梔子苷抑制HSP70釋放改善風(fēng)濕熱痹證膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠血管新生的作用研究

舒 寅,甘珮榮,王 言,卜妍紅,吳 虹

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,新安醫(yī)學(xué)教育部重點實驗室,中藥復(fù)方安徽省重點實驗室,安徽 合肥 230012)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是一類慢性自身免疫性疾病,RA歸屬中醫(yī)“痹癥”、“絡(luò)病”范疇,是因外感風(fēng)濕熱邪,痹阻氣血經(jīng)絡(luò),滯留于關(guān)節(jié)筋骨而發(fā)病[1]。《素問》中“脈者,血之府也”提醒RA絡(luò)病實質(zhì)是滑膜血管新生。血管新生作為RA主要病理特征之一,是RA遷延不愈的根本原因[2]。血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cells, VECs)是血管新生的效應(yīng)細(xì)胞,受多種信號因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控。在RA病理狀態(tài)下,促/抑血管生成因子平衡打破,促血管生成因子占主導(dǎo)作用[3]。風(fēng)濕熱痹證被認(rèn)為是RA活動期的主要病機,此證型患者血清、滑膜液中熱休克蛋白70(heat shock proteins 70, HSP70)含量異常升高[4]。因此,辨證論治探究差異物HSP70在風(fēng)濕熱痹證滑膜血管新生的作用亟需展開深入研究。

HSP70-1A作為HSP70家族的一員,是一種應(yīng)激誘導(dǎo)蛋白,在大多數(shù)非應(yīng)激的正常細(xì)胞和組織中低水平表達(dá),在缺氧、炎癥、熱誘導(dǎo)等應(yīng)激條件下迅速產(chǎn)生并積累。應(yīng)激后在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮維持蛋白質(zhì)合成、折疊、降解和轉(zhuǎn)位的動態(tài)平衡作用,是重要的分子伴侶。之前被認(rèn)為只能在細(xì)胞內(nèi)環(huán)境存在并發(fā)揮作用,新的研究證實,HSP70-1A也存在于細(xì)胞外,并發(fā)揮出不同于熟知的分子伴侶功能,包括調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫、炎癥,血管新生[5]。近期研究發(fā)現(xiàn),HSP70能夠通過穩(wěn)定缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia-inducible factor-1, HIF-1)α亞基積累,參與多種疾病血管新生過程。細(xì)胞外HSP70與人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilic vein endothelial cells, HUVECs)表面受體緊密結(jié)合,通過細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK)依賴機制誘導(dǎo)血管新生[6]。因此,有效降低HSP70的胞外釋放和胞外HSP70與胞膜受體的結(jié)合,抑制滑膜血管新生,有望成為RA治療的新策略。

梔子,作為RA臨床常用清熱解毒通絡(luò)方君藥,主要藥效成分梔子苷(geniposide, GE)。課題組前期發(fā)現(xiàn)GE顯著改善關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜病變和血管新生[7]。GE不僅可以通過調(diào)節(jié)鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase 1, SphK1)表達(dá)和活性來緩解成纖維滑膜細(xì)胞的異常增殖,還可以抑制滑膜組織中促血管生成介質(zhì)的產(chǎn)生,恢復(fù)促/抑血管生成因子平衡[8]。梔子性寒,清熱利濕,宣痹通絡(luò),同時風(fēng)濕熱痹證病因以熱邪為主,熱性炎上,治療應(yīng)以清熱為基本原則,辨證論治。因此本實驗旨在探究GE是否通過抑制HSP70釋放改善風(fēng)濕熱痹證CIA大鼠滑膜血管新生。

1 材料與方法

1.1 動物與細(xì)胞雄性SPF級SD大鼠,6～8周齡,48只,體質(zhì)量210±10 g,購于濟(jì)南朋悅實驗動物繁育有限公司[合格證號:SCXK(魯)20190003],所有實驗均在安徽中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)下進(jìn)行(許可證號:AHUCM-rats-2021049),實驗過程中自然光照周期,自由飲水進(jìn)食。HUVECs:上海中喬新舟生物科技有限公司,貨號:DFSC-EC-01。細(xì)胞使用ECM培養(yǎng),其中含有5%胎牛血清,1%內(nèi)皮生長因子和1%青、鏈霉素,培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱,當(dāng)細(xì)胞密度至80%時進(jìn)行胰酶消化傳代。

