高鹽飲食導致小鼠卵巢組織線粒體功能異常

侯恩太，顧曉陽，倪士峰，李新宇，喬杰

（1. 北京大學第三醫院婦產科生殖醫學中心，北京 100191； 2. 國家婦產科疾病臨床醫學研究中心 （北京大學第三醫院），北京 100191； 3. 輔助生殖教育部重點實驗室 （北京大學），北京 100191； 4. 北京市生殖內分泌與輔助生殖技術重點實驗室，北京 100191； 5. 西北大學生命科學學院中藥系，西安 710069）

隨著飲食方式的變化，特別是加工食品和快餐食品的消費量迅速增加，人們飲食中鹽的攝入量也顯著增加［1］。然而，攝入過量的鹽通常被認為是高血壓、心血管疾病等許多疾病的誘因［2］。這些高鹽攝入導致的疾病有一個共同的病理表現，即相應器官組織的氧化應激增強和線粒體功能異常［3］。

高鹽攝入還會抑制卵巢中卵泡的發育［4］，然而高鹽攝入對卵巢功能的影響及其機制尚不明確。本課題組的前期研究［5］發現，高鹽飲食可導致小鼠卵巢組織中氧化應激增強，代謝模式改變。而卵巢氧化還原體系的平衡和代謝的穩態又與線粒體密切相關，線粒體是細胞代謝的中心，是細胞內活性氧（reactive oxygen species，ROS） 的主要來源，也是ROS攻擊的重要靶點之一［5-6］。卵巢細胞線粒體的質量和數量是決定卵巢功能的關鍵因素。然而，目前尚不清楚高鹽飲食后小鼠卵巢氧化應激增強和代謝模式改變是否會影響卵巢線粒體的功能。因此，本研究通過分析高鹽飲食后小鼠卵巢組織中線粒體的功能，揭示高鹽飲食影響小鼠卵巢組織線粒體功能的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

20只雌性ICR小鼠，6周齡，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司。飼養環境溫度20～23 ℃，濕度 （50±5） %。正常鹽飼料AIN-93G （0.4% NaCl） 和高鹽飼料 （AIN-93G+8%NaCl），均購于北京博泰宏達生物科技公司。正常鹽飼料飼養1周后，將小鼠隨機分成正常鹽飲食 （NSD） 組和高鹽飲食 （HSD） 組，每組10只。NSD組小鼠繼續喂養正常鹽飼料。HSD組小鼠在7周齡時改用高鹽飼料。喂養4周后，從眼眶后靜脈叢采集血樣。血液采集后，室溫靜止30 min，之后4 ℃、1 600g離心10 min去除血凝塊，血清等分于凍存管中，-80 ℃下保存。取出卵巢后立即用冷鹽水沖洗，在液氮中快速冷凍，并在-80 ℃下保存。采用冷凍組織制備組織勻漿，用于活性測定、Western blotting和代謝物分析。本研究獲得北京大學第三醫院實驗動物中心倫理委員會批準。

1.2 細胞培養

人卵巢顆粒細胞COV-434在含10%胎牛血清的高糖DMEM中培養，置于37 ℃、5%CO2的細胞培養箱內培養。正常培養基中的NaCl終濃度為139 mmol/L，高鹽培養基中的NaCl終濃度為179 mmol/L。

1.3 ROS和H2O2水平的測定

1.3.1 組織中ROS含量的測定：將組織樣品在冷HEPES緩沖液 （20 mmol/L，pH7.5） 中充分勻漿。勻漿液在4 ℃、12 000g離心30 min，取上清進行分析。使用BCA蛋白質測定試劑盒 （P0012S，上海碧云天生物技術有限公司） 測定上清蛋白濃度。將卵巢組織提取物 （100 μL） 與20 μmol/L 2，7-二氯二氫熒光素二乙酸鹽 （H2DCFDA，美國Invitrogen公司） 孵育。酶標儀檢測，激發光 488 nm，發射光 538 nm。ROS 相對含量=熒光強度/蛋白量 （100 μL卵巢組織提取液中蛋白含量）。

