下調METTL5通過Wnt/β-catenin信號通路抑制三陰乳腺癌細胞增殖、遷移與侵襲

吳坤琳,嚴乾壹,王德星,繆秀英,張惠灝

(福建醫科大學附屬第一醫院 1. 甲狀腺乳腺外科、2. 濱海院區國家區域醫療中心綜合外科二區,3. 福建醫科大學第一臨床醫學院,福建 福州 350005)

三陰乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)是乳腺癌的一類分子亞型,其特征為缺乏雌激素受體、孕酮受體和人類表皮生長因子2型受體[1]。TNBC在年輕女性中發病率更高,約占所有乳腺癌病例的10%～20%,且比非TNBC更容易復發和轉移[2-3]。因此,研究TNBC發生和發展的潛在機制,識別風險和預后生物標志物,對提高TNBC的早期檢測和有效治療具有重要意義。

N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine,m6A)酶能通過使mRNA的堿基發生m6A甲基化修飾,其在腫瘤的發生、發展和命運等生物學過程中發揮重要作用。如甲基轉移酶3(methyltransferase-like 3,METTL3)、肥胖相關蛋白、YTH結構域家族蛋白2等m6A酶已被發現在多種腫瘤中失調[4]。甲基轉移酶5(methyltransferase-like 5,METTL5)作為核糖體RNA(rRNA)N6-甲基轉移酶,可通過修飾18S rRNA的A1832位點,增強核糖體蛋白S6激酶的活性和翻譯促進乳腺癌細胞的增殖[5]。METTL5可通過促進c-Myc的翻譯來促進胰腺癌細胞增殖、遷移和侵襲[6]。此外,METTL5在肝細胞癌中上調并與不良預后相關[7]。這些研究表明,METTL5可能在腫瘤的發生和發展中起重要作用。而,METTL5在TNBC中的表達及作用仍然未知。因此,本研究探討了METTL5在TNBC中的表達、功能和潛在的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要試劑 胎牛血清(#FSD500)購自蘇州依科賽生物科技股份有限公司;DEME培養基(#E600003-0500)、青霉素/鏈霉素雙抗溶液(#B540732-0010)和免疫組化試劑盒(#D601037-0050)購自生工生物工程(上海)股份有限公司;甲基轉移酶5(methyltransferase-like 5,METTL5;#HPA038223)抗體購自瑞典Atlas Antibodies公司;基質金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP-2;#ab86607)、β-連環蛋白(β-catenin;#ab32572)、N-鈣黏蛋白(N-cadherin;#ab76011)抗體購自英國Abcam公司;MMP-7(#3801S)和細胞周期蛋白D1(Cyclin D1,#2978S)抗體購自美國CST公司;GAPDH抗體(#APR28867N)和HRP-羊抗兔IgG(H+L)二抗(#ASG032N)購自艾柏森(北京)生物科技有限公司;METTL5 shRNA慢病毒顆粒(shRNA-METTL5;#sc-95031-V)、陰性對照shRNA慢病毒顆粒(shRNA-NC;sc-108080)、聚凝胺(#sc-134220)和RIPA裂解液(#sc-24948)購自美國Santa Cruz Biotechnology公司;細胞計數試劑盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8)試劑盒(#BN15201)購自北京拜爾迪生物技術有限公司。

1.1.2主要儀器 SpectraMax iD3 多功能酶標儀(美國Molecular Devices公司);Tanon V8蛋白質印跡儀(上海天能科技有限公司);SH-Advance 523 蛋白印跡電化學發光成像系統(杭州申花科技有限公司);DM2000LED顯微鏡(德國Leica公司)。

1.1.3細胞系與細胞培養 人正常乳腺細胞系MCF-10A、乳腺癌細胞系BT-549、Hs578t、MDA-MB436、SKBR-3和MCF-7均購自中國科學院上海細胞庫。將細胞在含10%胎牛血清和雙抗(100 kU·L-1青霉素、0.1 mg·L-1鏈霉素)的DMEM培養基培養,3 d換液1次,細胞90%鋪滿瓶底按1 ∶3傳代。