1.2 試劑與儀器人工氣候造模箱:寧波江南儀器廠;YLS-7C型足趾容積測量儀:北京凱輝盛達(dá)科技發(fā)展有限公司;紅外熱成像儀:美國FLUKE公司;OLYMPUS BX51 高效熒光顯微鏡:上海富萊光學(xué)科技有限公司;GE:深圳海思安生物技術(shù)有限公司(hsag1899);甲氨蝶呤(M57520):上海吉至生化科技有限公司;弗氏完全佐劑(F5881):美國Sigma公司;雞Ⅱ型膠原(220184):美國Sigma公司;胎牛血清(fC04001-500):VivaCell;大鼠HSP70 ELISA試劑盒(1935)、人HSP70 ELISA試劑盒(1737):酶免生物;ECM(#1001):美國ScienCell研究實驗室;乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(A020-2-2):南京建成生物工程研究所;CD31 antibody(65058-1-1lg):武漢三鷹生物技術(shù)有限公司;VEGF-A antibody(F1019Y):武漢華美生物工程有限公司;HSP70 antibody(250141):成都正能生物技術(shù)有限公司。Cell Counting Kit 8(CCK-8)試劑盒(BS3508):白鯊生物科技有限公司;kFluor488 Click-iT EdU成像檢測試劑盒(KGA331-100):凱基生物公司。

1.3 風(fēng)濕熱痹證CIA大鼠模型的建立及分組給藥將48只大鼠以相同數(shù)量(n=8)分別隨機分為6組:正常對照組(Control)、CIA模型組(CIA)、風(fēng)濕熱刺激CIA模型組(CIA-S)、GE中劑量組(GE-M)、GE高劑量組(GE-H)和陽性藥組(MTX)。除正常組外的大鼠d 1在尾根部皮內(nèi)注射100 μL CFA與雞II型膠原乳劑(2 g·L-1)等體積混合物,d 7進(jìn)行二次免疫。從初次免疫當(dāng)天開始將除正常組和CIA組以外大鼠飼養(yǎng)在風(fēng)速5 m·s-1、溫度37 ℃、濕度90%的人工氣候造模箱中,每次2 h,每天2次,連續(xù)干預(yù)28 d后,GE-M、GE-H、MTX組大鼠分別用GE(60、120 mg·kg-1·d-1)、MTX(0.5 mg·kg-1·3d-1)灌胃兩周。

1.4 關(guān)節(jié)炎大鼠模型評價指標(biāo)通過關(guān)節(jié)炎指數(shù)、足爪腫脹容積(mL)、關(guān)節(jié)腫脹數(shù)來評估關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度,評估方法與我們之前的研究相同[9]。

1.5 關(guān)節(jié)表面溫度、彩色多普勒超聲和血液流變學(xué)指標(biāo)大鼠造模成功后,使用紅外熱成像儀檢測大鼠足、踝關(guān)節(jié)局部的表面溫度及熱成像圖譜,用于反映關(guān)節(jié)的發(fā)熱程度;大鼠適量吸入異氟烷麻醉,使用剃毛器對繼發(fā)側(cè)關(guān)節(jié)脫毛處理,在膝關(guān)節(jié)處涂抹偶合劑,選用Color Doppler-mode,將超聲探頭對準(zhǔn)膝關(guān)節(jié)處,檢測大鼠膝關(guān)節(jié)的血流信號;給藥最后一天,大鼠麻醉處理,使用含有肝素的一次性負(fù)壓采血管腹主動脈取血,置于冰上,上下顛倒以確保不發(fā)生凝血,送至安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院進(jìn)行血流變指標(biāo)的檢測,其中包括全血黏度、血漿黏度和紅細(xì)胞壓積。

1.6 HE染色及免疫組化取大鼠滑膜組織4%多聚甲醛進(jìn)行固定,乙醇脫水,二甲苯處理,石蠟包埋切片,蘇木精-伊紅(HE)染色切片,顯微鏡明場對關(guān)節(jié)滑膜組織進(jìn)行病理觀察,收集照片并進(jìn)行分析和處理。滑膜組織石蠟切片脫蠟至水分,抗原修復(fù)3% H2O2后浸泡6 min以消除內(nèi)源性過氧化物酶的干擾,PBS清洗5 min × 2次。滴加CD31、HSP70和VEGF的一抗溶液,在4 ℃下放置一夜。用辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG抗體37 ℃孵育20 min。用DAB顯色液染色3 min,蘇木精重染,浸泡置二甲苯中,進(jìn)行透明處理,再封片置光學(xué)顯微鏡觀察。