1.3.2 細胞中ROS含量的測定：細胞中ROS含量采用H2DCFDA測定。H2DCFDA母液用DMSO配制，母液濃度為10 mmol/L，-20 ℃避光保存。測定時用無血清無抗生素DMEM培養基稀釋母液1 000 倍，即濃度為10 μmol/L的工作液。6孔板中，按1 mL/孔加入H2DCFDA工作液，37 ℃孵育30 min；棄H2DCFDA染色液，預冷的PBS清洗細胞3次；加入細胞裂解液，300 μL/孔，輕輕搖晃，讓裂解液鋪均勻，冰浴中裂解10 min，避光操作；小心刮取細胞，并將細胞懸液轉移至1.5 mL EP管中，4 ℃、13 000g離心10 min；上清轉移到新的EP管中，然后加樣到96孔板，150 μL/孔，并用細胞裂解液作對照。酶標儀檢測，激發光 488 nm，發射光538 nm；使用 BCA 試劑盒測定上清蛋白濃度。ROS相對含量=熒光強度/蛋白量 （150 μL細胞裂解上清中蛋白含量）。

1.3.3 組織和細胞中H2O2含量的測定：采用H2O2測定試劑盒 （S0038，上海碧云天生物技術有限公司），具體操作按說明書進行。

1.4 Western blotting

分析抗體及其稀釋比例：超氧化物歧化酶 （superoxide dismutase，SOD） 1和SOD2 （1 ∶5 000）、Nrf2（1 ∶2 000），購自中國Proteintech公司；電子傳遞鏈復合物 （Complex） Ⅰ （1 ∶1 000）、Complex Ⅱ （1 ∶1 000）、Complex Ⅲ （1 ∶1 000）、Complex Ⅳ （1 ∶1 000）、Complex Ⅴ （1 ∶1 000），購自美國Abcam公司；β-actin （1 ∶5 000）、抗小鼠二抗 （1 ∶5 000）、抗兔二抗 （1 ∶5 000），購自美國CST公司。采用Thermo Super Signal West Pico試劑盒 （美國Thermo公司） 進行化學發光，使用ImageJ軟件進行定量分析。

1.5 ATP含量測定

組織、血清和細胞中ATP含量的測定采用美國Promega公司試劑盒 （G7570），具體操作按照說明書進行。在Infinite M200 PRO酶標儀 （瑞士Tecan公司）中記錄發光，積分時間為5 s/孔。

1.6 SOD和琥珀酸脫氫酶 （succinate dehydrogenase，SDH） 活性的測定

組織和細胞中SOD1和SOD2活性的測定按照試劑盒 （S0103，上海碧云天生物技術有限公司） 說明書進行。組織和細胞中SDH活性的測定按照試劑盒（A022-1-1，南京建成生物工程研究所） 說明書進行。

首先，在人才結構分布上，北京、天津、河北省的人才主要集聚在黨政機關、企事業單位。河北省黨政機關、企事業單位人才分布高達70%，而企業所需的高層次經營管理人才嚴重缺失，呈現出行業結構性失衡的特點。

1.7 統計學分析

使用GraphPad Prism 9.0軟件進行數據處理。數據以±s表示，使用Student’st檢驗或方差分析進行比較。P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HSD組小鼠卵巢組織中ROS和H2O2 水平升高

本課題組前期研究發現，高鹽飲食后小鼠卵巢組織氧化應激增強。為了進一步研究高鹽飲食后卵巢組織氧化應激增強對卵巢組織線粒體功能的影響，本研究首先測定了高鹽飲食后小鼠卵巢組織中ROS和H2O2的水平。結果發現，與NSD組相比，HSD組小鼠卵巢組織中ROS和H2O2水平顯著升高 （P＜0.01，圖1A、1B）。這與本課題組前期研究的結果一致，即高鹽飲食可導致小鼠卵巢組織中ROS積累。

圖1 高鹽飲食后小鼠卵巢組織中ROS、H2O2水平和Nrf2蛋白表達水平Fig.1 ROS and H2O2 levels and Nrf2 protein expression level in mouse ovarian tissue after a high salt diet

為了進一步驗證高鹽飲食改變了卵巢組織氧化還原穩態，檢測小鼠卵巢組織中Nrf2蛋白表達情況。結果發現，HSD組小鼠卵巢組織中Nrf2蛋白表達水平顯著升高 （P＜ 0.05，圖1 C）。

