紅景天苷對血管生成及骨血管偶聯的影響

祁 琳,韓鑫羽,祁 璐,王 越,張 磊

目前,體育運動成為人們緩解壓力的主要方式,但隨著運動強度不斷增加,運動傷的發生率也有升高趨勢,嚴重影響生活質量。運動訓練傷包括器官損傷、骨關節損傷、軟組織損傷三種類型,以骨關節損傷最為常見[1]。運動骨關節損傷多發生在膝關節、腰部、肩胛部和上肢[2]。骨組織血供豐富,血管生成和骨形成有相互偶聯作用,在骨形成過程中,新骨形成需要血管提供養分,舊骨的代謝產物也需要血管輸送至體外,所以骨重建與血管生成密切相關[3,4],因此關于骨代謝和骨再生的研究具有重要意義。藏藥紅景天為景天科多年生草本植物,具有滋補強身、理氣養血、補腎、扶正固本等多種功效。紅景天苷為紅景天的關鍵活性成分,已有研究表明,紅景天苷能促進成骨細胞分泌血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)促進血管生成和骨形成[5,6]。但關于紅景天苷在骨血管偶聯中作用的研究尚未見報道,本研究探討紅景天苷在骨血管偶聯中發揮的作用,以期為臨床應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 選取純度為99.9%的紅景天苷(中國藥品生物制品檢定所);DMEM高糖培養液(美國GIBCO公司);ECM(美國Sciencell公司);胎牛血清FBS(蘭州民海生物科技公司);青鏈霉素混合液及胰蛋白酶(北京鼎國生物科技公司);DMSO(天潤善達生物科技公司);EDTA、von Willebrand factor(vWF)抗體、Ⅰ型膠原酶及HEPES(美國Sigma公司);PE 標記的 VEGFR2 流式抗體及Matrigel膠(美國BD 公司);MTS 細胞增殖與毒性檢測試劑盒(上海貝博生物科技公司);重組人內皮細胞生長因子 rhVEGF(美國R&D 公司);貝伐珠單抗注射液Avastin(瑞士Roche 公司);CD31(美國abcam公司);二氨基聯苯胺鹽酸鹽DAB及SP通用試劑盒(北京中杉金橋生物公司)。主要儀器:酶標儀(美國Bio-Rad公司);IX71倒置式研究型顯微鏡(OLYMPUS公司);SW-CJ-1F醫用型潔凈工作臺(蘇州安泰技術公司);FC 500 MCL/MPL流式細胞儀(美國貝克曼)。

1.2 實驗細胞 人成骨樣細胞細胞系MG-63(美國ATCC公司產品,購自武漢大學中國典型培養物保藏中心);人臍靜脈融合細胞細胞系EA.hy926(為美國ATCC公司產品,購自中國科學院細胞庫典型培養物保藏中心);人臍靜脈內皮原代細胞HUVEC提取自人臍帶。該研究經武警特色醫學中心倫理委員會批準。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養 MG-63及EA.hy926細胞采用含10% FBS的高糖DMEM培養液進行培養。

1.3.2 HUVEC的分離、培養與鑒定 (1)HUVEC 的分離、培養:取出臍帶,PBS漂洗后將其放于平皿內,選取輸液器管插入臍靜脈后扎緊。將Ⅰ型膠原酶加入臍靜脈后夾緊,按壓臍靜脈使內皮細胞脫落,收集入離心管中。向臍靜脈內推注、抽吸PBS,洗脫內皮細胞,轉移至上述離心管內。重復上述步驟,轉移至培養瓶內,37 ℃,5% CO2培養。(2)檢測HUVEC細胞vWF的表達:將HUVEC接種于24孔板中,用4%多聚甲醛溶液固定,加入0.1% Triton-100作用15 min,用PBS清洗,加入BSA 封閉30 min;加入vWF一抗,37 ℃孵育30 min,室溫孵育1 h,漂洗。加入FITC標記的熒光二抗100 μl,室溫避光孵育30 min,清洗。熒光顯微鏡下觀測并拍照記錄。(3)檢測HUVEC細胞VEGFR2 的表達:取對數生長期的HUVEC,將細胞懸液加入兩個無菌EP管內,離心棄上清,加入 FACS洗液;一管加入熒光標記的抗體,另一管加入FACS 洗液作對照,避光孵育30 min。用FACS洗液清洗后離心棄上清,加入300 μl 的FACS洗液,用濾膜轉至流式管內,用流式細胞儀檢測;使用FACS分析儀 Winmdi 程序分析。

1.3.3 收集MG-63條件培養液 取對數生長期的MG-63細胞,接種于6孔板中,24 h后,更換為含1% FBS高糖的DMEM培養液同步化;實驗分組:對照組、10 nmol/L紅景天苷預處理組、100 nmol/L 紅景天苷預處理組,每組設2個復孔,加藥作用48 h后收上清,1500 r/min離心10 min,作為條件培養液備用。