1.7 Western blot樣本加入適量RIPA裂解液、PMSF、蛋白酶和磷酸酶抑制劑,冰上裂解30 min,使用超聲破碎儀對其破碎處理,使其裂解更加充分,離心機4 ℃,12 000g,5 min,小心吸取上清,留取10 μL用于蛋白定量,加入適量的上樣緩沖液,金屬浴煮沸8 min,-40 ℃保存?zhèn)溆谩２捎脻褶D(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)印到NC膜上,5%的脫脂牛奶封閉2 h,一抗孵育4 ℃過夜,TBST搖洗3次,二抗室溫孵育1.5 h,TBST搖洗3次,最后使用ECL發(fā)光檢測試劑,在顯影儀中曝光成像,保存并使用ImageJ分析處理。

1.8 ELISA法用ELISA試劑盒檢測大鼠血清和細(xì)胞上清液中HSP70的水平,全程按照試劑盒說明書操作。

1.9 細(xì)胞HSP70釋放模型的建立取生長狀態(tài)良好的HUVECs,選用熱休克溫度(41～45)℃設(shè)立3個梯度并分組,刺激1 h后培養(yǎng)箱穩(wěn)定30 min后,Western blot檢測胞內(nèi)HSP70表達(dá)量,ELISA檢測胞外釋放量。取細(xì)胞上清液,根據(jù)說明書,通過酶標(biāo)儀檢測450 nm處每個樣品的A值并計算LDH相對含量。LDH含量 =(測量A值 - 空白A值)/(標(biāo)準(zhǔn)A值 - 空白A值)× 100%。選擇細(xì)胞毒性低且HSP70顯著升高的溫度(41 ℃)作為建立細(xì)胞模型的條件。

1.10 條件培養(yǎng)基(HUVECs-CM)的制備與質(zhì)控用不同濃度的GE(25、50和100 μmol·L-1)預(yù)處理細(xì)胞24 h,細(xì)胞換液處理,接下來使用上一步篩選出的溫度41 ℃水浴加熱細(xì)胞1 h,收集細(xì)胞上清液ELISA檢測胞外HSP70含量,收集細(xì)胞Western blot檢測HSP70表達(dá)情況。選擇最有效的GE濃度(100 μmol·L-1)用于接下來的條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)模型的構(gòu)建。

1.11 HUVECs-CM誘導(dǎo)模型的建立用不同體積分?jǐn)?shù)的HUVECs-CM(0%、25%、50%、75%、100%)刺激細(xì)胞24 h,CCK-8法檢測細(xì)胞活力。以最佳濃度(100%)的HUVECs-CM刺激細(xì)胞,檢測細(xì)胞增殖、水平遷移、垂直遷移和成管能力。

1.12 CCK-8實驗取生長狀態(tài)良好的HUVECs,96孔板每孔加入100 μL含7×103個HUVECs的細(xì)胞懸液。細(xì)胞貼壁后,使用不同體積分?jǐn)?shù)的條件培養(yǎng)基處理24 h。培養(yǎng)結(jié)束后,吸除舊培養(yǎng)基,每孔加入100 μL含10% CCK-8的培養(yǎng)基,培養(yǎng)2 h,于酶標(biāo)儀450 nm處測吸光度值,計算細(xì)胞活力。

1.13 EdU染色取生長狀態(tài)良好的HUVECs,24孔板提前加入細(xì)胞爬片,每孔加入1 mL含1×105個HUVECs的細(xì)胞懸液,待細(xì)胞融合至70%～80%后,分別用完全培養(yǎng)基、41 ℃-CM、41 ℃+GE-CM培養(yǎng)HUVECs 24 h后,吸棄舊培養(yǎng)基,使用含有EdU的培養(yǎng)基200 μL孵育2 h。4%多聚甲醛固定15 min,PBS搖洗3次,0.5% Triton X-100通透,每孔加入200 μL Click-iT反應(yīng)混合物,避光孵育30 min。接著,使用Hoechst 33342溶液對細(xì)胞進(jìn)行DNA復(fù)染。預(yù)先在載玻片上滴加適量抗熒光淬滅劑,取出爬片,細(xì)胞面緊貼載玻片,指甲油滴于四周封片,通風(fēng)櫥避光晾干,使用熒光倒置顯微鏡拍照觀察。