2.2 HSD組小鼠卵巢組織中SOD2的活性和表達水平升高

為了揭示高鹽飲食導致的ROS增加對小鼠卵巢組織線粒體的影響，首先檢測卵巢組織中SOD1和SOD2的活性和蛋白表達水平。結果發現，與NSD組相比，HSD組小鼠卵巢組織中SOD1的活性和蛋白表達水平呈上升趨勢，但無統計學差異 （圖2A、2C），而卵巢組織線粒體中SOD2的活性和蛋白表達水平顯著升高 （P＜ 0.05，圖2B、2C）。

圖2 高鹽飲食后小鼠卵巢組織線粒體中SOD1和SOD2的活性和表達水平Fig.2 Activities and expression level of SOD1 and SOD2 in mouse ovary mitochondria after a high salt diet

2.3 HSD組小鼠卵巢組織線粒體功能異常

進一步分析HSD組小鼠卵巢組織中ComplexⅠ～Ⅴ的表達水平，結果顯示，與NSD組相比，HSD組小鼠卵巢組織中Complex Ⅰ表達水平顯著下降 （P＜0.05，圖3A），但Complex Ⅴ表達水平顯著升高 （P＜0.05，圖3A），Complex Ⅱ、Complex Ⅲ和Complex Ⅳ表達水平呈下降趨勢，但無統計學差異 （圖3 A）。

圖3 高鹽飲食后小鼠卵巢組織中線粒體電子傳遞鏈復合物表達水平和SDH活性以及卵巢組織和血清中ATP含量Fig.3 Expression level of mitochondrial electron transport chain complexes and SDH activity in the mouse ovary and ATP content in the mouse ovary and serum after a high salt diet

為了驗證高鹽飲食對卵巢組織線粒體功能的影響，分析小鼠卵巢組織中SDH活性。結果顯示，與NSD組相比，HSD組小鼠卵巢組織中SDH活性顯著降低 （P＜ 0.01，圖3B）。

Complex Ⅰ～Ⅴ表達水平異常、SDH活性不足可能直接影響線粒體的三羧酸循環和ATP合成。為了進一步驗證高鹽飲食對卵巢組織線粒體功能的影響，分析小鼠血液和卵巢組織中ATP含量。結果顯示，與NSD組相比，HSD組小鼠血清和卵巢組織中ATP含量顯著下降 （P＜ 0.01，圖3C、3D）。

2.4 高鹽處理后COV-434細胞中ROS和H2O2 水平升高

為了進一步驗證高鹽對卵巢線粒體功能的影響，檢測培養的COV-434細胞中ROS和H2O2水平。結果顯示，高鹽條件下培養的COV-434細胞中ROS和H2O2水平顯著升高 （P＜ 0.01，圖4）。

圖4 高鹽處理后COV-434細胞中ROS和H2O2水平Fig.4 Levels of ROS and H2O2 in COV-434 cells after a high salt treatment

2.5 高鹽處理后COV-434細胞中SOD2的活性和表達水平增加

高鹽處理后，COV-434細胞中 SOD2的活性和表達水平明顯增加 （P＜ 0.05，圖5）。細胞水平的結果說明，高鹽處理后COV-434細胞中ROS升高影響到了線粒體，線粒體是ROS重要的轉化部位。

圖5 高鹽處理后COV-434細胞中SOD2活性和表達水平Fig.5 Activity and expression level of SOD2 in COV-434 cells after a high salt treatment

2.6 高鹽處理后COV-434細胞線粒體功能異常

在細胞水平上進一步分析高鹽處理后COV-434細胞中Complex Ⅰ～Ⅳ表達水平、SDH活性以及ATP含量。結果顯示，高鹽處理后COV-434細胞中Complex Ⅰ和Complex Ⅱ表達水平顯著下降 （P＜ 0.05，圖6A），但Complex Ⅴ表達水平顯著升高 （P＜ 0.05，圖6A），SDH活性顯著降低 （P＜ 0.01，圖6B），ATP含量顯著下降 （P＜ 0.01，圖6C）。細胞水平的結果進一步驗證了高鹽可導致細胞線粒體功能異常。

