血清miR-155-5p和miR-146b-5p與繼發性急性髓系白血病染色體畸變及預后的關系

嚴學倩,劉 利,及月茹,秦煒煒,肖 方,陳 怡

繼發性急性髓系白血病(secondary acute myeloid leukemia,sAML)是一種從既往血液病和其他暴露于細胞毒性藥物的惡性腫瘤演變而來的AML[1],緩解率更低,預后更差[1,2]。細胞遺傳學分析表明,染色體畸變與AML的發作、復發以及sAML疾病進展有關[3,4]。因此,探索更多與sAML患者染色體畸變和預后相關的潛在生物標志物對臨床醫師制定更有效的監測和治療方案具有重要意義。微小RNA(microRNAs,miRNA)是一種短的(21～23個核苷酸)非編碼RNA,主要通過與靶信使RNA的3′非翻譯區結合來調節基因表達[5]。越來越多的研究表明,miRNA是sAML進展和預后預測的重要指標[6]。miR-155-5p是一種促炎性致癌miRNA,參與各種生理過程,包括造血、免疫和細胞譜系分化[7]。研究表明,miR-155-5p可以通過靶向Casitas B系淋巴瘤原癌基因(casitas B lymphoma proto-oncogene,CBL)促進急性淋巴細胞白血病的發展[8]。miR-146b-5p已被證明在幾種類型的癌癥中異常表達,在不同腫瘤的進程中發揮促癌或者抑癌等截然不同的作用[9,10]。最近有研究發現miR-146b-5p與急性淋巴細胞白血病細胞遷移和侵襲有關[11]。但是,目前關于血清miR-155-5p和miR-146b-5p在sAML中的作用尚未見報道。因此,本研究分析了血清miR-155-5p和miR-146b-5p在sAML患者中的表達,旨在探討它們與sAML染色體畸變及預后的關系。

1 對象與方法

1.1 對象 選擇2017-05至2020-04我院血液內科接受治療的26例sAML患者作為研究對象,其中男13例,女13例,年齡20～77歲。納入標準:(1)年齡在18歲以上;(2)符合世界衛生組織2016年關于AML的診斷標準[12],并且根據先前的骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndrome,MDS)、骨髓增殖性疾病(myeloproliferative neoplasm,MPN)及其他惡性血液系統疾病、骨髓衰竭類疾病或實體瘤患者且既往接受過細胞毒性藥物治療及其他放化療后形成的AML(即治療相關性AML)確診為sAML;(3)進行染色體畸變檢查。排除標準:(1)合并其他惡性腫瘤;(2)嚴重免疫抑制、先天性或獲得性免疫缺陷綜合征;(3)終末期肝、腎疾病;嚴重心腦血管疾病;(4)中樞神經系統白血病;(5)失訪、臨床資料缺失。另根據年齡(±3歲)和性別相匹配原則1∶1比例納入25名同期在醫院進行體檢的健康人作為健康對照組(男13例,女12例,年齡21～79歲),該組受試者年齡、性別與sAML組比較無統計學差異(P>0.05)。本研究經醫院倫理委員會批準,收集血清樣本前已獲得所有受試者的知情同意。

1.2 方法

1.2.1 一般資料 收集所有sAML患者的基線臨床資料,包括人口統計學信息(年齡、性別)、既往血液病、FAB分型、染色體核型及實驗室指標。通過美國貝克曼DxH 900血液分析儀檢測紅細胞計數(red blood cell count,RBC)、白細胞計數(white blood cell count,WBC)、血小板計數(platelet count,PLT)、淋巴細胞計數(lymphocyte count,LYM)、單核細胞計數(monocyte count ,MONO)、中性粒細胞計數(neutrophil count,NEU)、血紅蛋白(hemoglobin,Hb)。通過貝克曼AU5800型全自動生化分析儀檢測乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)、超敏C反應蛋白(hypersensitive C-reactive protein,hs-CRP)。國際人類細胞遺傳命名系統[13]用于核型分析。根據患者染色體核型將sAML參與者分為兩組:染色體正常組(染色體數目和結構正常)和染色體畸變組(染色體數目或結構異常)。

