6月齡，體質(zhì)量 （250±20） g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。將30只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、坐骨神經(jīng)損傷組和紫鉚因組，每組10只。造模前24 h禁食水。腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉，將坐骨神經(jīng)損傷組大鼠俯臥位固定，于右側(cè)髖骨與股骨交界處碘伏消毒并備皮，沿坐骨神經(jīng)走向切開(kāi)約1 cm，鈍性分離肌肉層，充分暴露梨狀肌下緣，找到坐骨神經(jīng)后，用止血鉗在坐骨神經(jīng)遠(yuǎn)端5 mm處夾持5 s，力度滿扣 （6 N），制造損傷點(diǎn)。生理鹽水沖洗，消毒，縫合切口。假手術(shù)組按上述操作找到坐骨神經(jīng)后，消毒并縫合傷口。紫鉚因組除按上述方法［5］造模外，每日灌胃給予紫鉚因100 mg/kg。造模手術(shù)后14 d，腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，取出右側(cè)坐骨神經(jīng)，一部分置于4%多聚甲醛，其余部分置于-80 ℃凍存。本研究獲得中國(guó)醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2.2 Basso、Beattie、Bresnahan （BBB） 運(yùn)動(dòng)評(píng)分：分別于手術(shù)當(dāng)天、手術(shù)后第7天和第14天，采用雙盲法對(duì)各組大鼠行BBB運(yùn)動(dòng)評(píng)分。根據(jù)評(píng)分規(guī)則，觀察4 min內(nèi)各組大鼠的運(yùn)動(dòng)情況，無(wú)自發(fā)運(yùn)動(dòng)記為0分，正常運(yùn)動(dòng)記為21分，達(dá)到14分即表示肢體可支撐和四肢運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)。

1.2.3 坐骨神經(jīng)功能指數(shù) （sciatic nerve function index，SFI）：分別于手術(shù)當(dāng)天、手術(shù)后第7天和第14天，以SFI評(píng)價(jià)坐骨神經(jīng)損傷后的功能恢復(fù)情況。將大鼠雙側(cè)后足沾墨水后，使其在通道內(nèi)行走并留下足印。測(cè)量損傷 （experimental，E） 側(cè)及正常 （normal，N） 側(cè)足印，記錄足印長(zhǎng)度 （print length，PL）、第1足趾到第5足趾的距離 （toe spread，TS）、第2足趾到第4足趾的距離 （intermediary toe spread，IT）。計(jì)算SFI = 109.5×（ETS-NTS） /NTS-38.3× （EPL-NPL） /NPL+13.3×（EIT-NIT）/NIT-8.8。SFI正常值為0，神經(jīng)功能損傷后為負(fù)值，功能完全喪失為-100。

1.2.4 HE染色及TUNEL實(shí)驗(yàn)：坐骨神經(jīng)組織經(jīng)4%多聚甲醛固定、梯度乙醇脫水、二甲苯透明和石蠟包埋，制作厚約5 μm切片。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行HE染色及TUNEL實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 Western blotting：取凍存于-80 ℃的各組大鼠坐骨神經(jīng)組織，用RIPA裂解液提取組織總蛋白，BCA法定量蛋白。上樣行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉，加入BDNF、MBP、GAP-43 SIRT1、FOXO1、Keap1和NF-κB抗體 （1∶1 000稀釋），4 ℃孵育過(guò)夜。PBST洗膜3次，二抗室溫孵育1 h，PBST洗膜3次，ECL化學(xué)發(fā)光，使用ImageJ軟件進(jìn)行灰度分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料均符合正態(tài)分布，采用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，并采用事后檢驗(yàn)Tukey法進(jìn)行組間兩兩比較。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 紫鉚因?qū)ψ巧窠?jīng)損傷大鼠BBB運(yùn)動(dòng)評(píng)分和SFI的影響

手術(shù)當(dāng)天和術(shù)后第7天，坐骨神經(jīng)損傷組大鼠BBB運(yùn)動(dòng)評(píng)分較假手術(shù)組顯著降低 （P＜ 0.05），紫鉚因組與坐骨神經(jīng)損傷組大鼠BBB運(yùn)動(dòng)評(píng)分比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P＞ 0.05）；術(shù)后第14天，坐骨神經(jīng)損傷組大鼠BBB運(yùn)動(dòng)評(píng)分較假手術(shù)組顯著降低 （P＜ 0.05），紫鉚因組大鼠BBB運(yùn)動(dòng)評(píng)分較坐骨神經(jīng)損傷組顯著升高 （P＜ 0.05）。

