雷公藤紅素通過(guò)調(diào)控ATF4/caspase-3/GSDME信號(hào)通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞焦亡

李 端,王永輝,周 靜,張 樂(lè),孔永紅

(1.黃淮學(xué)院直屬附屬駐馬店市中心醫(yī)院藥學(xué)部,河南 駐馬店 463000;2.蘇州大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)系,江蘇 蘇州 215123;3.黃淮學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院,河南 駐馬店 463003)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是全球最常見(jiàn)的人類致命惡性腫瘤之一,其中以原發(fā)性肝癌占比最高,約占85%。據(jù)統(tǒng)計(jì),HCC每年約有 840 000新發(fā)病例和 780 000例死亡病例[1]。大多數(shù)肝癌患者早期無(wú)癥狀確診時(shí)已發(fā)展到晚期,往往失去了手術(shù)治療的最佳時(shí)機(jī)。靶向治療是這些HCC患者的重要選擇,大量研究證實(shí),靶向治療可以在一定程度上改善晚期 HCC患者的生存率[2]。但靶向藥物發(fā)展緩慢,臨床可用于HCC治療的靶向藥物極為有限且易產(chǎn)生耐藥。因此,有迫切需要開發(fā)新的和更具體的治療HCC的方法。近年來(lái),中藥因其作用廣、副作用小、協(xié)同治療效果好等多方面優(yōu)點(diǎn)成為抗腫瘤治療的“熱點(diǎn)”。雷公藤紅素(tripterine, TRI)是一種天然的化合物,主要來(lái)源于雷公藤。TRI已被證明具有抗炎、抗氧化、抗癌和抗纖維化的作用。在臨床上,TRI已被用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、麻風(fēng)反應(yīng)和其他自身免疫性[3-6]。TRI能有效通過(guò)誘導(dǎo)線粒體損傷來(lái)對(duì)抗結(jié)腸癌細(xì)胞和細(xì)胞內(nèi)鈣的積累。TRI還能通過(guò)促進(jìn)線粒體活性氧(reactive oxygen species, ROS)產(chǎn)生,誘發(fā)細(xì)胞線粒體膜電位 (mitochondrial membrane potential, MMP) 和DNA損傷,從而改善急性淋巴細(xì)胞白血病[7]。也有研究報(bào)道,TRI能抑制 HCC 細(xì)胞的生長(zhǎng)和誘導(dǎo) HepG2 細(xì)胞凋亡[8]。這些研究表明TRI可能是一種潛在的癌癥治療藥物。然而,TRI抗癌作用的分子機(jī)制仍有待闡明。細(xì)胞焦亡是一種新的程序性細(xì)胞死亡形式,其特征是細(xì)胞腫脹并伴質(zhì)膜表面孔隙。細(xì)胞焦亡最初歸因于半胱天冬酶(caspase)對(duì)gasdermin D (GSDMD)的蛋白水解片段化。最近的一些研究表明了一種全新的Gasdermin 家族的另一個(gè)成員gasdermin E (GSDME), 其可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡向細(xì)胞焦亡轉(zhuǎn)換[9]。與GSDMD 類似,GSDME 包含 N 端和 C 端結(jié)構(gòu)域,N 端單體在等離子體中低聚形成孔膜[10]。活化的 caspase-3酶剪切 GSDME域間鏈接器釋放 N 端域并形成細(xì)胞膜孔導(dǎo)致細(xì)胞焦亡,最終導(dǎo)致細(xì)胞乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)活性升高以及碘化丙啶 (PI) 攝取的增加。本研究探討TRI是否可通過(guò)調(diào)節(jié)ATF4/caspase-3/GSDME信號(hào)通路誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞焦亡。

