血清糖蛋白非轉移性黑色素瘤蛋白B對表皮生長因子受體擴增伴隨突變的非小細胞肺癌預后的預測作用

劉邦卿，李劍鋒，劉曉輝，張勁男，胡亞麗

（唐山市人民醫院 1. 胸外二科； 2. 頭頸外科，河北 唐山 063001）

非小細胞肺癌 （non-small cell lung cancer，NSCLC）是一種高發的惡性腫瘤［1］。表皮生長因子受體 （epidermal growth factor receptor，EGFR） 是NSCLC臨床研究中最受關注且最重要的靶點［2］。近年來，臨床相關資料表明EGFR在多種腫瘤中過表達，EGFR的擴增伴隨突變是主要的突變類型之一［3］，激活EGFR能夠引起腫瘤細胞內的酪氨酸活化及其受體磷酸化，促進腫瘤細胞增殖、分化以及血管生成等過程，加速腫瘤細胞的惡性進展［4］。

研究［5-6］表明，酪氨酸激酶抑制劑 （EGFR-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI） 在EGFR基因突變的NSCLC治療中效果顯著。此外，越來越多的研究［7］表明NSCLC患者的EGFR基因突變類型和患者對EGFR-TKI的應答情況顯著相關。隨著腫瘤患者臨床治療中EGFR-TKI的利用率日益增高，耐藥問題成了亟需解決的難題。挖掘EGFR-TKI耐藥標志物和篩選適用EGFR-TKI治療的NSCLC患者，實現個體化治療，是改善臨床治療效果、延長患者生存期的關鍵。

糖蛋白非轉移性黑色素瘤蛋白B （glycoprotein non‐metastatic melanoma protein B，GPNMB）是一種高度糖基化的Ⅰ型跨膜糖蛋白，作為腫瘤細胞生長的調節基因而備受關注［8］。在不同的腫瘤中，GPNMB高表達都被證實能夠促進腫瘤的惡性進展，例如，GPNMB的表達水平越高，乳腺癌細胞的增殖遷移侵襲能力越強，神經膠質瘤和小細胞肺癌患者的生存時間越短，生存狀況越差［9-11］。最新研究［12］指出，GPNMB的表達水平可能和胃腸道惡性腫瘤患者EGFR-TKI治療后的耐藥有關。也有研究［13］表明，GPNMB在EGFR突變NSCLC細胞中表達水平的變化與NSCLC的進展相關，但系統性的研究尚未見報道。

本研究選擇將EGFR-TKI作為一線治療的EGFR基因擴增伴隨突變的NSCLC患者作為研究對象，檢測其血液中游離GPNMB的表達水平，探討其與患者耐藥及預后的相關性。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取2018年3月至2019年9月唐山市人民醫院收治的143例病理確診為NSCLC患者的臨床資料。利用ctDNA檢測和FISH法篩選EGFR擴增伴隨突變的NSCLC患者，排除資料不全和合并其他腫瘤者，最終納入55例患者作為觀察組。患者均以EGFR-TKI （奧希替尼） 作為一線治療，且未接受過局部治療。收集患者血液樣本和臨床資料。此外，隨機收集同期本院體檢中心的健康人群血液樣本作為對照組。所有研究對象均簽署了知情同意書，本研究獲得醫院倫理委員會批準。

1.2 血液中游離GPNMB檢測

2組血液樣本均置于EDTA管并于-80 ℃保存。使用人GPNMB的ELISA商品化試劑盒 （美國ELHOsteoactivin，RayBiotech公司）對血液樣本中游離的GPNMB進行定量分析，操作均按照試劑盒說明書進行。

1.3 隨訪

對觀察組患者進行隨訪。記錄患者應用EGFRTKI的療效。本研究通過療效評價患者的耐藥情況，根據實體瘤療效評價標準［14］，EGFR-TKI臨床療效分為部分緩解 （partial response，PR）、疾病穩定 （stable disease，SD） 和疾病進展 （progressive disease，PD）。收集患者出院后的隨訪資料，記錄患者的無進展生存時間 （progression free survival，PFS），將患者的PFS作為本研究的主要終點事件。

1.4 統計學分析

采用SPSS 26.0和Graphpad Prism 8.4.2軟件進行統計分析。計數資料以例 （率） 表示，組間比較采用Fisher精確概率法或χ2檢驗。計量資料首先進行正態和方差齊性檢驗，所有正態分布的計量資料以±s表示，組間比較采用雙側t檢驗。患者PFS的生存分析采用Kaplan-Meier法和log-rank檢驗，采用多因素Cox回歸分析篩選影響患者生存的獨立危險因素。P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 EGFR擴增伴隨突變NSCLC患者血液中游離的GPNMB的表達水平

血液中游離的GPNMB表達水平對照組為 （1.49±0.61） ng/mL，觀察組為 （3.09±0.88） ng/mL。根據觀察組中GPNMB表達水平的中位值 （3.13 ng/mL），將EGFR擴增伴隨突變的NSCLC患者分為高表達組 （n= 27） 和低表達組 （n= 28）。隨后，對GPNMB表達和EGFR擴增伴隨突變NSCLC患者臨床病理信息的相關性進行探究。結果顯示，在所有EGFR擴增伴隨突變NSCLC患者中，女性 （32例）居多，33例患者存在吸煙史，臨床分期均為Ⅲ期～Ⅳ期，組織分型以肺腺癌 （37例）為主。GPNMB高表達組和低表達組年齡、性別、體質量指數 （body mass index，BMI）、ECOG評分、臨床分期、組織分型以及吸煙史比較均無統計學差異（均P＞0.05），見表1。