手術(shù)當(dāng)天，坐骨神經(jīng)損傷組大鼠SFI較假手術(shù)組顯著降低 （P＜ 0.05），紫鉚因組SFI與坐骨神經(jīng)損傷組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P＞ 0.05）。術(shù)后第7天和第14天，坐骨神經(jīng)損傷組大鼠SFI較假手術(shù)組顯著降低（P＜ 0.05），紫鉚因組大鼠SFI較坐骨神經(jīng)損傷組顯著升高 （P＜ 0.05）。見(jiàn)表1。

表1 3大鼠BBB運(yùn)動(dòng)評(píng)分和坐骨神經(jīng)功能指數(shù)比較 （±s）Tab.1 Comparison of BBB motor score and sciatic nerve function index in rats （±s）

表1 3大鼠BBB運(yùn)動(dòng)評(píng)分和坐骨神經(jīng)功能指數(shù)比較 （±s）Tab.1 Comparison of BBB motor score and sciatic nerve function index in rats （±s）

1） P ＜ 0.05 vs. sham group；2） P ＜ 0.05 vs. model group.

ItemSham groupModel groupButein group Score of BBB scale 0 d21.0±0 0±0 0±0 7 d21.0±0 7.1±1.101） 10.6±1.341）14 d21.0±0 8.5±0.701） 15.4±1.171），2）Sciatic nerve function index 0 d 0±0-89.8±6.871） -90.7±5.531）7 d-5.7±1.85-77.3±5.751） -66.2±3.671）14 d-2.6±1.17-63.8±4.871） -40.1±3.901），2）

2.2 紫鉚因?qū)ψ巧窠?jīng)損傷大鼠坐骨神經(jīng)病理學(xué)改變的影響

如圖1所示，假手術(shù)組大鼠神經(jīng)髓鞘完整，無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；坐骨神經(jīng)損傷組大鼠神經(jīng)髓鞘崩解變性壞死，纖維幾乎被炎癥細(xì)胞占據(jù)；紫鉚因組大鼠神經(jīng)髓鞘變性改善，纖維炎性細(xì)胞減少。

圖1 各組大鼠坐骨神經(jīng)病理?yè)p傷情況 HE ×400Fig.1 Pathological damage of the sciatic nerve in each group of rats HE ×400

2.3 紫鉚因?qū)ψ巧窠?jīng)損傷大鼠坐骨神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響

TUNEL結(jié)果如圖2所示，坐骨神經(jīng)損傷組大鼠坐骨神經(jīng)近側(cè)斷端細(xì)胞凋亡率［ （42.5±6.72） %］較假手術(shù)組［ （3.8±0.56） %］顯著升高 （P＜ 0.05），紫鉚因組大鼠坐骨神經(jīng)近側(cè)斷端細(xì)胞凋亡率［ （17.6±2.25） %］較坐骨神經(jīng)損傷組顯著降低 （P＜ 0.05）。

圖2 各組大鼠坐骨神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況 ×200Fig.2 Apoptosis of sciatic nerve cells in each group of rats ×200

2.4 紫鉚因?qū)ψ巧窠?jīng)損傷大鼠坐骨神經(jīng)細(xì)胞再生相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖3所示，與假手術(shù)組比較，坐骨神經(jīng)損傷組大鼠坐骨神經(jīng)近側(cè)斷端BDNF、MBP和GAP-43蛋白表達(dá)水平顯著降低 （P＜ 0.05）；與坐骨神經(jīng)損傷組比較，紫鉚因組大鼠坐骨神經(jīng)近側(cè)斷端BDNF、MBP和GAP-43蛋白表達(dá)水平顯著升高 （P＜ 0.05）。

圖3 各組大鼠坐骨神經(jīng)細(xì)胞再生相關(guān)蛋白表達(dá)情況Fig.3 Regeneration-related protein expression of sciatic nerve cells in each group of rats

2.5 紫鉚因?qū)ψ巧窠?jīng)損傷大鼠坐骨神經(jīng)SIRT1表達(dá)的影響

如圖4所示，與假手術(shù)組比較，坐骨神經(jīng)損傷組大鼠坐骨神經(jīng)近側(cè)斷端SIRT1蛋白表達(dá)水平顯著降低 （P＜ 0.05）；與坐骨神經(jīng)損傷組比較，紫鉚因組大鼠坐骨神經(jīng)近側(cè)斷端SIRT1蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜ 0.05）。

圖4 各組大鼠坐骨神經(jīng)SIRT1表達(dá)情況Fig.4 Expression of SIRT1 in the sciatic nerve of rats in each group

2.6 紫鉚因?qū)ψ巧窠?jīng)損傷大鼠坐骨神經(jīng)FOXO1/NF-κB信號(hào)通路的影響

如圖5所示，與假手術(shù)組比較，坐骨神經(jīng)損傷組大鼠坐骨神經(jīng)近側(cè)斷端FOXO1、Keap1和NF-κB蛋白表達(dá)水平顯著升高 （P＜ 0.05）；與坐骨神經(jīng)損傷組比較，紫鉚因組大鼠坐骨神經(jīng)近側(cè)斷端FOXO1、Keap1和NF-κB蛋白表達(dá)水平顯著降低 （P＜ 0.05）。