1 材料和方法

1.1 主要試劑TRI(純度>98%,購(gòu)自成都普菲德生物技術(shù)有限公司,批號(hào)20210416)。

1.2 細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)HepG2 細(xì)胞(人 HCC 細(xì)胞系)和 Hepa1-6 細(xì)胞(小鼠HCC細(xì)胞系)購(gòu)自上海細(xì)胞生物研究所(中國(guó)上海)。HepG2和Hepa1-6 細(xì)胞分別在MEM和 DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。所有的培養(yǎng)基都是含10%胎牛血清(FBS;賽默飛世爾Scientific, Waltham, MA, USA)、青霉素 (100 kU·L-1) 和鏈霉素(100 g·L-1;Hyclone, Logan, UT, USA)。細(xì)胞在 37 ℃和5% CO2下培養(yǎng)。GSDME質(zhì)粒由 GenePharma(中國(guó)上海)合成。通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法驗(yàn)證構(gòu)建是否成功。m-GSDME forward, 5′-CTGCGGATGACTGCCTCAATGG-3′,h-GSDME reverse, 5′-ATTGCTTGTGCTGTGCGTTGC-3′; h-GSDME forward, 5′-CCTGTGGCATCCACGAAACT-3′,h-GSDME reverse, 5′-GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3′。轉(zhuǎn)染前,將2 mL含有1.0×106細(xì)胞的完全培養(yǎng)基放入6孔板。待細(xì)胞匯合度達(dá)到70%左右后,每個(gè)細(xì)胞中的完全培養(yǎng)基用1.8 mL不含F(xiàn)BS的基礎(chǔ)培養(yǎng)基代替。然后2 μg模擬物或質(zhì)粒分別用 100 μL Opti-MEM (31985070, Gbico) 稀釋。此外,2 μL lipo 3000 (BMB1385, BOMEI BIOTECHNOLOGY,合肥) 也用100 μL Opti-MEM稀釋。然后將稀釋的模擬物或質(zhì)粒和稀釋的 lipo 3000充分混合。孵育10 min后,最后將混合溶液加入每個(gè)孔,進(jìn)一步培養(yǎng) 48 h用于后續(xù)分析。

1.3 細(xì)胞活力測(cè)定和LDH釋放測(cè)定接種指數(shù)生長(zhǎng)的 HepG2 細(xì)胞或 Hepa1-6 細(xì)胞在刺激前 24 h放入96孔板(7 000 個(gè)細(xì)胞/孔)中。將TRI溶解在 DMSO 中并稀釋用不同濃度的培養(yǎng)基 (DMSO終濃度<0.1%)。用TRI孵育指定的時(shí)間和濃度。通過(guò)CCK-8測(cè)定細(xì)胞活力(Dojindo 實(shí)驗(yàn)室,日本九州島)。根據(jù)Prism 6計(jì)算的的細(xì)胞活力值計(jì)算半數(shù)最大抑制濃度(IC50)。對(duì)于LDH釋放,細(xì)胞培養(yǎng)上清液收集后,使用LDH 檢測(cè)試劑盒(Beyotime 生物技術(shù)研究所),在黑暗室溫下孵育30 min。在酶標(biāo)儀(Thermo Scientific Varioskan LUX,Waltham,MA,USA)450 nm 處測(cè)定吸光度分光光度。

1.4 免疫熒光用于免疫熒光染色的細(xì)胞用4%多聚甲醛固定 20 min,然后使用 0.5% Triton X-100滲透15 min。將細(xì)胞在 3% BSA中孵育30 min。之后,細(xì)胞孵育一抗并4 ℃過(guò)夜。PBS 3 次洗滌后,孵育二抗(Invitrogen,美國(guó))2 h。最后,將印跡用DAPI染色5 min(Beyotime),在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞(徠卡,德國(guó))。

1.5 通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估細(xì)胞凋亡收集細(xì)胞,根據(jù)說(shuō)明書,用PBS洗滌2次并使用FITC和PI染色(益生,中國(guó))。染色的細(xì)胞是用流式細(xì)胞儀檢測(cè),并使用FlowJo軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.6 蛋白質(zhì)印跡收集細(xì)胞總蛋白,并BCA 試劑盒(QPBCA,默克)測(cè)定其濃度。然后,使用SDS-PAGE 凝膠對(duì)30 μg 總蛋白和4 μL標(biāo)記物(PR1910,Solarbio,中國(guó))進(jìn)行電泳,隨后轉(zhuǎn)移到0.22 μm PVDF膜(W015-2,建城生物,中國(guó))。用5%脫脂牛奶封閉后,膜與下列相關(guān)一抗在4 ℃孵育12 h:抗人 GSDMD (1 ∶1 000, Proteintech),抗 GSDME (1 ∶1 000, Abcam),抗兔半胱天冬酶3 (caspase3,1 ∶1 000)、抗兔聚 ADP-核糖聚合酶 (PARP, 1 ∶1 000)、抗鼠 GSDMD(1 ∶1 000,Abcam)和抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH, 1 ∶5 000)均購(gòu)自Cell Signaling Technology。抗兔P-eIF2α (1 ∶1 000),抗兔eIF2α (1 ∶1 000),抗兔ATF4 (1 ∶1 000) 均購(gòu)自Abcam。然后,2 h后與兔二抗(1 ∶10 000,Abcam)或鼠二抗孵育抗體(1 ∶10 000,Abcam),進(jìn)一步用200 μL ECL發(fā)光液進(jìn)行顯影(P0019,Beyotime,上海)。最后,檢測(cè)到信號(hào)圖像使用IPP6.0軟件進(jìn)行分析。