1.1.4臨床組織樣本 2020年2月～2022年5月收集福建醫科大學附屬第一醫院甲狀腺乳腺外科行腫瘤切除術的39例女性乳腺癌患者的組織標本(包括TNBC組織標本、非TNBC組織標本以及各自對應的遠端正常乳腺組織)。本研究獲得了福建醫科大學附屬第一醫院倫理委員會審核批準,并獲得了所有患者的簽訂的知情同意書。所有患者年齡為41～73歲;臨床分期為Ⅱa～Ⅲb;乳腺癌起源類型:34例為乳腺導管癌,5例為乳腺小葉癌;病理分型:8例為TNBC、31例為非TNBC。納入標準為符合手術指征,首次確診,未進行過相關治療,同意本研究。

1.2 方法

1.2.1免疫組織化學染色 取臨床組織樣本石蠟包埋,組織切片(5 μm厚),脫蠟水化后,3% H2O2阻斷內源性過氧化物酶10 min,10%山羊血清封閉20 min。切片與METTL5(1 ∶500)抗體在4 ℃過夜,洗滌后,按照試劑盒步驟按SABC法進行免疫組化染色,用DAB顯示陽性染色,蘇木精復染后,DM2000LED顯微鏡下隨機拍攝5個視野的染色圖,用ImageJ軟件自動分析免疫組化的陽性表達情況。

1.2.2細胞轉染 按照shRNA慢病毒顆粒轉染試劑說明書,在轉染前1 d將BT-549和MDA-MB436以2×105個/孔鋪板至6孔板中,次日,更換為無血清和雙抗的培養基孵8 h,然后更換為含10 mg·L-1聚凝胺的無血清培養基,分別加入終濃度為5×104IFU的shRNA-METTL5或shRNA-NC,37 ℃孵育8 h,更換為正常DMEM培養基培養48 h,收集細胞用Western blot檢驗轉染效果后,將細胞用于后續實驗。

1.2.3CCK-8法檢測細胞的增殖活性 將轉染后的細胞按每孔5×103個鋪在96孔板中,分別培養1～4 d后,加入10 μL CCK-8溶液在37 ℃和5% CO2下孵育2 h。SpectraMax iD3 多功能酶標儀上讀取波長450 nm處的吸光度值,每組5個復孔,實驗重復3次。

1.2.4集落形成試驗 將轉染后的細胞按每孔1×103個密度鋪在6孔板中。常規培養14 d,用多聚甲醛固定細胞,用0.1%結晶紫染色后,拍攝細胞集落并計數。

1.2.5傷口愈合試驗 將轉染后的細胞接種在6孔板中,直到單層匯合達到90%。使用無菌200 μL移液管尖在孔表面劃一道劃痕,PBS清洗掉痕跡上劃傷的細胞,用含0.2%胎牛血清的培養基培養細胞,用數碼相機在DM2000LED顯微鏡下的相同位置于劃痕后0和24 h對6孔板的平板拍照。

1.2.6Transwell實驗 用Transwell法檢測細胞遷移與侵襲。遷移檢測實驗:用含3%BSA的培養基(用于維持Transwell培養小室上下界面的滲透壓)的培養液重懸細胞,取1×104個細胞接種于Transwell小室上室(總體積200 μL),下室中加含10%胎牛血清的培養液600 μL;將24孔板置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養箱內孵育24 h,棄去培養液,用PBS洗2次,4%多聚甲醛固定20 min,用棉簽擦拭小室上室內表面,加入0.1%結晶紫染液染色30 min;DM2000LED顯微鏡下觀察細胞并拍照。侵襲檢測實驗除了使用的Transwell板小室的濾膜是被基質膠包被的外,步驟與遷移檢測實驗一致。以穿膜的細胞數差異代表細胞遷移或侵襲的改變。每張膜選5個視野,計算平均細胞數,每組重復3孔。