圖5 紫鉚因抑制坐骨神經(jīng)損傷大鼠坐骨神經(jīng)FOXO1/NF-κB信號(hào)通路Fig.5 Butein inhibits sciatic nerve FOXO1/NF-κB signaling pathway in rats with sciatic nerve injury

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，紫鉚因可增加坐骨神經(jīng)損傷大鼠BBB運(yùn)動(dòng)評(píng)分和SFI，改善大鼠坐骨神經(jīng)病理?yè)p傷，降低大鼠坐骨神經(jīng)細(xì)胞凋亡水平，增加神經(jīng)再生相關(guān)蛋白BDNF、MBP和GAP-43表達(dá)，提示紫鉚因?qū)ψ巧窠?jīng)損傷具有改善作用。

紫鉚因是一種SIRT1激活劑，可通過(guò)激活SIRT1抑制炎癥和氧化應(yīng)激，還可通過(guò)激活SIRT1/ADAM10信號(hào)通路改善神經(jīng)退行性變［6］。SIRT1是一種依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 （nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+） 且核心區(qū)域高度保守的組蛋白去乙酰化酶和二磷酸腺苷 （adenosine diphosphate，ADP）核糖基轉(zhuǎn)移酶［7］。SIRT1參與調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、凋亡、氧化應(yīng)激反應(yīng)、衰老和炎癥反應(yīng)等多種生理過(guò)程［8］。SIRT1在PNI中的作用已廣泛報(bào)道，研究［9］發(fā)現(xiàn)，SIRT1在脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中過(guò)表達(dá)，刺激mTOR非依賴性自噬，促進(jìn)生長(zhǎng)狀態(tài)，改善運(yùn)動(dòng)軸突再生，表明SIRT1依賴性自噬促進(jìn)PNI后運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元再生。TIAN等［10］發(fā)現(xiàn)SIRT1在慢性縮窄性損傷 （chronic constriction injury，CCI） 手術(shù)后降低，植入SIRT1過(guò)表達(dá)的人間充質(zhì)干細(xì)胞降低血清和脊髓背角的促炎性細(xì)胞因子水平，改善CCI大鼠的神經(jīng)性疼痛。以上均表明激活SIRT1可改善PNI。本研究檢測(cè)了紫鉚因?qū)ψ巧窠?jīng)損傷大鼠坐骨神經(jīng)近側(cè)斷端SIRT1蛋白表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)紫鉚因逆轉(zhuǎn)了坐骨神經(jīng)損傷誘導(dǎo)的大鼠坐骨神經(jīng)近側(cè)斷端SIRT1蛋白表達(dá)下調(diào)，提示紫鉚因可能通過(guò)激活SIRT1改善坐骨神經(jīng)損傷。

FOXO1是SIRT1激活后調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子之一。在一項(xiàng)腦缺血/再灌注損傷的相關(guān)研究［11］中發(fā)現(xiàn)，抑制SIRT1/FOXO1信號(hào)通路能降低腦缺血/再灌注小鼠神經(jīng)功能，加重腦損傷程度。此外，HUANG等［12］發(fā)現(xiàn)，SIRT1/FOXO1信號(hào)通路激活還具有內(nèi)皮保護(hù)和促血管生成作用。NF-κB在調(diào)節(jié)人體免疫系統(tǒng)方面具有關(guān)鍵作用，其失調(diào)與哮喘、癌癥、糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥和神經(jīng)系統(tǒng)疾病等慢性疾病有關(guān)［13］。WANG等［14］發(fā)現(xiàn)，NF-κB信號(hào)受FOXO1調(diào)控。SONG等［15］的研究顯示，SIRT1通過(guò)增加Nrf2核轉(zhuǎn)位抑制FOXO1，從而降低NF-κB表達(dá)水平。因此，SIRT1介導(dǎo)的FOXO1/NF-κB信號(hào)通路可能是其改善PNI的分子機(jī)制。本研究結(jié)果顯示，紫鉚因可降低大鼠坐骨神經(jīng)近側(cè)斷端FOXO1、Keap1和NF-κB蛋白表達(dá)水平，提示紫鉚因可能通過(guò)激活SIRT1，抑制FOXO1/NF-κB信號(hào)通路，從而減輕坐骨神經(jīng)損傷。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，紫鉚因可改善坐骨神經(jīng)損傷模型大鼠坐骨神經(jīng)損傷，其機(jī)制可能與其激活SIRT1抑制FOXO1/NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。本研究為紫鉚因作為坐骨神經(jīng)損傷及其他PNI的潛在治療藥物開(kāi)發(fā)提供了理論依據(jù)。