1.7 動(dòng)物研究40只雄性BALB/c裸鼠(6周,體質(zhì)量18～20 g)獲購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心(揚(yáng)州,中國(guó))并保存在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心中國(guó)藥科大學(xué)。隨機(jī)分為4組,陰性對(duì)照 (NC)、si-GSDME組、TRI組和TRI+si-GSDME組,NC和TRI組給予未干擾的Hepa1-6細(xì)胞3×106被皮下注射到小鼠右上肢腋下;si-GSDME組和TRI+si-GSDME組小鼠接種等數(shù)量si-GSDME干擾的Hepa1-6 細(xì)胞。每3 d監(jiān)測(cè)一次小鼠腫瘤體積(長(zhǎng)×寬×寬×3.14/6)和體質(zhì)量。在治療結(jié)束時(shí),處死小鼠,取出腫瘤,稱質(zhì)量。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過(guò)本機(jī)構(gòu)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.8 組織病理學(xué)檢查收獲小鼠的腫瘤組織和肝臟,并用4%多聚甲醛固定,脫水,包埋石蠟。

2 結(jié)果

2.1 TRI抑制HCC細(xì)胞增殖和侵襲TRI在各種癌癥中發(fā)揮抗腫瘤作用,但在肝癌中的研究有限[7-8]。因此,我們考察了TRI是否可以抑制HCC細(xì)胞增殖。CCK-8結(jié)果表明,TRI可呈濃度和時(shí)間依賴性抑制肝癌細(xì)胞HepG2、Hepa1-6的增殖(Fig 1A和1D)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,隨著TRI濃度的增加,肝癌細(xì)胞HepG2、Hepa1-6的克隆數(shù)均明顯減少(Fig 1B和1E)。同時(shí),細(xì)胞Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,隨著TRI濃度的增加,肝癌細(xì)胞HepG2、Hepa1-6的侵襲(Fig 1C和1F)能力。

2.2 GSDME對(duì)TRI誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞焦亡至關(guān)重要據(jù)報(bào)道,TRI可通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡抑制腫瘤進(jìn)展[8]。我們?cè)噲D確定是否還可通過(guò)其他方式抑制 HCC 進(jìn)展。有趣的是,在TRI處理后的 HepG2 和Hepa1-6 細(xì)胞均出現(xiàn)了焦亡(Fig 2A)。為了證實(shí)這一發(fā)現(xiàn),我們?cè)u(píng)估了焦亡相關(guān)蛋白。在gasdermin 蛋白家族成員中, GSDMD 的裂解可以將 GSDMD 的 N 端結(jié)構(gòu)域釋放到膜上。雖然 GSDMD 在 HepG2和 Hepa1-6 細(xì)胞中表達(dá),但TRI處理不能誘導(dǎo)GSDMD分裂 (Fig 2B)。此外,在Gsdmd siRNA的Hepa1-6(Fig 2C)不影響TRI誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡和 LDH 釋放(Fig 2D 和E)。進(jìn)一步我們檢測(cè)了新細(xì)胞焦亡效應(yīng)因子GSDME的表達(dá),結(jié)果表明,TRI呈劑量依賴性方式誘導(dǎo)HCC 細(xì)胞 caspase 3和PARP裂解(Fig 2F-I)和 N 端 GSDME (N-GSDME)的釋放。

