秋水仙堿對LPS誘導內皮間質轉化的影響及機制

郭 俊,唐光能,趙 祺,曹 政,涂 強

(1.中國醫學科學院阜外醫院,北京 100037;2.十堰市太和醫院,湖北 十堰 442000)

血管內皮細胞是裱襯于心、血管和淋巴管內表面的單層扁平上皮細胞,其在維持血管穩態方面具有重要作用[1]。內皮細胞在各種刺激因子的作用下,其內皮特性逐漸消失而獲得間充質特性,這一過程被稱為內皮間質轉化(endothelial to mesenchymal transition, EndMT)。現有研究表明,EndMT與心血管疾病的發生發展密切相關,并且可能是內皮功能障礙與血管損傷之間的關鍵聯系[2-3]。炎癥在心血管疾病的發生發展中均扮演著重要的角色,而抗炎藥物能夠改善心血管疾病的預后。長久以來,秋水仙堿(colchicine, Col)作為治療痛風和家族性地中海熱的藥物,具有良好的安全性及耐受性,并且已被證明對心血管疾病也有效[4]。然而,Col在調控EndMT方面的作用目前尚不明確。因此,本研究初步探討Col對脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)誘導內皮細胞EndMT的影響及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料人臍靜脈血管內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)購自中國科學院上海細胞所;ECM培養基購自美國Sciencell公司;Col(貨號:C3915)、LPS(批號:L4391)購自美國Sigma公司;Transwell小室購自美國Corning公司;Matrigel膠購自美國BD公司;CCK-8檢測試劑盒、LDH檢測試劑盒、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒及SDS-PAGE凝膠配制試劑盒均為碧云天公司產;CD31、VE-cadherin、α-SMA、FSP-1、NF-κB p65、p-p65、IκBα和Snail抗體均購自CST公司;TransAMTMNF-κB p65比色試劑盒購自美國Active Motif公司;其他試劑均為進口分裝或國產分析純。

1.2 方法

1.2.1CCK-8檢測細胞活力 將HUVECs接種于96孔板中,在37 ℃條件下用Col(0.1、1、10、100 nmol·L-1)處理72 h。然后每孔中加入含有10 μL CCK-8的新鮮培養基100 μL,在37 ℃避光孵育3 h,使用多功能酶標儀測定450 nm處吸光度。

1.2.2細胞毒性檢測 將HUVECs接種于96孔板,在37 ℃條件下用Col(0.1、1、10、100 nmol·L-1)處理72 h,使用細胞毒性測定試劑盒評估培養基中乳酸脫氫酶(LDH)的含量來反映細胞毒性。

1.2.3細胞培養與分組 參考既往方法[5],采用LPS處理HUVECs構建EndMT模型。將細胞隨機分為4組:(1)正常對照組:不含LPS和Col的培養基培養細胞72 h; (2)正常對照+Col組:含10 nmol·L-1的Col培養細胞72 h; (3)模型組:含10 mg·L-1LPS培養細胞72 h;(4)LPS+Col組:含10 mg·L-1LPS聯合10 nmol·L-1的Col共同培養細胞72 h。

1.2.4細胞形態學觀察 各組細胞在處理72 h后,采用4%多聚甲醛室溫固定10 min,之后采用倒置光學顯微鏡觀察并記錄各組細胞形態學變化情況。

1.2.5細胞遷移能力檢測 用無血清ECM將5×104個HUVECs接種于Transwell小室的上室。然后,在下室中加入700 μL完全培養基。孵育24 h后,取出培養基,輕輕擦去濾網上未遷移的細胞。將遷移的細胞固定在4%多聚甲醛中,結晶紫染色10 min后于倒置顯微鏡下拍照并記錄遷移細胞個數。