1.14 細(xì)胞劃痕實驗取生長狀態(tài)良好的HUVECs,6孔板每孔加入1 mL含1×105個HUVECs的細(xì)胞懸液,待細(xì)胞貼壁后,使用已經(jīng)滅菌的200 μL槍頭抵住直尺垂直于孔板底部用力均勻劃線,吸取PBS沿孔壁緩慢加入,洗去細(xì)胞碎片,此時在顯微鏡下攝取劃痕照片,記為0 h。分組給藥處理細(xì)胞24 h后,在顯微鏡下觀察并拍照,記為24 h。根據(jù)公式:劃痕愈合率=(劃痕面積0 h - 劃痕面積24 h)/ 劃痕面積0 h × 100%,計算細(xì)胞劃痕愈合率。

1.15 Transwell小室遷移實驗取生長狀態(tài)良好的HUVECs,Transwell小室上室加入200 μL含1×104個HUVECs的細(xì)胞懸液,在下室加入15%胎牛血清的完全培養(yǎng)基600 μL,細(xì)胞貼壁后,吸棄上室舊培養(yǎng)基,分組給藥處理24 h。使用棉簽輕輕擦去上室未透膜細(xì)胞,4%多聚甲醛固定20 min,結(jié)晶紫染色20 min,晾干。在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞垂直遷移情況并拍照,ImageJ分析穿膜細(xì)胞數(shù)量。

1.16 成管實驗取第7代生長狀態(tài)良好的HUVECs,取50 μL Matrigel基質(zhì)膠加入96孔板中,待膠凝固后,分組每孔加入100 μL不同的含藥細(xì)胞懸液,密度為每100 μL含7×103個HUVECs,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育4 h后,在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞成管情況并采集圖像。使用ImageJ軟件計算成管的數(shù)量和長度。

2 結(jié)果

2.1 GE緩解CIA-S大鼠炎癥建立了模擬RA活動期特征為紅、腫、熱、痛的CIA-S模型以及CIA模型,給予不同劑量的GE和陽性藥MTX。在初次免疫后,每7天進(jìn)行一次大鼠模型評價,數(shù)據(jù)顯示,CIA-S大鼠相較于CIA大鼠,癥狀出現(xiàn)時間早,高峰期高,持續(xù)時間長,體質(zhì)量漲幅也不同(Fig 1B)。d 28給藥后,GE和MTX明顯改善CIA-S大鼠癥狀(P<0.05,P<0.01),包括關(guān)節(jié)腫脹嚴(yán)重度(Fig 1A)、足腫脹數(shù)量(Fig 1C)、AI指數(shù)(Fig 1D)、足腫脹容積(Fig 1E)。GE(120 mg·kg-1)組與MTX(0.5 mg·kg-1)組治療效果相似,GE(60 mg·kg-1)組治療效果較高劑量組差,說明GE治療風(fēng)濕熱痹證大鼠關(guān)節(jié)炎有效且呈劑量依賴性。

2.2 GE逆轉(zhuǎn)CIA-S大鼠熱屬性指標(biāo)風(fēng)濕熱痹證CIA大鼠踝、趾關(guān)節(jié)紅、腫、熱,給藥后癥狀緩解(Fig 2A)。CIA-S大鼠關(guān)節(jié)表面溫度(35.39 ± 0.20)℃較正常組(27.37 ± 0.37)℃和CIA組(32.76 ± 0.23)℃明顯升高(P<0.01),給藥后向正常組恢復(fù)(P<0.01)(Fig 2B)。低切率下全血黏度越高,紅細(xì)胞聚集性越強,血液流變學(xué)結(jié)果顯示,與正常組相比,CIA組與CIA-S組血漿黏度升高,但兩組間無明顯差異;CIA組與CIA-S組紅細(xì)胞壓積均高于正常組且CIA組較CIA-S組更高。這反映CIA模型在風(fēng)濕熱的條件刺激下,表現(xiàn)為遇熱血流快,血液黏度降低(Fig 2C,D)。

