miR-125a靶向轉錄無調性堿性螺旋環螺旋轉錄因子8對肺腺癌惡性進展的影響

姜昌瑞，張楚函，劉洋，李玥

（中國醫科大學附屬第一醫院 1. 胸外科；2.輸血科，沈陽 110001）

肺腺癌是起源于上皮組織的惡性腫瘤，在我國各種惡性腫瘤中發病率和死亡率居首位，與吸煙、空氣污染、放射性暴露以及肺部真菌感染等密切相關［1］。絕大多數肺腺癌早期無明顯癥狀，發現時已為晚期，治療效果差，患者的5年生存率很低［2］。因此，發現和鑒定肺腺癌早期診療的分子標志物具有重要意義。

無調性堿性螺旋環螺旋轉錄因子8 （atonal homolog 8，ATOH8） 是堿性螺旋環螺旋轉錄因子超家族A組成員，能夠與DNA E-box序列直接結合，調控多個下游基因的表達，參與胚胎發育、器官發育及多種腫瘤的發生發展［3-5］。然而，ATOH8在肺腺癌中的作用及潛在機制尚不清楚。因此，本研究通過在線數據庫分析結合分子生物學實驗探討ATOH8在肺腺癌中的作用及異常表達的潛在調控機制，為發現肺腺癌的分子標志物奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本：30例肺腺癌及癌旁正常組織標本取自中國醫科大學附屬第一醫院胸外科，術后立即置于液氮中保存備用。標本均經病理學檢查確診。所有患者知情同意，本研究獲得醫院醫學倫理委員會批準。

1.1.2 細胞：人肺腺癌細胞系A549 （中科院上海細胞庫）。

1.1.3 試劑：RPMI1640培養基及胎牛血清 （以色列BI生物科技有限公司）；TRIzol和PCR相關試劑 （中國上海寶生物工程有限公司）；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒和ECL化學發光液 （中國上海碧云天生物科技發展有限公司）；引物和ATOH8 siRNA （中國上海生工生物工程股份有限公司）；兔源ATOH8抗體、鼠源GAPDH抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗和辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠二抗 （中國武漢三鷹生物技術有限公司）；細胞轉染試劑盒 （法國達科為生物技術有限公司）；RIPA裂解液和蛋白上樣緩沖液 （中國上海碧云天生物技術有限公司）；蛋白Marker （美國賽默飛世爾科技有限公司）；CCK-8（中國南京凱基生物科技有限公司）；6孔板及96孔板（美國康寧生命科學有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 實時PCR：應用TRIzol提取組織和細胞全RNA，按照逆轉錄試劑盒說明書將mRNA逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板進行PCR，體系配制參考TB Green Real-time PCR試劑盒說明書。每個樣本設置3個復孔。以2-ΔΔCT法計算相對表達量，以GAPDH作為內參，目的基因與內參基因表達量的比值表示目的基因相對表達水平。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.2 細胞轉染：收集對數增殖期的A549細胞，以2×105/孔接種于6孔板中，培養至融合度為70%～90%。按照jet-Prime （PolyPlus） 試劑說明書，將ATOH8 過表達載體及對照組轉染人肺腺癌細胞，48 h后收集各組細胞進行轉染效率分析和增殖能力檢測。

1.2.3 Western blotting：收集細胞，加入50 μL的RIPA細胞裂解液，震蕩混勻，冰上裂解20 min，在4 ℃離心機中12 000 r/min離心10 min。收集上清液，按照BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。加入5×蛋白上樣緩沖液并混勻，100 ℃煮沸5～10 min。經10% SDSPAGE凝膠分離后，轉印至PVDF膜上。6%脫脂牛奶封閉1 h后，加入特異性一抗孵育過夜。第2天去除一抗并洗滌后，加入二抗，37 ℃孵育1 h，通過ECL化學發光法檢測蛋白表達水平。

1.2.4 CCK-8法檢測細胞遷移能力：胰蛋白酶消化轉染后細胞，將5 000/mL細胞懸液接種于96孔板中，放置無菌培養箱中。分別于24 h、48 h、72 h、96 h加入CCK-8，并置于37 ℃培養箱繼續培養2 h，酶標儀450 nm處檢測吸光度。

1.3 在線數據庫

利用UALCAN （https：//ualcan.path.uab.edu） 數據庫分析ATOH8在肺腺癌中的表達水平差異、啟動子區甲基化水平及其與臨床分期和TP53突變的關系。利用Timer 2.0 （https：//cistrome.shinyapps.io/timer/） 分析ATOH8表達水平與肺腺癌5年生存率的關系。利用TargetScan （https：//www.targetscan.org） 分析和預測能夠與ATOH8上游結合的微RNA （microRNA，miRNA）。

1.4 統計學分析

采用SPSS 21.0統計軟件進行統計分析，ATOH8在不同組織中的差異表達分析采用配對樣本t檢驗，ATOH8和miR-125a在細胞中的表達水平差異分析及細胞增殖能力差異分析采用獨立樣本t檢驗，數據以±s表示，P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ATOH8在肺腺癌中表達下調

UALCAN數據庫在線分析結果顯示，ATOH8在包括肺腺癌在內的多種腫瘤中表達水平顯著降低（圖1A）。實時PCR檢測ATOH8在肺腺癌中的表達水平，結果顯示與癌旁正常組織相比，ATOH8在肺腺癌中表達水平顯著下調 （P＜ 0.01，圖1B）。此外，在肺腺癌患者中，長期吸煙者ATOH8表達水平更低（P＜ 0.05，圖1C）。