Fig 1 Proliferation and invasion of HCC cells inhibited by TRI

Fig 2 TRI-induced pyroptosis of hepatoma cells

Fig 3 GSDME mediated response of HCC cells to TRI

2.3 GSDME缺失可部分逆轉(zhuǎn) TRI 對(duì)肝癌細(xì)胞抑制作用為了驗(yàn)證GSDME的作用,我們沉默Hepa1-6 細(xì)胞中的 GSDME(Fig 3A-F)。結(jié)果顯示,GSDME缺失明顯減少TRI誘導(dǎo)的 LDH 釋放和質(zhì)膜膨脹,雖然沒(méi)有挽救細(xì)胞死亡。同時(shí),GSDME缺失后可部分逆轉(zhuǎn)細(xì)胞TRI抑制肝癌細(xì)胞菌落形成和遷移的作用(Fig 4A-D)。TRI處理的Hepa1-6細(xì)胞迅速進(jìn)入膜聯(lián)蛋白V(annexin V)和PI雙陽(yáng)性階段,而Gsdme的敲低后隨著annexin V單陽(yáng)性細(xì)胞比例的增加和雙陽(yáng)性細(xì)胞百分比的降低而延遲細(xì)胞的凋亡(Fig 4E-F)。這些發(fā)現(xiàn)表明TRI發(fā)揮其作用部分取決于HCC細(xì)胞中的GSDME。

2.4 TRI激活 eIF2α/ATF4軸觸發(fā)GSDME介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡為進(jìn)一步闡明細(xì)胞焦亡的發(fā)生機(jī)制,我們檢測(cè)了eIF2a/ATF4軸,這已被證明是caspase-3的上游調(diào)控通路。Western blot結(jié)果表明,TRI刺激后HepG2 和 Hepa1-6 細(xì)胞中 p-eIF2a、ATF4均顯著升高(Fig 5A-C)。同時(shí),免疫熒光結(jié)果也顯示,TRI刺激后HepG2 和 Hepa1-6 細(xì)胞中ATF4陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增加,并呈劑量依賴性(Fig 5D,E)。

2.5 TRI抑制腫瘤生長(zhǎng)部分依賴于GSDME進(jìn)一步研究 TRI的抗HCC腫瘤作用,我們進(jìn)行了體內(nèi)動(dòng)物研究。結(jié)果顯示,TRI治療顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)、減少腫瘤重量,且TRI+si-GSDME 敲低組腫瘤增長(zhǎng)明顯快于TRI+NC組。(Fig 6A-C)。總之,TRI抑制腫瘤生長(zhǎng)部分依賴于GSDME。

Fig 4 GSDME mediated response of HCC cells to TRI

Fig 5 TRI activation of eIF2α/ATF4 axis triggered GSDME-mediated pyroptosis

Fig 6 TRI inhibited growth of HCC cells in vivo

3 討論

HCC總體 5年生存率仍然很差低。化療仍然是晚期 HCC的主要治療方法。索拉非尼是晚期 HCC 患者的標(biāo)準(zhǔn)療法,但它只能為患者提供有限的生存益處[11]。所以,迫切需要確定更有前途的高活性且低毒性的HCC治療藥物。細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)表明,TRI可以明顯抑制HepG2或 Hepa1-6 細(xì)胞生長(zhǎng)。此外,體內(nèi)實(shí)驗(yàn)HCC 模型顯示,TRI治療抑制HCC腫瘤的生長(zhǎng)。

