左西孟旦通過PTEN/Akt通路抑制脂多糖引起的C2C12細胞凋亡

張苗苗，劉雨佳，張甦，焦光宇

（1. 中國醫科大學附屬盛京醫院呼吸與危重癥醫學科，沈陽 110004； 2. 遼寧中醫藥大學中醫學院，沈陽 110032）

膿毒癥是一種以全身炎癥反應和組織損傷為特征的臨床綜合征，可導致機體循環衰竭、多器官功能障礙甚至死亡，是全球危重患者死亡的主要原因之一［1］。膿毒癥涉及心臟、肺臟、腎臟、肌肉等全身器官組織。骨骼肌萎縮是膿毒癥嚴重的并發癥之一，膈肌損傷嚴重者可發展為膿毒癥相關膈肌功能障礙 （sepsis-induced diaphragm dysfunction，SIDD），進而危及患者生命［2］。目前，膿毒癥患者膈肌損傷仍然缺乏有效的指南性用藥［3］。

脂多糖 （lipopolysaccharide，LPS） 可促進炎性凋亡因子的產生并抑制抗氧化活性，是導致膿毒癥的主要原因之一。過度凋亡引起的損傷在膿毒癥損傷中起關鍵作用。研究［4］報道，左西孟旦可抑制LPS誘導的膿毒癥大鼠炎癥和細胞凋亡。然而，左西孟旦對LPS誘導的C2C12細胞凋亡損傷的調控機制尚不清楚。有研究［5］證實，左西孟旦可能通過調節第10號染色體磷酸酶和張力蛋白同源物 （phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN） /蛋白激酶B （protein kinase B，Akt） 信號通路來預防阿霉素引起的心臟毒性，PTEN/Akt信號通路是重要的細胞抗凋亡應激防御機制之一［6］。本研究旨在探討左西孟旦對LPS誘導的C2C12細胞凋亡的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

C2C12小鼠成肌細胞 （中國科學院），DMEM高糖培養基 （中國普諾賽生命科技有限公司），胰蛋白酶消化液 （中國碧云天生物技術有限公司），青霉素-鏈霉素溶液 （中國碧云天生物技術有限公司），胎牛血清 （美國Gibco公司），CCK-8 （中國APEBIO公司），左西孟旦 （中國齊魯制藥有限公司），hoechst33342活細胞染色液 （中國碧云天生物技術有限公司），LPS （中國索萊寶生物科技有限公司），PTEN抗體 （英國Biorbyt公司），p-Akt抗體 （中國Abmart公司），AKT抗體 （中國萬類生物科技有限公司），BAX抗體 （中國Abmart公司），Bcl-2抗體 （中國Abmart公司），caspase-3抗體 （中國萬類生物科技有限公司），α-Tubulin抗體 （武漢三鷹生物技術有限公司），山羊抗兔抗體 （武漢三鷹生物技術有限公司），siRNA-PTEN試劑盒 （中國北京合生生物科技有限公司），二氧化碳培養箱 （中國博科生物科技有限公司），離心機 （美國賽默飛科技有限公司），酶標儀 （美國賽默飛科技有限公司），倒置顯微鏡 （日本尼康公司），熒光倒置顯微鏡 （日本尼康公司）。

1.2 C2C12細胞的培養與分組

胎牛血清配置10%高糖培養液培養C2C12細胞，待細胞生長至70%～80%傳代，于80%給予2%馬血清誘導細胞分化。將C2C12細胞依次分為空白對照組 （CON組）、左西孟旦預處理后的對照組 （CON+L組）、LPS處理組 （LPS組） 和左西孟旦預處理后的LPS處理組 （LPS+L組）。CON組C2C12細胞用無血清培養液培養；CON+L組C2C12細胞用左西孟旦預處理24 h；LPS組C2C12細胞用無血清培養液處理24 h，再使用LPS （10 μg/mL） 處理48 h；LPS+L組細胞用左西孟旦預處理24 h，LPS （10 μg/mL） 處理48 h。

1.3 CCK-8法測定C2C12細胞存活率

將C2C12細胞接種在96孔板中，待細胞生長至70%～80%。CCK-8法選擇合適的起保護作用的左西孟旦濃度，分別使用不同濃度的左西孟旦 （0、1、10、20、50、100 μmoL/L） 孵育C2C12細胞24 h。CCK-8法檢測左西孟旦對LPS誘發的C2C12細胞存活率的作用，實驗分組同1.2。待給藥結束，棄去舊的培養液，加入富含10% CCK-8的無血清培養液100 μL，搖晃混勻，在二氧化碳孵箱中培養1～2 h，于酶標儀450 nm處檢測細胞吸光度 （optical density，OD） 并記錄。細胞存活率=處理組OD/未處理組OD×100%。

1.4 Hoechst33342檢測各組C2C12細胞凋亡情況

將C2C12細胞接種至12孔板，待細胞生長至70%～80%，分組給藥，結束后棄去上清液，PBS洗凈，分別加入1 mL培養液，每孔給予10 μL Hoechst33342活細胞染色液混勻，于37 ℃ 5%CO2培養箱中培養10 min，棄含有染料的培養液，用PBS洗滌3次，倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.5 實時PCR檢測PTEN/Akt通路mRNA表達水平