1.2.7蛋白質印跡實驗 用RIPA裂解液從培養的細胞中提取總蛋白,在將其加熱變性后,然后在Tanon V8蛋白質印跡儀中進行SDS-PAGE蛋白分離并轉移到PVDF膜上。在5%脫脂牛奶中封閉后,分別使用一抗METTL5(1 ∶1 000)、MMP-2(1 ∶2 000)、MMP-7(1 ∶2 000)、Cyclin B(1 ∶1000)及Cyclin D1(1 ∶1000)、β-catenin(1 ∶3000)、N-cadherin(1 ∶2 000)以及GAPDH(1 ∶6 000)4 ℃孵育過夜,洗膜后,使用二抗HRP-羊抗兔IgG(1 ∶2 000)孵育2 h。用ECL使電泳條帶顯像,并用SH-Advance 523蛋白印跡電化學發光成像系統觀察蛋白條帶和對條帶相對光密度進行量化。

1.2.8體內成瘤實驗 雄性BALB/c裸鼠(6周齡,SPF級,19～21 g)購買于蘇州賽業生物科技有限公司(生產許可證號:SCXK(蘇)2022-0016),在福建醫科大學實驗動物中心SPF級動物房[使用許可證號:SYXK(閩)2022-0004]中常規飼養3 d后,將其分為shRNA-METTL5組和shRNA-NC組,每組6只裸鼠。用100 μL PBS配置的細胞懸浮液(含1106個細胞,分別為轉染shRNA-METTL5或shRNA-NC后的BT-549細胞)皮下注射到對應各組裸鼠的皮下,每5 d監測一次腫瘤大小。3周后,麻醉裸鼠,取出瘤體,按上述“1.2.1”方法免疫組化檢測瘤體組織中METTL5、MMP-2、β-catenin和N-cadherin表達。動物實驗都嚴格按照實驗動物護理和使用指南進行。

2 結果

2.1 臨床TNBC組織中METTL5表達情況對收集的正常乳腺組織、非TNBC及TNBC患者的腫瘤組織進行免疫組化檢測,結果如Fig 1所示,與正常乳腺組織比較,非TNBC及TNBC組織中METTL5表達均上調(P<0.01),其中TNBC組織中METTL5表達高于非TNBC組織(P<0.01)。

2.2 敲降METTL5抑制TNBC細胞增殖Western blot檢測不同細胞系中METTL5表達(Fig 2A),與正常人乳腺上皮細胞系MCF-10A比較,非TNBC細胞系(SKBR-3和MCF-7)和TNBC細胞系(BT-549、Hs578t和MDA-MB-436)中的METTL5表達增加(P<0.01),其中TNBC細胞系中表達高于非TNBC細胞系(P<0.01)。將shRNA-METTL5或shRNA-NC轉染入BT-549和MDA-MB436細胞,與shRNA-NC轉染組相比,shRNA-METTL5組具有較低的METTL5 mRNA表達水平(Fig 2B,P<0.01)。CCK-8(Fig 2C)和集落形成(Fig 2D)實驗的結果顯示,敲降METTL5抑制TNBC細胞增殖活性和集落形成能力(P<0.01)。

2.3 敲降METTL5抑制TNBC細胞的遷移和侵襲傷口愈合試驗檢測細胞遷移能力(Fig 3A),轉染shRNA-METTL5組的BT-549和MDA-MB-436細胞的傷口愈合遷移距離明顯縮短。Transwell遷移/侵襲實驗分析(Fig 3B、C),與轉染shRNA-NC組的BT-549和MDA-MB-436細胞相比,轉染shRNA-METTL5組的細胞遷移細胞數和侵襲細胞數減少(P<0.01)。

2.4 敲降METTL5抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活Western blot分析顯示(Fig 4),敲降METTL5顯著下調BT-549和MDA-MB-436細胞中Wnt信號通路的關鍵蛋白β-catenin的表達(P<0.01),同時,Wnt信號通路下游MMP-2、MMP-7、Cyclin D1和N-cadherin的表達水平也隨著降低(均P<0.01),但Cyclin B的表達量未明顯改變(P>0.05)。