1.3.4 MTS法檢測條件培養液對血管內皮細胞增殖的影響 取對數生長期的血管內皮細胞,接種于96孔板中,24 h后,更換為含1% FBS高糖的DMEM培養液同步化,加入條件培養液作用48 h。實驗分組:對照組、條件培養液對照組、10 nmol/L 紅景天苷組、100 nmol/L 紅景天苷組,每組設5個復孔。條件培養液作用結束前4 h避光加入100 μl的10% MTS,孵育4 h后,記錄酶標儀測波長在492 nm的OD值。

1.3.5 Transwell小室遷移實驗檢測條件培養液對血管內皮細胞遷移能力的影響 取對數生長期的MG-63細胞,接種于Transwell小室下室內,同步化后藥物作用48 h。48 h后每孔保留150 μl上清液。取對數生長期的血管內皮細胞,調整細胞濃度為5×105/ml,以200 μl/室的量接種于Transwell小室上室內;從Transwell小室側面往下室內加入450 μl含1.3% FBS的DMEM高糖培養液,使FBS濃度至1%,培養8 h;棄去上室殘留培養液,PBS漂洗后將上室置于4%中性甲醛內固定15 min,PBS漂洗;伊紅染色3 min,PBS清洗,棉簽拭去上室細胞;將Transwell小室置于200倍顯微鏡下拍照并計數,記錄膜上、下、左、右、中間5個視野的細胞,取平均值。

1.3.6 Matrigel管腔形成實驗檢測條件培養液對血管內皮細胞管腔形成的影響 將Matrigel膠加入預冷的96孔板內,輕柔晃動96孔板,37 ℃孵育1 h;取對數期生長期的HUVEC細胞,用無血清ECM培養液混懸細胞,調整細胞濃度至2×105/ml,100 μl/孔加至鋪好Matrigel膠的96孔板中;對照組加入33 μl無血清的ECM培養液,其他組加入33 μl對應條件的培養液,設2個復孔,CO2培養箱中培養8 h 后在100倍顯微鏡下拍照,每孔取5個視野,并記錄管腔長度。

1.3.7 胎鼠跖骨血管生成試驗評估紅景天苷對骨血管偶聯的影響 胎鼠跖骨的提取及培養:選取孕期(E17.5d)的小鼠,注射2.5% Avertin(阿弗丁)0.012～0.018 ml/g腹腔內注射麻醉,75%乙醇消毒;剖腹取出生前1 d(E17.5 d)的胎鼠,75%乙醇消毒;用顯微外科剪刀及鑷子剪開皮膚并分離四肢的3個跖骨,用含雙抗的PBS沖洗;用含10% FBS的α-MEM 培養液培養3 d,用100 nmol/L的紅景天苷或重組的人VEGF(10 ng/ml)作用3 d,培養10 d。胎鼠跖骨的免疫組化染色:將跖骨在甲醛內固定20 min,PBS漂洗;3% H2O2處理15 min,PBS漂洗;使用血清封閉液封閉20 min;4 ℃條件下,一抗孵育過夜,PBS漂洗;二抗孵育20 min,PBS漂洗;辣根酶標記的鏈霉親和素過氧化物酶孵育30 min,PBS漂洗;DAB顯色,鏡下觀察顯色情況,蘇木精復染15～30 s,流水沖洗。

1.3.8 Avastin阻斷實驗 除取紅景天苷作用最明顯的劑量組(100 nmol/L 紅景天苷)加上抗VEGF抗體Avastin和同種型IgG外,其他方法同上。

2 結 果

2.1 HUVEC細胞的提取、培養及鑒定 光鏡觀察發現,HUVEC細胞貼壁生長,呈梭形鋪路石狀,邊界清晰,細胞核呈圓形或橢圓形,屬于臍靜脈內皮細胞的形態(圖1A)。免疫熒光法檢測HUVEC細胞vWF的表達,基本所有細胞都表達vWF(圖1B)。流式細胞術檢測 HUVEC細胞VEGFR2為陽性表達(圖1C),提取的細胞為臍靜脈內皮細胞。

圖1 臍靜脈內皮細胞的鑒定A.HUVEC細胞形態(×100光鏡觀察); B. 免疫熒光法檢測HUVEC細胞中的vWF; C. 流式細胞術檢測HUVEC表面VEGFR2 的表達。

2.2 對血管內皮細胞增殖能力的影響 由MTS結果可見,與對照組相比,條件培養液組的HUVEC與EA.hy926細胞增殖活性顯著提高(P<0.01),與條件培養液組相比,10、100 nmol/L 紅景天苷的條件培養液組內皮細胞增殖活性顯著升高(P<0.01,表1)。為進一步探究紅景天苷是否通過影響條件培養液中VEGF的表達而促進血管內皮細胞的增殖,采用Avastin與同種型IgG進行阻斷實驗,MTS結果顯示,100 nmol/L 紅景天苷組條件培養液對HUVEC與EA.hy926細胞的促增殖作用能被Avastin部分阻斷(P<0.01,表2),而同種型IgG抗體無此作用。