圖6 高鹽處理后COV-434細胞中線粒體電子傳遞鏈復合物表達水平、SDH活性和ATP含量Fig.6 Expression level of mitochondrial electron transport chain complexes，SDH activity，and ATP content in COV-434 cells after a high salt treatment

3 討論

3.1 Complex表達異常可能是高鹽飲食后卵巢線粒體功能紊亂的主要誘發因素之一

線粒體作為細胞的能量供給站，線粒體Complex Ⅰ～Ⅴ在電子傳遞過程中形成質子梯度，質子梯度驅動Complex Ⅴ合成ATP。Complex表達水平異常直接影響線粒體的功能［3］。Complex Ⅰ為線粒體呼吸鏈的第一個酶，作為主要的電子受體，其亞單位結構和功能損傷會引起線粒體氧化磷酸化功能失調，ATP供給能力下降［7］。本研究首次報道了高鹽飲食可引起小鼠卵巢組織線粒體功能紊亂，這可能與高鹽飲食后卵巢組織線粒體Complex Ⅰ亞單位表達水平降低有關。

SDH是連接氧化磷酸化與電子傳遞的樞紐之一，是唯一嵌入到線粒體內膜的酶，其活性一般可作為評價三羧酸循環運行程度的指標，是反映線粒體功能的標志酶之一［8］。高鹽攝入后小鼠卵巢組織SDH活性顯著降低，反映出高鹽攝入破壞了線粒體氧化磷酸化與電子傳遞的穩態，導致三羧酸循環效率降低。而高鹽攝入后小鼠卵巢組織線粒體ComplexⅤ表達水平升高可能為一種應激反應，以減少線粒體供能差異。

有研究［9］報道，小鼠卵母細胞中線粒體電子傳遞鏈的破壞可導致減數分裂紡錘體異常和胚胎植入前電位降低。本研究證實，高鹽飲食導致線粒體Complex表達水平異常。高鹽攝入是否影響小鼠卵母細胞的減數分裂，是需要進一步研究的問題。

3.2 高鹽飲食與卵巢線粒體DNA突變

線粒體是影響卵母細胞質量的主要因素，在卵巢疾病、卵巢衰老等過程中均扮演重要角色［10］。線粒體內高水平的ROS自由基可能導致線粒體DNA突變，進一步導致線粒體DNA和核DNA在轉錄翻譯功能性電子傳遞鏈蛋白時失去同步性，從而導致電子傳遞鏈部分解偶聯［11-12］。事實上，線粒體DNA與電子傳遞鏈非常接近，缺乏保護性組蛋白，修復機制有限，線粒體DNA的突變率幾乎是核DNA的25倍［13］。本研究發現，高鹽攝入后卵巢組織ROS水平顯著升高，增加的ROS進而可能導致線粒體DNA突變。而線粒體DNA突變又將進一步導致ROS積累和線粒體DNA突變增加［14］。上述惡性循環可能導致線粒體DNA突變呈指數級增加，其影響的線粒體功能異常范圍可能從ATP減少到細胞周期停滯甚至凋亡［15］。因此，研究高鹽飲食與卵巢組織線粒體DNA的關系可能有助于了解高鹽影響卵巢功能和卵巢衰老的生物學機制。

氧化平衡通過多種酶促和非酶促防御機制 （如SOD、谷胱甘肽過氧化物酶和谷胱甘肽） 在體內得到控制。有趣的是，通過分析SOD1和SOD2的活性和表達水平，本研究發現僅線粒體特異的SOD2蛋白被顯著誘導表達，表明線粒體可能在高鹽誘導的氧化應激中具有關鍵作用，有必要進一步分析高鹽飲食后線粒體內氧化還原體系的變化，揭示線粒體在高鹽誘導的氧化應激中的作用機制。

綜上所述，本研究首次報道了高鹽飲食可導致小鼠卵巢組織線粒體氧化穩態失衡、電子傳遞鏈異常、三羧酸循環受阻、ATP水平不足等線粒體功能障礙。長期高鹽攝入作為一種環境因素，可能通過損害線粒體功能和減少ATP的產生導致小鼠卵巢組織細胞凋亡甚至衰老。本研究為探討攝入過量食鹽導致卵巢損傷的機制提供了參考，并強調了控制鹽攝入量的重要性。