1.2.2 檢測miR-155-5p及miR-146b-5p水平 入院24 h內采集所有患者外周血樣本,4 ℃下離心(3000 r/min)15 min,獲得血清樣本,并保存在-80 ℃。采用miRcute miRNA分離試劑盒(中國天根生化科技有限公司)從血清中分離miRNA。使用miRcute增強型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒(中國天根生化科技有限公司)進行反轉錄。對于miRNA表達檢測,采用Taqman miRNA測定法定量miRNA的表達水平,反應在7500 Fast實時熒光定量PCR系統(美國Applied Biosystems)中進行,反應總體積為20 μl(10 μl 2×miRcute增強型miRNA預混劑,0.4 μl正向引物,0.4 μl反向引物,0.4 μl cDNA, 8.8 μl Nuclease-Free Water),反應過程為95 ℃下孵育30 s,然后進行40個循環(95 ℃ 8 s,60 ℃ 30 s)。這些實驗至少重復3次。采用2-ΔΔCt法測定miR-155-5p和miR-146b-5p的相對表達量,通過cel-miR-39歸一化。引物序列:miR-155-5p(F)為5′-TTAATGCTAATTGTGAT-3′、(R)5′-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3′;miR-146b-5p(F)5′-ACTGAATTCCATGGGTGTGTGTC-3′、(R)5′-TGACAGAGATATCCCAGCTGAAG-3′;cel-miR-39(F)5′-GAGCCCAGCTGATTTCGTCT-3′、(R)5′-GCCAAGCTGATTTACACCCG-3′。

1.3 治療及隨訪 根據患者病情嚴重程度和耐受情況,所有患者接受強化化療(如阿糖胞苷和柔紅霉素7+3)、非強化化療(如阿糖胞苷和氟達拉濱)或低甲基化藥物(地西他濱)聯合其他治療方案進行治療。患者隨訪通過電話或門診訪談進行,隨訪截止時間為2022年6月或患者死亡。總生存(overall survival,OS)期定義為從sAML診斷到死亡或最后一次隨訪之間的時間間隔。

1.4 統計學處理 使用SPSS26.0軟件處理數據,二分類變量以率或構成比表示,并進行χ2檢驗。偏態分布數據以中位數和四分位數間距(inter quartile range,IQR)表示,并進行Mann-WhitneyU分析。采用二元Logistic回歸模型確定染色體畸變風險的獨立影響因素。采用受試者工作特征(receiver operatingcharacteristic,ROC)曲線分析血清miR-146b-5p和miR-155-5p水平在sAML診斷和染色體畸變風險預測中的應用價值。通過COX回歸模型以及Kaplan-Meier曲線分析血清miR-146b-5p、miR-155-5p水平與預后的關系,并進行Log-Rank檢驗。所有檢驗均為雙側檢驗,差異有統計學意義為P<0.05。

2 結 果

2.1 血清miR-155-5p和miR-146b-5p對sAML的診斷效能 sAML組患者血清miR-155-5p顯著高于健康對照組[4.69(1.87,30.83)vs.1.13(0.79,1.78),Z=-4.070,P<0.001],而血清miR-146b-5p水平顯著低于健康對照組[1.79(1.55,2.44)vs.3.02(2.58,3.43),Z=-4.561,P<0.001]。血清miR-155-5p診斷sAML的ROC曲線下面積(AUC)為0.832(95%CI:0.714～0.951),最佳截斷值為2.61,靈敏度和特異度分別為73.16%和96.00%;miR-146b-5p診斷sAML的AUC為0.871(95%CI:0.775～0.967),最佳截斷值為2.37,靈敏度和特異度分別為88.01%和76.92%;二者聯合可使診斷AUC達到0.922(95%CI:0.846～0.997),靈敏度為76.98,特異度為96.06,見圖1。

圖1 血清miR-155-5p和miR-146b-5p診斷sAML的ROC曲線

2.2 染色體正常組和染色體畸變組臨床資料比較 兩組患者年齡、性別、AML前病史、FAB分型、RBC、WBC、PLT、LYM、MONO、NEU、Hb、hs-CRP等資料比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。但染色體畸變組患者LDH水平顯著高于染色體正常組(P<0.05,表1)。