1.2.6Western blot檢測蛋白表達情況 各組細胞處理72 h后采用含有蛋白酶抑制劑及RIPA裂解液裂解細胞,于4 ℃ 15 000 r·min-1離心15 min,并取上清采用BCA法測定蛋白濃度。蛋白經SDS-PAGE電泳,并轉印CD31、VE-cadherin、α-SMA、FSP-1、NF-κB p65、p-p65、IκBα和Snail蛋白至PVDF膜上,用5% BSA封閉1 h,用相應的特異性一抗4 ℃孵育過夜,再經洗膜,然后孵育相應二抗室溫1.5 h后再次洗膜,最后采用ECL化學發光法顯影,經Image-Pro Plus 8.0軟件進行吸光度測定,并與內參GAPDH吸光度相比較得到各組蛋白條帶相對值。

1.2.7NF-κB p65活性檢測 獲取HUVECs核提取物后進一步按照TransAMTMNF-κB p65比色試劑盒說明檢測NF-κB p65的DNA結合活性。

2 結果

2.1 Col對HUVECs細胞活力的影響為探討Col最為合適的藥物作用濃度,我們采用了CCK-8實驗評估細胞活力,同時檢測Col處理后HUVECs中LDH的釋放情況來反映藥物毒性。實驗結果顯示,與正常對照組相比,Col濃度在0.1～10 nmol·L-1范圍的內對HUVECs細胞活力無明顯影響且無明顯毒副作用。因此,在后續實驗中采用10 nmol·L-1的Col作為最佳處理濃度,見Fig 1。

Fig 1 Effects of colchicine at different concentrations on

2.2 Col對LPS誘導EndMT過程中細胞形態學的影響體外實驗表明,LPS作用HUVECs 72 h可明顯改變HUVECs形態,HUVECs由正常的扁平型轉化為梭形及不規則性,提示LPS誘導EndMT的發生,而使用Col干預后細胞形態明顯好轉,由此表明Col可抑制LPS誘導的EndMT過程,見Fig 2。

2.3 Col對LPS誘導的EndMT過程中細胞遷移能力的影響采用Transwell小室法觀察Col對HUVECs體外遷移能力的影響。與正常對照組相比,LPS組HUVECs遷移能力明顯增加(P<0.05),與LPS組相比,Col干預組HUVECs體外遷移能力明顯降低(P<0.05),見Fig 3。

2.4 Col對LPS誘導EndMT過程中小管形成能力的影響采用Matrigel檢測Col對HUVECs小管形成能力的影響。結果表明,正常對照組相比,LPS組HUVECs小管形成能力明顯減弱(P<0.05),與LPS組相比,Col干預組HUVECs體外小管形成能力明顯增加(P<0.05),見Fig 4。

Fig 2 Effects of colchicine on cell morphology during LPS induced EndMT

Fig 3 Representative photographs and quantification analysis of migratory activity of n=3)

2.5 Col對LPS誘導EndMT標志物表達的影響EndMT過程中伴隨內皮標志物的丟失及間質標志物的獲得。本研究中我們檢測了Col對內皮細胞特異性標志物CD31、VE-cadherin及間質細胞標志物α-SMA、FSP-1表達的影響。Western blot結果顯示:LPS處理可明顯下調CD31、VE-cadherin蛋白表達,同時上調α-SMA、FSP-1蛋白表達(P<0.05),而Col處理則逆轉了這種效應(P<0.05),見Fig 5。

2.6 Col通過調控NF-κB/Snail信號通路抑制LPS誘導的EndMT各組HUVECs在處理72 h后檢測NF-κB信號通路的變化情況。結果顯示,與對照組相比,LPS處理之后NF-κB通路被顯著激活,表現為p-p65上調,IκBα降解以及p65與DNA結合活性增加(P<0.05),而Col可抑制NF-κB通路的激活。Snail作為鋅指蛋白轉錄因子,在調控EndMT過程中起到至關重要的作用[6]。在本研究中我們發現,LPS激活NF-κB信號通路后可上調Snail表達,而NF-κB抑制劑(TAK-243)和Col均可明顯降低Snail蛋白表達水平(P<0.05)。以上結果證實:Col通過調控NF-κB/Snail信號通路改善LPS誘導的EndMT,見Fig 6。

