組胺H1受體激動劑通過Akt/NF-κB通路抑制脂多糖誘導的星形膠質細胞炎癥反應

徐佳雯,沈佳紅,溫雨欣,孫建良

(杭州市第一人民醫院麻醉科,浙江 杭州 310000)

組胺是一種生物源單胺,主要通過激活細胞上不同組胺受體亞型發揮作用,通常被認為參與調控外周過敏及免疫反應,但組胺也可調節大腦的炎癥反應[1]。研究表明,中樞炎癥是許多神經系統疾病發生發展的主要原因。已有大量文獻證實,組胺能信號通路異常在帕金森病(Parkinson’s disease,PD)、阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)等神經退行性疾病中扮演重要角色[2]。

星形膠質細胞是神經系統中數量最多,且分布最廣泛的膠質細胞,近年來,其在中樞炎癥中的作用逐漸被學者關注[3]。當受到傷害、應激及中樞神經系統感染等情況下,星形膠質細胞可通過反應性膠質化進行應答。適度活化的星形膠質細胞可上調多種抗炎因子和神經營養因子,抑制炎癥并促進組織修復;而星形膠質細胞過度激活后則會合成和釋放大量趨化因子和促炎介質,使炎癥進一步惡化。因此,探討星形膠質細胞活化的調控因子及其相關機制對防治神經系統疾病具有重要的潛在意義。課題組前期研究發現,星形膠質細胞表達組胺H1、H2和H3受體,且組胺H1受體(histamine H1receptor,H1R)在組胺對星形膠質細胞炎癥反應的調控中發揮重要作用[4]。然而,H1R在炎性激活的星形膠質細胞中的作用和調節機制還不明確。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)作為一種內毒素和炎癥介質,廣泛用于細胞和動物炎癥模型的建立[5]。本實驗擬建立體外LPS誘導星形膠質細胞活化模型,探究H1R在星形膠質細胞炎癥反應中的作用及機制,揭示星形膠質細胞的H1R在調控中樞炎癥中的作用,并為治療中樞炎癥相關疾病尋找潛在的靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 選用1～2日齡新生的SPF級大鼠乳鼠提取原代細胞。乳鼠購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司,實驗動物生產許可證號:SCXK(滬)2003-0003。所有動物實驗經浙江大學實驗動物倫理委員會審核批準。

1.1.2藥物與試劑 LPS(0111:B4),購自美國Sigma公司;胎牛血清、DMEM培養液,均購自美國Gibco公司;大鼠腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、白細胞介素6(interleukin 6,IL-6)ELISA檢測試劑盒、GAPDH抗體,均購自武漢博士德生物工程有限公司;H1R抗體,購自美國Santa Cruz公司;H1R激動劑Pyri、H1R拮抗劑cetirizine,均購自英國Tocris Bioscience公司;CCK-8試劑盒、蛋白BCA定量試劑盒,均購自上海碧云天生物技術有限公司;膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)、p-Akt、Akt、p-NF-κB p65、NF-κB p65抗體,均購自美國CST公司。

1.1.3儀器 超凈工作臺、細胞孵箱(美國Thermo公司);電泳儀、轉膜裝置、化學發光成像系統(美國Bio-Rad公司);光學顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡(德國Carl Zeiss公司)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養和處理 取出生1～2 d的SD大鼠乳鼠的大腦皮質,剝離腦膜及血管,剪碎后加入0.25%胰酶,在37 ℃孵箱中消化10 min,隨后用含10%胎牛血清的DMEM完全培養基中和。以1 500 r·min-1常溫離心5 min,重懸細胞后接種于25 cm2培養瓶,置37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中培養。10～12 d后,用手輕拍培養瓶約10 min,棄去上清中的小膠質細胞,加入新的培養基,重復3次。剩余的貼壁細胞即為星形膠質細胞,用胰酶消化鋪板進行后續實驗。