表1 繼發性急性髓系白血病兩組患者臨床資料比較

2.3 血清miR-155-5p、miR-146b-5p識別sAML患者染色體畸變的臨床價值(圖2) 染色體畸變組sAML患者血清miR-155-5p顯著高于染色體正常組[19.26(4.45,46.65)vs.1.51(0.79,3.27),Z=-3.585,P<0.001],而血清miR-146b-5p水平顯著低于染色體正常組[1.55(1.50,1.97)vs.2.16(1.79,3.00),Z=-2.954,P=0.003]。血清miR-155-5p識別染色體畸變的AUC為0.925(95%CI:0.826～1.000),最佳截斷值為3.28,靈敏度和特異度分別為93.82%、80.04%;miR-146b-5p識別染色體畸變的AUC0.850(95%CI:0.703～0.997),最佳截斷值為1.73,靈敏度和特異度分別為90.00%、75.02%;二者聯合,AUC可提高至0.919(95%CI:0.812～1.000),靈敏度為93.88%,特異度為80.08%。

圖2 繼發性急性髓系白血病血清miR-155-5p和miR-146b-5p水平識別染色體畸變的ROC曲線

2.4 Logistic回歸分析血清miR-155-5p和miR-146b-5p水平與染色體畸變的關系 將染色體畸變作為因變量(染色體畸變賦值1,染色體正常賦值0),將年齡、性別、LDH、血清miR-155-5p和miR-146b-5p水平進一步納入多因素模型,結果顯示血清miR-155-5p和miR-146b-5p水平均是染色體畸變的獨立影響因素(P<0.05,表2)。

表2 Logistic回歸分析繼發性急性髓系白血病患者血清miR-155-5p和miR-146b-5p水平與染色體畸變的關系

2.5 血清miR-155-5p和miR-146b-5p對sAML患者死亡的預測價值 隨訪期間,共12例(46.15%)患者死亡,無失訪患者。血清miR-155-5p預測sAML患者死亡的AUC為0.869(95%CI:0.733～1.000),截斷值為4.27,靈敏度和特異度分別為85.72%和75.98%;血清miR-146b-5p預測sAML患者死亡的AUC分別為0.863(95%CI:0.722～1.000),截斷值為1.12,靈敏度和特異度分別為91.74%和71.48%;二者聯合,可將預測sAML患者死亡的AUC進一步提高至0.887(95%CI:0.755～1.000),靈敏度為92.96%,特異度為83.38%。見圖3。

圖3 繼發性急性髓系白血病患者血清miR-155-5p和miR-146b-5p預測患者死亡的ROC曲線

2.6 Kaplan-Meier曲線 根據上述ROC曲線確定的截斷值(4.27、1.62),將所有患者分為低表達組和高表達組。隨訪期間,血清miR-155-5p低表達(<4.27)和高表達(≥4.27)患者OS率分別為81.8%(9/11)、20.0%(3/15),中位生存時間分別為213、143 d,經Log Rankχ2檢驗,差異有統計學意義(Log Rankχ2=7.348,P=0.007,圖4A);血清miR-146b-5p低表達(<1.62)和高表達(≥1.62)患者OS率分別為9.1%(1/11)、73.3%(11/15),中位生存時間分別為143、213 d(Log Rankχ=7.092,P=0.008,圖4B)。

圖4 繼發性急性髓系白血病患者Kaplan-Meier曲線A.血清miR-155-5p;B.血清miR-146b-5p。

2.7 Cox回歸分析血清miR-155-5p和miR-146b-5p水平與sAML生存預后的關系 以隨訪期間是否死亡為因變量(死亡賦值為1,存活賦值為0),將單因素回歸分析中P<0.05的指標作為自變量納入多因素分析。結果顯示,血清miR-155-5p和miR-146b-5p水平是sAML患者死亡的獨立危險因素(P<0.05),見表3。

表3 繼發性急性髓系白血病患者Cox回歸分析血清miR-155-5p和miR-146b-5p水平與sAML生存預后的關系

3 討 論

AML是一種遺傳異質性疾病,染色體和分子遺傳特征是預測預后和指導治療方案的主要因素[3,4]。常見的染色體異常,例如,缺失、多倍體、易位和復雜的染色體畸變,被學者們認為可能與miRNA表達的改變有關,因為許多失調的miRNA定位于異常染色體區域[4,6]。本研究發現,發生染色體畸變的sAML患者miR-155-5p表達水平較染色體正常患者上調,miR-146b-5p表達則下調,提示二者可能與染色體畸變有關。此外,血清miR-155-5p高表達和miR-146b-5p低表達患者的OS更短,預后更差。因此,這兩種miRNA可能是sAML染色體畸變和預后的潛在預測因子。