Fig 4 Representative photographs and quantification analysis of

3 討論

內皮細胞的完整性對維持正常血管結構具有重要意義。機械損傷、缺氧、炎癥以及氧化應激等異常因素可導致血管內皮結構損傷,從而促使多種心腦血管疾病的發生[1,7]。因此,維持內皮細胞的完整性對心腦血管疾病的防治具有重要意義。

Fig 5 The expression of EndMT markers in HUVECs among different groups after colchicine n=3)

EndMT是內皮細胞逐漸失去內皮表型并獲得間充質或成纖維細胞特征的一個生物學過程。EndMT過程的典型特征包括內皮特異性細胞-細胞連接蛋白的丟失:血小板內皮細胞黏附分子-1(platelet endothelial cell adhesion molecule, PECAM-1/CD31)、血管內皮細胞鈣黏連蛋白(vascular endothelial cadherin, VE-cadherin)以及獲得成纖維細胞肌動蛋白:α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)和成纖維細胞特異性蛋白-1(fibroblast specific protein-1, FSP-1),使細胞獲得更大的遷移能力[2-3,8]?，F有研究表明:EndMT是胚胎心臟發育的一個重要生理過程,它也作為一種病理過程發生在出生后,并導致各種疾病,包括纖維化[9],癌癥進展[10],新生內膜增生[11]。在本實驗中,我們采用10 mg·L-1LPS處理HUVECs 72 h以誘導EndMT。實驗中觀察到HUVECs在LPS處理后形態由鋪路鵝卵石樣逐漸變為狹長梭形,遷移能力增強,小管形成能力減弱,內皮細胞標志物CD31和VE-cadherin表達減少,間質細胞標志物α-SMA和FSP-1表達增多,說明LPS可以成功誘導EndMT的發生。

Col是治療急性痛風發作的經典藥物。近期研究表明,Col具有強大的抗炎作用,小劑量Col還可用于心血管疾病的二級預防[12]。最新發表在《新英格蘭醫學雜志》上的臨床研究顯示,在4 745例近期心肌梗死患者的評估中,與安慰劑組相比,每天服用低劑量Col(0.5 mg)可明顯降低缺血性心血管事件的風險[13]。有研究證實,在無菌心包炎大鼠模型中,Col可以減少促纖維和促炎癥因子的分泌和表達,如IL-6、TGF-β和TNF-α,從而抑制心房纖維化進展[14]。本研究通過CCK-8法以及LDH釋放實驗檢測了不同濃度Col對HUVECs活力的影響,結果顯示Col濃度為0.1、1和10 nmol·L-1時對細胞活力無明顯影響,超過10 nmol·L-1時則會產生明顯細胞毒性,故后續實驗藥物濃度選擇10 nmol·L-1作為最佳處理濃度。隨后我們發現,Col可抑制LPS誘導的EndMT,這可能是Col發揮心血管保護效應的作用機制之一。

既往報道顯示,NF-κB信號通路激活在調控EndMT的發生發展中發揮重要作用[15-16],同時也是Col發揮抗炎作用的靶點之一[17]。據此,我們推測Col介導的NF-κB信號通路可能在調控EndMT進程中發揮重要作用。為進一步探討調控機制,通過檢測Col與NF-κB通路之間的關系,我們發現Col干預組HUVECs NF-κB信號明顯抑制,同時下游Snail蛋白表達水平明顯降低,NF-κB抑制劑(TAK-243)可發揮和Col同樣的效應。以上這些結果表明,Col可通過調控NF-κB/Snail信號通路調控EndMT過程。

Fig 6 Colchicine inhibits LPS induced EndMT by regulating NF-κB/Snail signaling n=3)

本研究尚存在一定的局限性,首先我們僅在體外細胞實驗觀察了Col對LPS誘導的HUVECs內皮間質轉化的影響,后續還需進一步通過動物實驗及臨床實驗探討Col對EndMT的影響。其次,對于Col調控EndMT的機制,僅檢測了NF-κB/Snail信號通路的變化情況,但具體調控機制還有待進一步深入研究。