2.3 GE改善CIA-S大鼠滑膜病理形態(tài)HE結(jié)果顯示(Fig 3),與正常相比,CIA組與CIA-S組大鼠滑膜組織中可見異常增殖且排列紊亂的滑膜細(xì)胞,大量浸潤的炎性細(xì)胞以及微血管形成,且CIA-S更嚴(yán)重。GE和MTX給藥可有效改善這種異常病理形態(tài)。

2.4 GE抑制CIA-S大鼠滑膜血管新生應(yīng)用彩色多普勒超聲觀察大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜血流信號顯示(Fig 4A),正常組無明顯血流信號,而CIA與CIA-S組有點狀和短線狀血流信號,且CIA-S組較CIA組更為明顯,這表明兩種大鼠模型膝關(guān)節(jié)滑膜組織中均有新生血管形成并且CIA-S組血管新生更強烈。GE和MTX組較CIA-S組觀察到的血流信號減少。此外,采用免疫組化和Western blot檢測大鼠滑膜組織中血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31和促血管生成因子VEGF表達(dá)水平(Fig 4B-G),與正常組比,CIA和CIA-S組CD31和VEGF表達(dá)明顯增加(P<0.01)。與CIA-S組相比,CIA組兩者表達(dá)量稍少,GE和MTX干預(yù)后,CIA-S大鼠滑膜CD31和VEGF水平降低。表明CIA-S大鼠滑膜血管新生明顯,GE具有抑制血管新生的作用。

Fig 1 GE alleviated inflammation in CIA-S rats n=8)

Fig 2 GE reversed CIA-S rat thermal properties indicator n=8)

Fig 3 GE improved synovial pathology in CIA-S rats (×100) n=8)

2.5 GE減少HSP70在CIA-S大鼠滑膜組織與血清中的含量免疫組化結(jié)果(Fig 5A, B)和滑膜組織Western blot結(jié)果(Fig 5C, D)顯示,CIA-S大鼠滑膜組織中HSP70表達(dá)較正常組大鼠明顯升高(P<0.01)。GE和MTX給藥抑制CIA-S大鼠滑膜HSP70表達(dá)(P<0.01)。ELISA結(jié)果顯示(Fig 5E),CIA-S大鼠血清中HSP70較正常組大鼠明顯升高(P<0.01)。GE和MTX給藥會減少CIA-S大鼠血清中HSP70的表達(dá)(P<0.01)。

2.6 GE抑制熱誘導(dǎo)的HSP70表達(dá)和釋放首先建立熱誘導(dǎo)表達(dá)釋放HSP70的細(xì)胞模型,選用熱休克溫度(41～45)℃設(shè)立梯度并分組,刺激1 h后培養(yǎng)箱穩(wěn)定30 min后Western blot檢測胞內(nèi)HSP70表達(dá)量,ELISA檢測胞外釋放量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)41℃刺激明顯升高HSP70釋放量和表達(dá)量(Fig 6A-C)(P<0.01),并且41 ℃條件下細(xì)胞毒性較43 ℃與45 ℃低(P<0.05),因此我們選用41 ℃刺激1 h作為誘導(dǎo)HSP70表達(dá)和釋放升高模型的刺激劑。在細(xì)胞熱刺激造模前1天分別GE(25、50、100 μmol·L-1)處理給藥,結(jié)果表示HSP70胞內(nèi)含量降低,與模型組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)(Fig 6E,F),HSP70胞外釋放量經(jīng)給藥處理后明顯降低(P<0.05,P<0.01)(Fig 6G),因此,GE能有效降低熱刺激導(dǎo)致的HSP70表達(dá)和釋放的升高,且在25～100 μmol·L-1范圍內(nèi)呈劑量性依賴,因此條件培養(yǎng)基的制備選用GE 100 μmol·L-1。CCK-8結(jié)果顯示(Fig 6H),在不同體積分?jǐn)?shù)的條件培養(yǎng)基刺激下HUVECs增殖能力增強,體積分?jǐn)?shù)為0.75和1時差異有統(tǒng)計學(xué)意義,且體積分?jǐn)?shù)為1時增殖活性最強,因此選擇體積分?jǐn)?shù)為1的條件培養(yǎng)基用于接下來的實驗(P<0.01)。