miR-155-5p是一種定位于人染色體21q21的致癌miRNA,在造血、細胞分化和免疫中發揮重要作用[7]。它可通過影響細胞因子的產生來精細調節生發中心反應和T輔助細胞分化[14]。另一方面,miR-155-5p也可控制淋巴細胞和樹突狀細胞的功能,對正常免疫功能至關重要[14]。許多研究發現,miR-155-5p在包括白血病在內的人類惡性腫瘤中上調,且其過表達與預后不良有關[7,15]。據報道,miR-155-5p可靶向許多基因,包括編碼骨髓生成和紅細胞生成調節蛋白的基因、腫瘤抑制基因和編碼炎癥蛋白的基因[16],這進一步凸顯了miR-155-5p在sAML轉化和進展中的作用。值得注意的是,miR-155-5p可靶向叉頭框蛋白O3(forkhead box protein O3,FOXO3),FOXO3是一種作用于磷酸酯酶與張力蛋白同源物/磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B通路下游的轉錄因子,在造血干細胞自我更新中不可或缺[17]。此外,miR-155-5p可靶向并抑制CBL的表達,從而調控干擾素調節因子4/周期蛋白依賴性激酶6軸,促進白血病的發展[8]。Pagotto等[18]研究還發現,miR-155可通過靶向苯并咪唑出芽抑制解除同源物蛋白1在穩定慢性淋巴細胞白血病轉化細胞的染色體核型中起著重要作用。因此,上述研究結果均表明miR-155-5p可能與sAML的發生進展及染色體核型穩定有關,有潛力作為sAML的預后標志物。

miR-146b-5p是由位于人10號染色體上的基因編碼的miRNA,在惡性腫瘤中發揮致癌或抑癌作用[9]。多個研究報告稱,miR-146b-5p在白血病、乳腺癌、結直腸癌等中下調[9-11]。據報道,miR-146b-5p可能通過多個靶基因調節腫瘤侵襲和遷移[19-21]。例如,miR-146b-5p在白血病中可通過靶向NOTCH抑制腫瘤細胞增殖,NOTCH信號通路也是AML發病機制中的一種關鍵致癌途徑[19,20]。miR-146b-5p還能直接靶向血小板源性生長因子受體α,負調控紅細胞生成和巨核細胞生成[21]。此外,一些報道提示miR-146b在炎癥和癌癥中影響NF-κB通路的激活。特別是,miR-146b-5p對腫瘤壞死因子受體6和白細胞介素-1受體相關激酶1的表達均有負調控作用,這兩種蛋白通過幾種膜受體傳遞信號影響白血病和或自身免疫性疾病中核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)激活[22,23]。T細胞急性淋巴細胞白血病中miR-146b-5p表達的降低也可能導致白細胞介素-17A上調,進而通過NF-κB信號通路上調基質金屬蛋白酶9,促進細胞遷移和侵襲[11,24]。上述研究表明miR-146b-5p可能通過靶向多個靶基因,調控不同的信號通路在白血病的發病機制和疾病進展中發揮重要作用。

本研究中,sAML患者血清miR-155-5p水平較健康對照組顯著升高,miR-146b-5p顯著降低,采用ROC曲線分析后,發現二者在sAML患者中均具有良好的診斷效能,且二者聯合診斷可使診斷AUC提高至0.922,提示血清miR-155-5p和miR-146b-5p在診斷sAML中具有一定的臨床診斷價值。另一方面,血清miR-155-5p高表達、miR-146b-5p低表達不僅可以識別染色體畸變患者,而且與sAML患者較短的OS顯著相關。Kaplan-Meier分析和Cox回歸分析表明,sAML患者血清miR-155-5p高表達、miR-146b-5p低表達預示著死亡風險增加。這些數據提示,在sAML患者中miR-155-5p高表達和miR-146b-5p低表達具有不良預后意義,而二者聯合可進一步提高風險預測價值。

綜上所述,血清miR-155-5p高表達和miR-146b-5p低表達與sAML患者染色體畸變和預后不良密切相關,二者有希望成為染色體畸變和預后風險預測指標。但本研究存在一定局限性,首先,只招募了26例sAML患者,樣本量受限;其次,未分析患者染色體異常類型,因此無法明確染色體異常類型與sAML的生存和預后的相關性;第三,患者中可能存在未發現的染色體異常,導致結果存在一定偏差。最后,由于sAML參與者個體化治療的異質性,治療方案可能會影響結果。因此,關于sAML中血清miR-155-5p和miR-146b-5p表達的結果應該在未來的大型隊列中得到證實,且二者在sAML中表達異常的確切分子機制需要進一步研究。