1.2.2實驗細胞分組 將原代星形膠質細胞分為4組:對照組、LPS組、LPS+H1R激動劑(Pyri)組和H1R激動劑組。對照組僅加入培養液,LPS+H1R激動劑組提前在培養液中加入Pyri(100 μmol·L-1),1 h后再加入終濃度為100 μg·L-1的LPS。

1.2.3CCK-8法檢測細胞存活率 按預定實驗分組處理細胞24 h后,每孔加入10 μL CCK-8溶液,37 ℃恒溫培養箱內孵育2 h,酶標儀檢測490 nm處各孔的吸光度(absorbance,A),以反映細胞活力。使用以下公式計算細胞存活率:細胞存活率=(A處理組-A空白組)/(A對照組-A空白組)×100。

1.2.4免疫熒光檢測 不同藥物處理的細胞用4%多聚甲醛固定細胞形態,隨后用破膜液破膜15 min,洗滌后用5% BSA封閉30 min。封閉后的細胞與GFAP抗體(1 ∶300)和H1R抗體(1 ∶200)4 ℃共同孵育過夜。將一抗孵育的細胞洗滌后,與熒光二抗在37 ℃避光孵育1 h,然后再用DAPI染細胞核10 min,熒光封片液封片,在激光共聚焦顯微鏡下采集圖片,使用ImageJ軟件對數據進行分析。

1.2.5ELISA法檢測炎性因子分泌 將星形膠質細胞在相應實驗條件下處理24 h后,收集細胞上清液,并離心除去細胞碎屑,保存于-80 ℃。使用相應的大鼠ELISA試劑盒,按說明書檢測TNF-α和IL-6的水平。

1.2.6Western blot檢測 相應組別細胞處理后用PBS洗滌,加入裂解液提取細胞總蛋白,BCA法測定蛋白濃度。金屬浴煮沸樣品10 min,取20 μg蛋白上樣進行SDS-PAGE電泳,轉移蛋白至PVDF膜,封閉緩沖液封閉1 h后,分別用抗p-Akt、Akt、p-NF-κB p65、NF-κB p65、GAPDH抗體4 ℃孵育過夜。次日,二抗室溫孵育2 h后,用化學發光系統ECL顯影,ImageJ進行分析。

2 結果

2.1 LPS對星形膠質細胞活力的影響原代星形膠質細胞在100 μg·L-1的LPS或100 μmol·L-1Pyri處理24 h后,CCK-8法測定細胞活力。Fig 1結果顯示,與對照組比較,LPS組、LPS+Pyri組和Pyri組的星形膠質細胞存活率均無明顯變化,說明此炎癥模型中細胞存活率不受影響。

Fig 1 Effect of LPS and 2-pyridylethlamine on cell viability

2.2 LPS下調星形膠質細胞H1R的表達LPS處理細胞24 h后,采用免疫熒光雙染H1R和星形膠質細胞標記物GFAP的方法,對星形膠質細胞進行檢測。如Fig 2所示,LPS上調GFAP的表達,而H1R的表達減少,與對照組比較差異有統計學意義(P<0.01)。

2.3 H1R激動劑降低LPS對星形膠質細胞形態的影響為了探究H1R對LPS誘導星形膠質細胞形態的影響,使用H1R激動劑Pyri(100 μmol·L-1)預處理細胞1 h,隨后采用LPS建立炎癥模型,觀察細胞的形態和生長情況。Fig 3結果顯示,對照組細胞貼壁生長,細胞呈橢圓形或不規則形,表面有較多突起和分支,形成網絡;LPS組細胞分支減少,并有斷裂現象;Pyri預處理能夠增加細胞突起,減少激活形態的星形膠質細胞。

Fig 2 Effect of LPS on H1R and GFAP content in primary

Fig 3 Effect of H1R agonist on LPS-induced glial morphological changes(scale bar=25 μm)