Fig 4 GE inhibited synovial angiogenesis in CIA-S rats n=8)

2.7 GE抑制HSP70釋放進(jìn)而改善HUVECs生物學(xué)功能使用條件培養(yǎng)基(HUVECs-CM)處理HUVECs,分別為41 ℃加熱1 h,GE(100 μmol·L-1)處理24 h后41 ℃加熱1 h的細(xì)胞上清液刺激細(xì)胞,并以單獨刺激65 μg·L-1的HSP70作為對照(與條件培養(yǎng)基中HSP70含量相似)。具體分組為:Control組,41 ℃-CM組,GE+41 ℃-CM組,HSP70組。EdU染色實驗檢測HUVECs DNA復(fù)制能力,評價HUVECs增殖能力。EdU結(jié)果顯示(Fig 7A),與Control組相比,41 ℃-CM組和HSP70組增殖能力增強,GE+41 ℃-CM組增殖能力較41 ℃-CM組減弱。采用細(xì)胞劃痕實驗和Transwell小室實驗分別檢測HUVECs水平遷移和豎直遷移能力(Fig 7B-E)。41 ℃-CM組和HSP70組的水平和豎直遷移能力均明顯高于對照組(P<0.01),GE+41 ℃-CM組遷移能力較41 ℃-CM組明顯減弱(P<0.05)。采用Matrigel基質(zhì)膠成管實驗檢測HUVECs細(xì)胞管腔形成能力。如Fig 7 F-H所示,與Control組相比,41 ℃-CM組和HSP70組HUVECs形成連續(xù)、密集的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),管腔數(shù)目和長度明顯增加(P<0.01)。GE+41 ℃-CM組成管能力較41 ℃-CM組明顯減弱(P<0.05)。

Fig 5 GE reduced HSP70 in synovial tissue and serum of CIA-S rats n=8)

Fig 6 GE reduced heat-induced HSP70 expression and release n=3)

Fig 7 GE inhibited HSP70 release and thereby improved biological function of HUVECs n=3)

3 討論

新生微血管、異常增殖的滑膜細(xì)胞與炎性細(xì)胞構(gòu)成血管翳,侵蝕軟骨進(jìn)而造成關(guān)節(jié)不可逆損傷。血管新生是形成和維持RA血管翳的重要因素。在RA病理狀態(tài)下,促/抑血管生成因子平衡打破,促血管生成因子占主導(dǎo)作用,促進(jìn)血管新生。抑制內(nèi)源性促血管生成因子產(chǎn)生的藥物已在臨床上被證明有效[10]。因此,闡明一種新的血管生成因子的功能對理解血管新生的復(fù)雜機制有重要意義。已有研究表明,應(yīng)激誘導(dǎo)蛋白HSP70發(fā)揮出不同于熟知的分子伴侶功能,作為新型促血管生成因子發(fā)揮作用[6],但其在RA滑膜血管新生中的作用還尚不清楚。