細(xì)胞凋亡通常被認(rèn)為是調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞死亡的主要形式。TRI用于癌癥治療,也歸因于其抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)能力并誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。已有研究發(fā)現(xiàn)TRI可誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡[12]。在本研究中,我們擴(kuò)展了傳統(tǒng)觀點(diǎn),并提出 GSDME 依賴性細(xì)胞焦亡參與TRI在 HCC 中的治療,這一觀點(diǎn)得到了以下實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)驗(yàn)證。首先,在TRI處理的 HCC 細(xì)胞中觀察到細(xì)胞焦亡現(xiàn)象,如細(xì)胞膜裂解、氣球樣氣泡、LDH釋放和 PI 陽(yáng)性染色。但值得注意的是,經(jīng)歷壞死性凋亡的細(xì)胞也表現(xiàn)出質(zhì)膜透化,細(xì)胞腫脹和溶解。在細(xì)胞焦亡期間,焦亡發(fā)生時(shí)形成孔隙,它允許細(xì)胞質(zhì)的內(nèi)容物,如LDH和炎性細(xì)胞因子釋放,熒光標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V (Annexin V)、7-氨基放線菌D (7-AAD)或PI可進(jìn)入細(xì)胞。相比之下,膜不透性染料,如作為7-AAD或 PI,可通過(guò)孔隙進(jìn)入使焦亡細(xì)胞著色,但不染色凋亡細(xì)胞。我們發(fā)現(xiàn)TRI處理的 Hepa1-6 細(xì)胞LDH水平明顯升高,且Annexin V 和 PI 雙陽(yáng)性細(xì)胞比例增多,提示TRI誘導(dǎo)了肝癌細(xì)胞焦亡。同時(shí),肝癌細(xì)胞GSDME 沉默后沒(méi)有挽救TRI誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞死亡,而減少了TRI誘導(dǎo)的 LDH 釋放和細(xì)胞腫脹,并減少了雙陽(yáng)性細(xì)胞的百分比。以上表明,TRI誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞焦亡可能與激活GSDME表達(dá)有關(guān)。GSDMD是細(xì)胞焦亡通路代表性蛋白,已有大量研究證明,多種中藥可通過(guò)caspase-1/GSDMD通路抑制腫瘤的發(fā)生[13-15]。本研究Western blot結(jié)果顯示,TRI作用于肝癌細(xì)胞后,細(xì)胞中N-GSDMD蛋白水平未明顯改變,且擊倒Hepa1-6細(xì)胞的 Gsdmd 沒(méi)有影響TRI誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡和 LDH 釋放。因此,GSDMD 不參與TRI誘導(dǎo)的 HCC 細(xì)胞焦亡,主要是GSDME。GSDME 依賴性細(xì)胞焦亡可由促凋亡蛋白caspase-3觸發(fā)。我們發(fā)現(xiàn)TRI誘導(dǎo)Hepa1-6 細(xì)胞中cleaved caspase-3、cleaved-PARP和 N-GSDME 的蛋白質(zhì)水平呈劑量依賴性增加。因此,TRI可以誘導(dǎo)通過(guò)調(diào)控 caspase-3/GSDME 途徑誘發(fā)肝癌細(xì)胞焦亡。但TRI是如何激活caspase-3/GSDME的呢?

eIF2α/ATF4/CHOP通路是一個(gè)重要的信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞存活的途徑。磷酸化真核起始因子 2 α (eIF2α) 的表達(dá)受到刺激后,可增強(qiáng)激活轉(zhuǎn)錄因子 4 (ATF4),依賴于 ATF4-C/EBP 同源蛋白 (CHOP) 的表達(dá)上調(diào),促進(jìn)細(xì)胞凋亡[16]。據(jù)報(bào)道,eIF2α 通過(guò)多種途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,包括線粒體依賴性途徑、死亡受體途徑和其他途徑[17]。研究表明,eIF2α在細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用并且與 ER 應(yīng)激引起的許多疾病有關(guān)。在正常情況下,p-eIF2α的表達(dá)較低。然而,在病理情況下,p-eIF2α?xí)眲”磉_(dá)并引發(fā)細(xì)胞凋亡[18]。同樣,不同劑量TRI對(duì)肝癌細(xì)胞中p-eIF2α表達(dá)的影響,隨著TRI劑量的增加,p-eIF2α蛋白的水平明顯增加。最近的研究表明,化療藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡是由 BAK/BAX-caspase-3-GSDME介導(dǎo)的,表明 BCL-2 家族的促凋亡因子可能參與細(xì)胞焦亡。此外,線粒體功能障礙觸發(fā) caspase-3-GSDME 通路激活介導(dǎo)米替隆誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞焦亡。因此可能會(huì)有類似的誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡的機(jī)制。以前的研究表明,ATF4/CHOP 可能是調(diào)節(jié) BCL-2 家族的關(guān)鍵上游轉(zhuǎn)錄因子[19]。本研究顯示,TRI作用的肝癌細(xì)胞中ATF4蛋白水平明顯升高。這些結(jié)果表明 eIF2α/ATF4/caspase-3 通路是TRI 誘導(dǎo)GSDME升高的原因。最后,體內(nèi)證據(jù)進(jìn)一步證明TRI在 HCC 腫瘤中誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞焦亡。

綜上,TRI可能是一種潛在的治療HCC的候選藥物,并指出ATF4/caspase-3/GSDME可調(diào)節(jié)TRI誘導(dǎo)的焦亡過(guò)程。