用TRIzol提取RNA并進行逆轉錄，之后在熒光定量PCR儀器上進行擴增，引物序列PTEN-F，5’-AA GACCATAACCCACCACAGC-3’，PTEN-R，5’-ACCA GTTCGTCCCTTTCCAG-3’；Bax-F，5’-GGCGAATTG GAGATGAACTG-3’，Bax-R，5’-AAAGTAGAAGAG GGCAACCA-3’；Bcl-2-F，5’-AGGATTGTGGCCTTCT TTGA-3’，Bcl-2-R，5’-ACCTACCCAGCCTCCGTTAT-3’；caspase-3-F，5’-ACGGTCCTCCTGGTCTTTG-3’，caspase-3-R，5’-TGGCTGGCTGCATTGC-3’；β-actin-F，5’-TGGGAATGGGTCAGAAGGA-3’，β-actin-R，5’-A TTGAGAAAGGGCGTGGC-3’，以β-actin為內參。10 μL反應體系包括2×Taq Pro Universal SYBR q PCR Master Mix 5 μL，上、下游引物 （10 μmol/L） 各0.2 μL，cDNA （50 μg/L） 1.0 μL，滅菌水3.6 μL。引物由北京生物科技有限公司合成。PCR擴增條件為95 ℃預變性5 min，95 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s共40個循環。每組設3個復孔，采用2-ΔΔCt法計算各基因mRNA相對表達量。

1.6 Western blotting檢測PTEN/Akt相關通路蛋白表達水平

使用含有PMSF的RIPA緩沖液提取各組C2C12細胞的總蛋白。等量的蛋白經過12.5%膠分離并轉到PVDF膜上，在無蛋白封閉液中封閉10 min。然后將膜與PTEN、p-Akt、Akt、Bax、Bcl-2、caspase-3和α-Tubulin一抗 （稀釋比例1 ∶1 000） 4 ℃孵育過夜。將與一抗反應過的膜與HRP標記的二抗 （稀釋比例1 ∶6 000） 在室溫下孵育1 h。使用增強型ECL檢測免疫復合物。蛋白質的灰度值使用Image J定量分析。

1.7 siRNA-PTEN敲除PTEN基因，檢測C2C12細胞中PTEN/Akt通路蛋白表達情況

培養C2C12細胞，待細胞生長至70%～80%，隨機分為CON組、LPS組、LPS+siRNA-NC組和LPS+siRNAPTEN組，CON組不做處理，LPS組用10 μg/mL LPS處理48 h，siRNA-NC與siRNA-PTEN轉染至C2C12細胞，6 h換液，24 h后給予10 μg/mL LPS。48 h后收集細胞并提取蛋白。

1.8 統計學分析

采用GraphPad Prism 6.0軟件進行統計分析，分析數據以±s表示，采用單因素方差分析和Tukey’s多重比較方法，P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度左西孟旦對C2C12細胞存活率的影響

分別用0、1、10、20、50、100 μmoL/L的左西孟旦處理C2C12細胞，發現10 μmoL/L左西孟旦對C2C12細胞存活率無明顯影響 （P＞ 0.05），1 μmoL/L左西孟旦可提高細胞存活率 （P＜ 0.05），而20、50、100 μmoL/L左西孟旦可降低細胞存活率 （P＜ 0.05）。本研究選擇1 μmoL/L左西孟旦作為最適的保護用藥濃度進行后續實驗，見圖1。

圖1 不同濃度左西孟旦對C2C12細胞存活率的影響Fig.1 Effect of levosimendan concentration on the survival rate of C2C12 cells

2.2 左西孟旦對LPS誘導的C2C12細胞存活率的影響

CCK-8法檢測細胞存活率，與CON組和CON+L組比較，LPS組細胞的存活率下降為74.41%；與LPS組比較，LPS+L組細胞存活率上升為92.65%，差異有統計學意義 （P= 0.01），見圖2。

圖2 左西孟旦對LPS誘導的細胞存活率的影響Fig.2 Effect of levosimendan on the survival rate of LPS-treated cells

2.3 左西孟旦可減輕LPS誘導的C2C12細胞凋亡

Hoechst 33342染色結果顯示，CON和CON+L組細胞呈暗藍色，說明細胞狀態良好；LPS組部分細胞呈亮藍色，可看到細胞核凝結與核碎裂，表明細胞發生凋亡；LPS+L組亮藍色細胞減少，提示發生凋亡的細胞減少，見圖3。

圖3 左西孟旦對C2C12細胞凋亡的影響 ×200Fig.3 Effect of levosimendan on the apoptosis of C2C12 cells ×200

2.4 左西孟旦對PTEN/Akt信號通路mRNA的影響

與CON組和CON+L相比，LPS組PTEN、Bax與caspase-3mRNA表達量分別較前升高77.07%、261.63%、47.31% （P＜ 0.05）；與LPS組比較，LPS+L組Bax與caspase-3mRNA表達水平較前降低68.65%、52.36%，Bcl-2mRNA表達水平升高117.83% （P＜ 0.05），見圖4。