2.5 敲降METTL5抑制TNBC體內腫瘤生長將穩定轉染shRNA-NC和shRNA-METTL5的BT-549細胞注射在裸鼠皮下建立異種移植瘤。結果表明,shRNA-METTL5組腫瘤的體積小(Fig 5A),瘤體生長較shRNA-NC組慢(Fig 5B)。免疫組織化學染色的結果(Fig 5C)顯示敲降METTL5降低了移植瘤組織中METTL5、MMP-2、β-catenin、N-cadherin的表達。這些數據表明敲降METTL5減弱了體內TNBC腫瘤的生長和瘤體組織中Wnt/β-catenin信號活性。

Fig 2 Knockdown of METTL5 inhibited TNBC cell proliferation n=3)

Fig 3 Knockdown of METTL5 inhibited TNBC cell migration and n=3)

3 討論

TNBC是一種死亡率很高的惡性腫瘤,有效的治療方案很少[1-2, 8],因此,迫切需要尋找新的TNBC的診療生物學標記物。METTL5已被報道在肝癌、胰腺癌與胃癌等多種腫瘤中高表達,且能促進上述腫瘤細胞的惡性生物學行為[6-7, 9],但其在TNBC中的表達和功能仍不清楚。本研究顯示METTL5是一種在乳腺癌中異常增高的rRNA m6A甲基轉移酶,且在TNBC癌組織中的表達比非TNBC癌組織中更高,這一結果不僅重現以前報道METTL5在乳腺癌中高表達的結果[5],而且提示METTL5可能作為TNBC診斷和治療評估的一個新的生物標志物。此外,本研究還顯示METTL5在TNBC細胞系表達高于非TNBC細胞系,敲降METTL5能抑制TNBC細胞的增殖、遷移和侵襲。這些結果提示METTL5表達與TNBC進展以及此病的不利臨床結局可能有關。

本研究進一步探討了METTL5在TNBC中異常表達對TNBC惡性生物學行為調節的可能機制。此前進行的GSEA分析顯示,METTL5表達與如MAPK、JAK-STAT、Wnt和mTOR等一些致癌信號通路有關[10]。Wnt/β-catenin信號通路在TNBC中至關重要,它對TNBC的腫瘤發生、預后和耐藥有重要影響[11]。本研究發現METTL5下調能降低TNBC細胞中β-catenin及Wnt下游靶分子Cyclin D1、MMP-2和MMP-7的表達。β-catenin是Wnt通路中的關鍵靶分子,它可以易位到細胞核并刺激Wnt靶分子如Cyclin D1和MMP-7的表達[12]。在TNBC患者中,β-catenin陽性患者的生存期明顯短于β-catenin陰性患者,并顯示其是惡性轉化的關鍵驅動因素[13]。MMP-2和MMP-7屬于基質金屬蛋白酶家族,其通過降解細胞外基質的各種蛋白質成分在TNBC中起關鍵作用[14]。因此,推測METTL5可通過激活Wnt信號通路在TNBC癌中充當癌基因。但METTL5也可能會通過多種不同的機制調節TNBC的進展,此需進一步的研究以獲得更全面的了解。

Fig 4 Knockdown of METTL5 inhibited activity of Wnt/β-catenin signaling pathway n=3)

Fig 5 Knockdown of METTL5 reduced growth of TNBC tumors and Wnt/β-catenin signaling activity in tumor tissues in vivo n=6)

綜上所述,本研究表明,METTL5是一種新的TNBC的癌基因,可在TNBC中普遍上調并促進腫瘤細胞增殖和侵襲;Wnt/β-catenin信號軸可能在調控METTL5誘導的TNBC細胞惡性行為中起重要作用。因此,本研究為METTL5蛋白在TNBC發生和發展中的作用提供了新的視角,其可能在TNBC中具有潛在治療價值。