表1 紅景天苷條件培養液對血管內皮細胞增殖能力的影響

表2 經Avastin阻斷后紅景天苷條件培養液對血管內皮細胞增殖能力的影響

2.3 條件培養液對血管內皮細胞遷移能力及管腔形成能力的影響 采用Transwell小室實驗評估條件培養液對HUVEC與EA.hy926細胞遷移能力的影響,Matrigel管腔形成實驗用于評估條件培養液對HUVEC細胞管腔形成能力的影響。結果可見,與正常對照組相比,條件培養液組血管內皮細胞遷移數量及管腔長度顯著增加(P<0.05),與條件培養液組相比,100 nmol/L 紅景天苷組血管內皮細胞遷移數量及管腔長度顯著提高,經Avastin阻斷后, 紅景天苷組對血管內皮細胞的促遷移能力及促管腔形成能力顯著降低,差異均有統計學意義(P<0.01,表3),而同種型IgG 抗體無此作用。

表3 紅景天苷對血管內皮細胞遷移數量、管腔長度的影響及經Avastin阻斷后的對比

2.4 紅景天苷對胎鼠跖骨血管生成能力的影響 為進一步研究紅景天苷在骨-血管形成偶聯中的作用,提取孕鼠的胎鼠跖骨進行培養,與對照組血管內皮細胞出芽面積[(0.14±0.02)mm2]相比,紅景天苷組[(0.28±0.01)mm2]和VGEF組[(0.47±0.02)mm2]的出芽面積明顯增大,差異有統計學意義(P<0.01),其中以VGEF組出芽面積最大。但經Avastin阻斷后的出芽面積[(0.17±0.02)mm2]顯著降低,差異有統計學意義(P<0.01),而同型IgG抗體組[(0.26±0.03)mm2]無此作用。

3 討 論

骨組織內豐富的血管能夠為骨的發育、修復及再生提供必要的營養和氧氣。有研究發現,H型血管廣泛分布于骨內膜和干骺端附近的骨小梁表面,在受傷初期,H型血管集中匯集于受損部位,表明骨形成和血管生成相偶聯[7,8]。本研究擬在前期研究的基礎上,以內皮細胞HUVEC、EA.hy926與人成骨樣細胞MG-63共同培養為研究模型,探究紅景天苷對血管生成及骨血管偶聯的影響。

血管生成是指在原血管的基礎上通過內皮細胞的出芽、增殖與遷移形成新血管的過程。目前,在細胞模型上通常通過檢測細胞的增殖、遷移及管腔的形成能力來評估藥物的促血管生成能力[9]。本研究分別采用了MTS實驗、Transwell小室遷移實驗及Matrigel管腔形成實驗,對紅景天苷作用后MG-63細胞培養上清對內皮細胞增殖、遷移及管腔形成能力的影響進行評估。本研究結果發現,條件培養液對照組可促進血管內皮細胞的增殖、遷移及管腔形成,與條件培養液對照組相比,紅景天苷作用后的MG-63細胞條件培養液能促進血管內皮細胞的增殖、遷移及管腔形成。本研究通過胎鼠跖骨血管生成實驗探究紅景天苷對胎鼠跖骨血管生成能力的影響,結果顯示,紅景天苷和VGEF能促進胎鼠跖骨的血管生成,表明紅景天苷和VGEF具有促骨血管偶聯能力,這與文獻[10]的研究結果一致。

VEGF是調控血管內皮細胞功能的生長因子,能促進血管內皮細胞有絲分裂、促進血管內皮細胞遷移,在誘導血管生成和側支血管形成方面發揮重要作用[11-13]。最近的一項研究發現,VEGFA能促進肺癌細胞的增殖、凋亡及血管生成,抑制VEGFA后能顯著抑制肺癌細胞的增殖及血管新生[14]。孫春燕等[15]研究表明,芩梔豬膽方通過上調大鼠海馬組織中VEGFA、VEGFR2的表達促進血管新生,治療血管性癡呆大鼠模型。另有研究發現,紅景天苷可通過上調心肌組織中VEGF等因子的表達水平,緩解心肌缺血小鼠的心肌重構[16]。因此,我們推測紅景天苷可能通過促進成骨細胞分泌VEGF間接促進血管內皮的血管生成。本研究結果顯示,Avastin阻斷后能顯著減弱100 nmol/L 紅景天苷組條件培養液對內皮細胞的促增殖、促遷移及促管腔形成能力,表明紅景天苷可通過促進成骨細胞分泌VEGF間接促進血管生成。另外,Avastin阻斷后胎鼠跖骨的血管生成能力也顯著下降,證明紅景天苷通過上調胎鼠跖骨組織中VEGF的表達,對促進骨血管偶聯有作用。有研究表明,VEGF的上游調控基因低氧誘導因子1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)是骨骼修復過程中偶聯成骨和血管生成的一個關鍵因子[17], 紅景天苷能夠降低HIF-1α的降解,顯著上調HIF-1α的蛋白表達水平[18]。因此,筆者推測紅景天苷與HIF-1α/VEGF信號通路促進骨血管偶聯有一定相關性。

本研究結果表明,紅景天苷是一個較好的促血管生成藥物單體,能促進骨血管偶聯。但本研究僅從體外模型對紅景天苷促血管生成與促骨血管偶聯能力進行驗證,下一步將對紅景天苷的體內模型及臨床驗證進行研究。