2.4 H1R激動劑抑制LPS誘導的星形膠質細胞的過度活化星形膠質細胞的活化程度可通過其GFAP的表達水平進行檢測。如Fig 4所示,與對照組比較,LPS組GFAP的表達明顯增加(P<0.01);與LPS組相比,LPS+Pyri組GFAP的表達明顯較少(P<0.05)。以上結果說明H1R激動劑Pyri預處理能夠減輕LPS誘導的星形膠質細胞的活化程度。

2.5 H1R激動劑下調LPS誘導的星形膠質細胞炎癥因子的表達星形膠質細胞活化后可釋放細胞因子和炎癥介質,參與中樞神經系統的免疫應答,因此本實驗檢測了其活化后炎癥因子的表達情況。如Fig 5所示,LPS刺激后細胞中炎癥因子TNF-α和IL-6的產生明顯增加,而LPS+Pyri組星形膠質細胞分泌的TNF-α和IL-6含量較單獨LPS組明顯降低。說明H1R激動劑可下調LPS誘導的星形膠質細胞TNF-α和IL-6的產生。

2.6 H1R激動劑對LPS誘導的星形膠質細胞中Akt和NF-κB p65磷酸化的影響Akt/NF-κB信號通路可以調控LPS誘導的炎癥因子的表達,為進一步探究H1R對LPS激活星形膠質細胞中信號通路的影響,將原代星形膠質細胞用LPS和Pyri處理1 h后,采用Western blot檢測Akt和NF-κB p65的磷酸化表達。Fig 6結果顯示,LPS可以上調Akt的磷酸化水平,同時增加NF-κB p65的磷酸化;H1R激動劑Pyri預處理可以使Akt的磷酸化水平減少,并抑制NF-κB p65的磷酸化表達。提示H1R在LPS誘導的星形膠質細胞炎癥反應中可能發揮重要作用。

2.7 H1R拮抗劑Ceti對Pyri調控星形膠質細胞炎性激活的影響為進一步驗證H1R在LPS誘導星形膠質細胞炎癥反應中的重要調節作用,將星形膠質細胞用LPS、Pyri和Ceti處理后,通過免疫熒光評估GFAP的表達,并檢測細胞上清液中炎癥因子的分泌。Fig 7結果顯示,Pyri抑制LPS誘導的星形膠質細胞GFAP及炎癥因子TNF-α、IL-6增加的作用可以被Ceti消除。

Fig 4 Effect of H1R agonist on LPS-induced

Fig 5 Effect of H1R agonist on LPS-induced inflammatory factors in primary

Fig 6 Effects of H1R agonist on LPS-induced phosphorylation of Akt and NF-κB

Fig 7 Effect of H1R antagonist cetirizine on Pyri and LPS induced astrocyte

3 討論

組胺是一種活性胺化合物,參與調控多種生理功能,包括氣道、腸道平滑肌的收縮、胃酸的分泌、血管的舒張等。研究表明,腦內組胺作為神經遞質,主要來源于組胺能神經元,通過與不同組胺受體結合,調節各種腦功能,包括疼痛、睡眠與覺醒及認知功能。隨著組胺能信號通路異常在PD、AD等多種神經退行性疾病中被報道,組胺對中樞炎癥及神經發育的調節作用被廣泛關注[6-7]。然而,越來越多的研究發現,在不同的刺激及環境條件下,組胺既可以發揮強效的促炎作用,又能產生重要的保護性抗炎作用[8-9]。有學者認為這可能與組胺作用于不同的組胺受體亞型及細胞類型有關[2]。因此,為了闡明組胺調控中樞炎癥的具體機制及信號通路,有必要針對腦內不同細胞上的組胺受體亞型分別進行探究。