表1 觀察組GPNMB表達與各項臨床指標的相關性Tab.1 Correlation between GPNMB expression and the clinical data in the observation group

2.2 GPNMB表達水平和EGFR擴增伴隨突變NSCLC患者耐藥的相關性

高表達組中4例為PR，7例為SD，16例為PD；低表達組中7例為PR，15例為SD，6例為PD。2組療效比較有統計學差異 （P= 0.016），低表達組患者使用EGFR-TKI治療療效更優，見表1。2組患者的客觀反應率 （objective response rate，ORR） 比較，差異有統計學意義 （4/27 vs. 7/28，P＜ 0.01）。患者血液中游離GPNMB高表達可能提示耐藥程度更強，對于EGFRTKI治療的敏感性更差。

2.3 GPNMB表達水平和EGFR擴增伴隨突變NSCLC患者預后的相關性

觀察組隨訪時間為1.2～18.7個月，平均11.58個月。隨訪結果顯示，GPNMB高表達組患者的中位PFS為7.38個月 （95%CI：0.9～12.5），GPNMB低表達組患者的中位PFS為9.92個月 （95%CI：5.3～14.7）。Kaplan-Meier生存曲線結果顯示，GPNMB高表達組患者的PFS顯著短于低表達組 （P= 0.032），見圖1。加入GPNMB表達對患者進行分層生存分析，結果顯示，女性 （P= 0.009）、非腺癌 （P＜ 0.001）、從未吸煙 （P=0.006）、ECOG評分為1 （P＜ 0.001）、臨床分期為Ⅳ期（P= 0.009） 患者的PFS和GPNMB表達水平顯著相關。

圖1 不同GPNMB表達NSCLC患者的PFS曲線Fig.1 PFS curve of NSCLC patients with different GPNMB expression

2.4 GPNMB表達水平是EGFR擴增伴隨突變NSCLC患者無進展生存的獨立危險因素

通過Kaplan-Meier法進行患者生存分析，采用log-rank檢驗所有自變量與因變量的關系，結果顯示，性別 （P= 0.008）、吸煙史 （P= 0.009）、ECOG評分（P= 0.002）、臨床分期 （P= 0.009）、組織類型 （P= 0.002）是患者生存可能的影響因素。隨后，將GPNMB表達分組和性別、組織類型、吸煙史、ECOG評分以及臨床分期等因素納入多因素Cox回歸分析。結果顯示，血液中游離的GPNMB高表達 （HR= 4.029，95%CI：1.942～8.358，P＜ 0.001） 是影響EGFR擴增伴隨突變NSCLC患者無進展生存的獨立危險因素。見表2。

表2 NSCLC患者無進展生存影響因素的多因素Cox回歸分析Tab.2 Multi-factor Cox regression analysis of progression-free survival in NSCLC patients

3 討論

NSCLC患者的血液樣本含有多種游離蛋白［15-16］。NAKASHIMA-NAKASUGA等［17］使用ELISA方法檢測結直腸癌患者血清樣本中LOX-1的蛋白表達，發現LOX-1與結直腸癌的預后顯著相關。本研究應用ELISA方法檢測了EGFR擴增伴隨突變NSCLC患者血清中的GPNMB蛋白表達，發現GPNMB表達與患者預后以及耐藥性顯著相關。

HAN等［13］研究發現GPNMB與腫瘤的EGFR突變呈正相關，且在EGFRL858R突變的NSCLC細胞中過表達。GPNMB糖基化可以激活突變的EGFR，開啟下游STAT3信號通路，促進NSCLC細胞轉移。本研究也發現EGFR擴增伴隨突變NSCLC患者血清GPNMB顯著高表達。根據GPNMB表達水平對EGFR擴增伴隨突變NSCLC患者進行分組，并評價GPNMB與耐藥性的關系。發現GPNMB高表達與EGFR-TKI的療效顯著相關。以上研究表明，GPNMB與腫瘤EGFR突變有關，且在EGFR擴增伴隨突變NSCLC患者中高表達，并增強其耐藥性。

GPNMB與腫瘤患者的預后密切相關［18］。FENG等［10］發現GPNMB與膠質瘤不良預后密切相關。MA等［16］研究證實GPNMB的過表達預示著上皮性卵巢癌的不良預后。本研究對EGFR擴增伴隨突變NSCLC患者進行生存分析，發現血液中游離GPNMB高表達患者的PFS顯著縮短。進一步分層生存分析和多因素Cox回歸分析發現，GPNMB高表達不利于患者無進展生存，且是影響EGFR擴增伴隨突變NSCLC患者無進展生存的獨立危險因素。以上結果表明，血液中游離GPNMB表達水平可作為EGFR擴增伴隨突變NSCLC患者預后標志物；GPNMB高表達與患者預后不良顯著相關，并對患者的生存狀況產生顯著影響。

綜上所述，EGFR擴增伴隨突變NSCLC患者血液中游離GPNMB高表達，其高表達與患者的耐藥程度增強密切相關，是潛在的耐藥標志物。與此同時，本研究也證實GPNMB高表達和患者的預后不良顯著相關，是影響患者生存的獨立危險因素。本研究樣本量較少，患者僅來自同一醫院，未來應納入更多樣本量進行多中心深入研究。