研究表明,風(fēng)濕熱痹證患者血清、滑膜液中HSP70含量異常升高。合適的動物模型是實驗研究的基礎(chǔ)。CIA是一種內(nèi)源性自身抗原介導(dǎo)自身免疫性疾病的模型,在臨床表現(xiàn)、病理及免疫學(xué)變化等方面與RA有許多相似之處,是研究RA病理機制和評價RA藥物療效的理想的動物模型[11]。CIA大鼠的基礎(chǔ)屬性偏向熱,病理實質(zhì)為炎癥細(xì)胞浸潤,經(jīng)風(fēng)濕熱刺激后,血管翳形成及骨質(zhì)破壞更為明顯。本研究在CIA模型的基礎(chǔ)上,使用人工氣候造模箱,控制溫度、濕度和風(fēng)速,建立病證結(jié)合的風(fēng)濕熱痹證CIA大鼠模型。以治療RA的金標(biāo)準(zhǔn)藥物MTX為陽性對照,探究GE(60、120 mg·kg-1)對CIA-S大鼠的治療作用。結(jié)果顯示,CIA-S較CIA關(guān)節(jié)炎峰值提前、持續(xù)時間延長,消退緩慢,血管新生與HSP70表達(dá)更為強烈。這與之前的研究相同[4],可能表明HSP70是區(qū)別于風(fēng)濕熱痹證與其他證型的差異物,HSP70含量多少同血管新生嚴(yán)重程度趨勢相同。熱屬性是評價CIA-S模型的特殊指標(biāo),其中CIA-S關(guān)節(jié)表面溫度平均值達(dá)到35.39 ℃,器官的變化及血流受阻都會引起血流和熱量從深層組織傳導(dǎo)至局部皮膚,導(dǎo)致溫度升高[12]。CIA-S血液黏度及血流速度在風(fēng)濕熱條件刺激下分別表現(xiàn)為降低、加快,符合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為RA存在血液黏度增高的狀態(tài)[13]。GE干預(yù)明顯抑制CIA-S大鼠關(guān)節(jié)炎癥,改善滑膜病理,減少膝關(guān)節(jié)滑膜血流信號以及抑制CD31和VEGF的表達(dá),提示GE對CIA-S大鼠治療作用明顯著,可以抑制CIA-S大鼠滑膜血管新生。我們檢測了各組別滑膜和血清中HSP70的含量,進(jìn)一步探究GE體內(nèi)改善滑膜血管新生是否與HSP70表達(dá)釋放相關(guān)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與空白對照組相比,GE干預(yù)后明顯減少HSP70在CIA-S大鼠滑膜組織表達(dá)與血清含量,這提示GE改善RA滑膜血管新生可能與HSP70有關(guān)。

如前所示,我們繼續(xù)進(jìn)行體外實驗探究HSP70對HUVECs生物學(xué)功能的影響以及GE的干預(yù)作用。熱應(yīng)激41～45 ℃是誘導(dǎo)HSP70表達(dá)和釋放最直接最有效的因素之一。本研究在選擇41 ℃水浴加熱1 h建立HSP70胞外釋放模型,結(jié)果發(fā)現(xiàn)GE能夠降低熱應(yīng)激后HUVECs HSP70的蛋白含量。胞外HSP70刺激HUVECs增殖、遷移和形成管狀結(jié)構(gòu),進(jìn)一步支持HSP70在RA血管新生中的作用。熱應(yīng)激的條件培養(yǎng)基同時也發(fā)揮相同作用,GE預(yù)處理后明顯逆轉(zhuǎn),這可能與GE抑制熱應(yīng)激誘導(dǎo)的HSP70釋放有關(guān)。體外實驗進(jìn)一步證實了GE抑制HSP70釋放改善RA滑膜血管新生。

此研究當(dāng)前還存在局限性,HSP70作為細(xì)胞因子發(fā)揮作用的前提是釋放至胞外,然而HSP70的胞外釋放機制仍不明確。它區(qū)別于普通分泌型蛋白,通過非經(jīng)典的、獨立于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體的途徑被運輸?shù)劫|(zhì)膜,主動釋放可能與脂筏相關(guān),通過與細(xì)胞內(nèi)葉磷脂酰絲氨酸結(jié)合外翻至胞外空間[14-15]。有研究表明,非應(yīng)激細(xì)胞的脂筏中含有穩(wěn)定的HSP70,細(xì)胞受到刺激時,細(xì)胞內(nèi)HSP70選擇性在脂筏中聚集增加,同時HSP70的釋放也增加,用甲基環(huán)糊精破壞脂筏的結(jié)構(gòu)后,HSP70釋放明顯降低[16]。同時,課題組前期也發(fā)現(xiàn)GE靶向作用于SphK1,抑制SphK1過度轉(zhuǎn)位至胞膜。有研究發(fā)現(xiàn)質(zhì)膜中的脂筏微域很有可能是SphK1再定位的目標(biāo)[17]。GE減少胞外的HSP70分泌是否與抑制SphK1再定位有關(guān)仍待探究。

綜上所述,在RA血管新生過程中,過度分泌的HSP70作用于HUVECs,促進(jìn)病理性血管新生;GE體內(nèi)、外有效的減少HSP70釋放改善RA滑膜血管新生。在之后的研究中,我們將更深入的闡明GE抑制HSP70釋放的機制,為中藥治療RA血管新生的研究與應(yīng)用提供新的實驗依據(jù)。