組胺對神經元的調控作用已有大量文獻報道,但組胺如何作用于腦內的非神經元細胞,還知之甚少[10-11]。星形膠質細胞是神經系統中數量最多,且分布最廣泛的膠質細胞,作為中樞炎癥的重要調節者,隨著腦內微環境的改變,既能發揮神經保護作用,又能加劇炎癥的發展轉而成為多種疾病的幕后推手。研究發現,組胺H1、H2和H3受體均在星形膠質細胞表達,而H1R與星形膠質細胞的大多數功能有關,如離子穩態、能量代謝、神經遞質清除等。我們前期研究也發現,H1R在組胺對星形膠質細胞活化反應的調控中發揮重要作用[4, 12]。有文獻報道,在中樞神經系統的固有免疫細胞——小膠質細胞上也有H1R表達,且H1R似乎扮演著促炎的角色[13-14]。為進一步探究H1R在星形膠質細胞炎性激活時的調控作用及機制,本實驗采用大鼠原代星形膠質細胞建立體外炎癥模型,并通過H1R激動劑和拮抗劑進行深入研究。

LPS是革蘭陰性細菌細胞外壁的組成成分,利用LPS建立體外炎癥模型可用于探索和闡明神經退行性疾病的病理生理機制[5]。本研究采用100 μg·L-1的LPS處理星形膠質細胞,CCK-8法測定細胞活力,發現該濃度下細胞存活率不受影響。星形膠質細胞在炎性刺激下,可通過反應性膠質化進行應答,最初表現為形態學的改變(分支和突起的重塑)以及過表達特異性標志物GFAP[15]。本實驗發現,LPS刺激星形膠質細胞后,細胞分支減少,并有斷裂現象,且GFAP表達明顯增加,同時H1R表達明顯減少。H1R激動劑Pyri預處理能夠增加細胞突起,減少激活形態的星形膠質細胞,并下調GFAP的表達,以上結果說明Pyri預處理能夠減輕LPS誘導的星形膠質細胞的活化程度。由于星形膠質細胞過度激活后可釋放大量促炎介質加劇炎癥反應,進一步檢測了LPS處理后細胞上清液中的炎癥因子TNF-α和IL-6的含量。結果顯示,Pyri可明顯下調LPS誘導的星形膠質細胞TNF-α和IL-6的水平。此外,Pyri的這一抑制作用可以被H1R拮抗劑Ceti消除。這一結果表明,H1R在LPS誘導星形膠質細胞炎癥反應中具有重要調節作用。最近研究闡述了H1R與星形膠質細胞焦亡的關系,H1R被激活后,可以抑制抗精神病藥物誘導的星形膠質細胞的焦亡與炎癥[16],這與我們的研究結果一致。

已有研究表明,在炎癥過程中,NF-κB異二聚體的核轉運是星形膠質細胞異常激活的關鍵步驟,促進多種中樞神經系統疾病的發展[17]。在生理狀況下,NF-κB與IκB結合,處于被抑制狀態,一旦發生磷酸化被激活,可釋放NF-κB p65進入胞核與靶序列結合,促進下游TNF-α等炎性細胞因子的表達。NF-κB的核轉運受多種途徑調節,已知PI3K/Akt信號轉導通路通過IκB降解后,激活NF-κB,參與星形膠質細胞中炎癥介質的表達[18]。本研究中,H1R激動劑Pyri可抑制LPS誘導的Akt磷酸化水平增加,并降低NF-κB p65的磷酸化表達,提示Akt/NF-κB通路可能是H1R參與星形膠質細胞免疫調節的重要途徑。

綜上,本研究證明H1R激動劑可抑制LPS誘導的星形膠質細胞活化和炎癥因子的表達,其作用機制可能與抑制下游Akt/NF-κB通路的激活有關。H1R在星形膠質細胞上表現出抗炎特性,而在小膠質細胞上表現出促炎特性,揭示了其對炎癥調控的復雜性。為進一步探究H1R在中樞炎癥中的調節作用,我們后續將采用腺相關病毒結合星形膠質細胞的特異性啟動子GFAP,對腦內星形膠質細胞上的H1R進行過表達,再構建中樞炎癥模型,在體探究星形膠質細胞H1R的抗炎作用及調控機制。對腦內不同細胞上組胺受體作用的探究,有助于對組胺能信號通路在中樞炎癥相關疾病中的角色有更深入的了解,并尋找出針對性的治療靶點。