圖1 ATOH8在腫瘤組織中表達水平的分析和檢測結果Fig.1 ATOH8 expression levels in carcinoma tissues

2.2 ATOH8 能夠抑制肺腺癌細胞的增殖能力

將ATOH8 過表達載體或對照組空載體質粒轉染入A549細胞后48 h，實時PCR和Western blotting檢測結果顯示，ATOH8 過表達載體能夠顯著增加ATOH8mRNA和蛋白表達 （P＜ 0.05） （圖2A、2B）。CCK-8檢測結果顯示，ATOH8 過表達能夠顯著抑制A549細胞的增殖能力 （P＜ 0.05），見圖2C。

圖2 ATOH8過表達能夠降低肺腺癌細胞的增殖能力Fig.2 Effect of ATOH8 overexpression on lung adenocarcinoma cell survival

2.3 ATOH8表達水平與肺腺癌患者生存率的關系

TIMER數據庫在線分析結果顯示，ATOH8表達水平較高者5年生存率顯著升高，見圖3。

圖3 ATOH8對肺腺癌患者生存率的影響Fig.3 Effect of ATOH8 expression levels on the survival of patients with lung adenocarcinoma

2.4 miR-125a靶向抑制ATOH8的表達

通過TargetScan預測，ATOH8的3’非翻譯區 （untranslated regions，UTR） 存在多個具有潛在結合能力的miRNA。其中，miR-125a能夠與ATOH8的3’UTR種屬間保守區結合，且結合位點較多，提示miR-125a對ATOH8表達水平存在潛在的調控作用 （圖4A）。因此，本研究將miR-125a 模擬物、抑制物及陰性對照轉染A549細胞后48 h，實時PCR和Western blotting檢測結果顯示，miR-125a模擬物和抑制物能夠分別顯著抑制和促進ATOH8蛋白表達 （P＜ 0.05） （圖4B、4C）。

圖4 miR-125a靶向抑制ATOH8表達水平Fig.4 miR-125a directly inhibits ATOH8 expression levels

2.5 miR-125a與肺腺癌進展密切相關

UALCAN數據庫在線分析結果顯示，miR-125a在肺腺癌中表達水平顯著升高 （P＜ 0.05，圖5A），在吸煙的肺腺癌人群中miR-125a表達水平顯著升高（P＜ 0.05，圖5B）。此外，miR-125a表達水平在中晚期和存在淋巴轉移的肺腺癌中顯著升高 （P＜ 0.05，圖5C、5D）。

圖5 miR-125a在腫瘤組織中表達水平與肺腺癌進展的關系Fig.5 The relationship between miR-125a and lung adenocarcinoma progression

3 討論

轉錄因子也稱為反式作用因子，能夠與DNA 序列直接結合激活或抑制靶基因的表達，在癌癥的發生和發展中具有重要作用［6］。ATOH8是堿性螺旋環螺旋轉錄因子，具有眾多靶基因，在包括乳腺癌、肝癌和結直腸癌在內的多種腫瘤的發生發展中起作用［7-9］。除此之外，ATOH8還能夠與脯氨酸和絲氨酸富集區域結合，調控P53和HEX等多個靶基因［10-11］。本研究發現ATOH8在肺腺癌中顯著上調，且能夠顯著抑制肺腺癌細胞的增殖能力，與肺腺癌患者的5年生存率密切相關。提示ATOH8參與肺腺癌的發生發展，是潛在的抑癌基因，與CHEN等［12］在肝癌中的研究結果一致。然而，ATOH8在肺腺癌中表達失調的機制知之甚少。

miRNA是一類內源性的小RNA，長度約20～24 bp，能夠通過與靶基因的3’UTR結合在轉錄后水平調控基因的表達，在細胞內具有多種重要的調節作用［13］。預測發現miR-125a能夠與ATOH8的3’UTR種屬間保守區結合，且結合位點較多，分子生物學驗證結果顯示miR-125a能夠抑制ATOH8表達水平。研究［14］顯示，miR-125家族成員miR-125a和miR-125b具有促癌和抑癌的雙重作用。在結直腸癌中，miR-125a可通過HIF-1α抑制腫瘤細胞增殖和轉移，發揮潛在的抑癌作用［15］。miR-125a能夠抑制乳腺癌細胞自噬參與腫瘤進展的調控。miR-125a能夠通過GALNT14抑制卵巢癌細胞的惡性增殖和侵襲［16］。然而，有研究［17］發現miR-125a能夠通過p53抑制非小細胞肺癌凋亡。此外，血清中miR-125a表達水平可作為非小細胞肺癌的潛在診斷標志物［18］。本研究發現miR-125a表達水平與吸煙密切相關，且與肺腺癌的增殖和淋巴轉移相關，是ATOH8在肺腺癌中表達失調的原因之一。

綜上所述，本研究發現ATOH8在肺腺癌組織中下調，且能夠抑制肺腺癌細胞的存活能力，是潛在的抑癌基因，參與肺腺癌的發生發展。miRNA是轉錄后調控基因表達水平的重要因子，經預測和鑒定發現miR-125a能夠抑制ATOH8的表達水平，是ATOH8在肺腺癌中表達下調的潛在分子機制。生物信息學分析發現miR-125a受吸煙影響，且與肺腺癌的惡性進展和淋巴轉移相關。但是，miR-125a下游靶基因及其影響的信號通路未被完全揭示，仍需更加深入全面的探討。此外，ATOH8在肺腺癌中的靶基因及參與的信號通路也仍有待進一步研究。