圖4 左西孟旦對PTEN/Akt信號通路mRNA的影響Fig.4 Effect of levosimendan on the mRNA levels of genes associated with the PTEN/Akt signaling pathway

2.5 左西孟旦對LPS誘導的PTEN/Akt信號通路蛋白的影響

與CON組和CON+L組相比，LPS組PTEN、Bax、caspase-3蛋白表達水平升高，p-Akt與Bcl-2蛋白表達降低 （P＜ 0.05）；與LPS組比較，LPS+L組PTEN、Bax、caspase-3蛋白表達水平降低，p-Akt與Bcl-2蛋白表達水平升高 （P＜ 0.05），見圖5。

圖5 左西孟旦對LPS誘導的C2C12 PTEN/Akt信號通路蛋白的影響Fig.5 Effect of levosimendan on the expression of PTEN/Akt signaling pathway proteins in LPS-treated C2C12 cells

2.6 siRNA-PTEN敲除PTEN基因對PTEN/Akt通路蛋白表達的影響

與CON組相比，LPS組與LPS+siRNA-NC組PTEN、Bax、caspase-3蛋白表達水平升高，p-Akt與Bcl-2蛋白表達降低 （P＜ 0.05）；與LPS組和LPS+siRNA-NC組比較，LPS+siRNA-PTEN組PTEN、Bax、caspase-3蛋白表達水平降低，p-Akt與Bcl-2蛋白表達水平升高 （P＜0.05），見圖6。

圖6 siRNA-PTEN敲除PTEN基因對PTEN/Akt通路蛋白表達的影響Fig.6 Effect of siRNA-PTEN knockdown on the expression of PTEN/Akt pathway proteins

3 討論

膿毒癥可誘發膈肌發生凋亡，然而其通路和機制尚未完全明確。本研究結果顯示，在體外左西孟旦可靶向PTEN抑制LPS誘導的C2C12細胞凋亡。

膿毒癥被定義為機體因感染而失控的宿主反應所致的危及生命的器官功能障礙。治療手段主要包括抗感染、血流動力學管理與機械通氣等［7］，然而臨床上并沒有治療膈肌的指南性藥物［8-9］。左西孟旦是一種鈣增敏劑，主要通過在肌肉激活過程中穩定鈣和肌鈣蛋白復合物之間的相互作用發揮增強肌力的作用。除此之外，左西孟旦還有抗氧化、調節免疫與抑制凋亡的作用。有研究［10］表明，左西孟旦預處理可提高部分肝切除術后膿毒癥大鼠的存活率，這與其抑制肝細胞中誘導型一氧化氮合酶的生成相關。左西孟旦會影響通氣的膿毒癥小鼠膈肌的氧化和炎癥通路［4］，還可減輕膿毒癥大鼠凝血功能障礙和器官功能障礙［11］。然而左西孟旦減輕膈肌細胞凋亡的具體信號通路尚未明確。研究［12-13］表明，左西孟旦可以通過清除自由基以及與線粒體相關的凋亡通路，保護心肌細胞免受高半胱氨酸誘導的氧化應激和細胞凋亡；左西孟旦可能通過調節PTEN/Akt信號通路來預防阿霉素引起的心肌凋亡。C2C12成肌細胞與心肌細胞同屬肌肉細胞，因此預測左西孟旦也可通過PTEN/Akt通路起到抗C2C12細胞凋亡的作用。

PTEN是一種具有磷酸酶活性的腫瘤抑制分子，通過結合配體進一步激活胞內PI3K，PI3K/Akt是細胞中一條關鍵的信號通路，廣泛參與細胞增殖、分化及凋亡的各個過程，是維持細胞生長、發育和凋亡的重要機制之一［14-17］。PTEN缺失可增加Akt的磷酸化并阻斷Akt調控的下游信號事件，從而避免相關凋亡通路的激活，保護細胞免于凋亡。活化的 Akt能夠通過磷酸化抗凋亡蛋白 （如Bcl-2）、抑制Bcl-2相關X蛋白 （Bcl-2 associated X protein，Bax） 與Bax形成異二聚體，進而抑制線粒體釋放凋亡因子及細胞色素C，減少caspase家族活化，最終有效阻斷細胞凋亡［18-19］。

本研究通過CCK-8、Hoechst33342活細胞染色法、實時PCR與Western blotting分別檢測了LPS誘導C2C12細胞損傷情況下細胞存活率、細胞凋亡率、凋亡相關指標的情況。結果顯示，左西孟旦可以降低LPS誘導后C2C12細胞的凋亡率。siRNA-PTEN敲除PTEN基因，凋亡通路被抑制進而對C2C12細胞起到抗凋亡的作用。綜上所述，左西孟旦可以通過PTEN/Akt通路抑制LPS引起的C2C12細胞凋亡，這為左西孟旦治療膿毒癥相關膈肌功能障礙提供了可能性。