基于網絡藥理學及動物實驗研究溫腎宣痹湯抗骨質疏松的機制

王海平,袁兆豐,夏天衛,張 超,沈計榮

(1. 南京中醫藥大學附屬醫院/江蘇省中醫院骨傷科,江蘇 南京 210029;2. 鹽城市大豐中醫院骨傷科,江蘇 鹽城 224100)

骨質疏松癥(osteoporosis,OP)是指由于多種原因導致的骨量和骨密度減低、骨小梁微結構損傷,易發生脆性骨折的一種全身性代謝性骨病[1]。OP是絕經后婦女及老年患者的常見病、多發病,容易引發脆性骨折而致殘、致死,嚴重影響患者的健康,造成了嚴重的社會負擔。據估計[2],到2035年我國OP相關骨折的年度數量將達到466萬例,花費約1 300億元;到2050年將達到599萬例,花費約1800億元;其中女性患者數量約占75%,所以對OP的治療方法研究具有重大的現實意義。目前治療OP西藥包括雙膦酸鹽類、雌激素類、RANKL抑制劑等[1],常需聯合用藥,副作用大,費用高。中藥、中成藥治療OP顯示出獨特優勢,目前骨質疏松診療指南推薦的有骨碎補總黃酮、淫羊藿苷、人工虎骨粉等[1]。溫腎宣痹湯(wenshen xuanbi tang,WSXBT)是江蘇省中醫院諸方受教授的名方,治療OP療效確切[3],為了研究WSXBT治療OP的作用及機制,應用網絡藥理學和分子對接技術探索WSXBT治療OP的有效成分及核心靶點,并用動物實驗的方法進行驗證,研究結果將進一步明確WSXBT治療OP的作用機制,以期拓展其臨床應用。

1 材料與方法

1.1 WSXBT治療OP的網絡藥理學及分子對接

1.1.1篩選WSXBT成分及作用靶點 以“桂枝”、“細辛”、“附子”、 “甘草”、“木香”、 “白術”、“茯苓”、“薏苡仁”、“澤瀉”、“山茱萸”為關鍵詞,查詢中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP),并以口服生物利用度(OB)≥0.30,類藥性(DL)≥0.18為條件獲取藥物活性成分及其所對應靶點。“狗脊”“天麻”活性成分來自Herb數據庫(http://herb.ac.cn/),并用SwissAdme數據庫(http://www.swissadme.ch/)進行分子篩選,篩選條件為“GI absorption 為High”, “Druglikeness”最少有三個“Yes”,篩選的有效成分用SwissTargetPrediction數據庫進行靶點預測,其中篩選條件為“Probability*≥0.10”。最后基于UniProt數據庫(https://www.uniprot.org/)對靶蛋白進行標準化處理。

1.1.2篩選WSXBT治療OP靶點 以“Osteoporosis”為檢索詞分別檢索DisGenet (https://www.disgenet.org/home/)、OMIM(http: //www.omim.org/)、GeneCards(https://www.genecards.org/)、GEO(https://www.ncbi. nlm. nih. gov/geo/)、MalaCards(https://www.malacards.org/)數據庫,并對潛在靶點做并集,獲得OP疾病靶點。WSXBT藥物靶點與OP疾病靶點交集作為WSXBT治療OP的潛在靶點。

1.1.3PPI網絡的構建及核心靶點的篩選 將1.1.2項中獲取的潛在靶點輸入STRING(https://cn.string-db.org)數據庫,以“Homo sapiens”、“置信度≥0. 90”為條件制作PPI網絡,并利用Cytoscape軟件進行可視化,通過2倍平均度值(degree)、一倍的中介中心度值(betweenness centrality)、一倍的緊密度值(closeness centrality)篩選出23個核心靶點。

1.1.4生物功能注釋與通路富集分析 通過Metascape(https://metascape.org)數據庫對WSXBT治療OP的核心網絡靶標進行GO生物學分析,研究其靶點的生物過程; 進一步利用KEGG通路富集分析,探究WSXBT核心靶標干預OP的重要信號通路。

1.1.5構建藥物-成分-靶點-疾病互作網絡 將1.1.2中獲得的潛在靶點與作用于潛在靶點的有效成分構建藥物-成分-靶點-疾病互作網絡,并通過“Degree”篩選出關鍵成分。

1.1.6分子對接 關鍵化合物槲皮素(quercetin)、山奈酚(kaempferol)、柚皮素(naringenin)、異補骨脂黃酮(isobavachin)、β-谷甾醇(sitosterol)、甘草查耳酮A(licochalcone a)、豆甾醇(stigmasterol)、兒茶精[(+)-catechin]、隱品堿(cryptopin)、芝麻素(sesamin)等 2D結構從PubChem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取,并運用Chem3D 19.0軟件把2D結構轉化為3D結構;在PDB數據庫(https://www.rcsb.org/)中獲取 PIK3R1(5gji)、AKT1(1unq)核心靶點3D結構,并利用PyMOL 2. 2. 0軟件去除其配體及水分子;最后利用AutoDockTools 1.5.7軟件將關鍵化合物配體與核心靶點受體進行對接。

1.2 WSXBT治療OP的實驗研究

1.2.1動物 SD大鼠,SPF級,♀,體質量170～230 g,生產許可證號SCXK(浙)2019-0001,使用許可證號 SYXK(蘇)2021-0040,由浙江維通利華實驗動物技術有限公司提供。倫理審查批準編號 IACUC-20220711-01,動物飼養于江蘇省藥物研究所有限公司屏障系統內。

1.2.2主要藥物試劑與儀器 WSXBT方劑購于江蘇省中醫院,方藥組成:狗脊10 g(批號:22021508)、附子10 g(批號:2205091)、細辛6 g(批號:220503)、山茱萸10 g(批號:20220603)、桂枝10 g(批號:20221202-02)、木香10 g(批號:20220401-01)、天麻10 g(批號:20220401-03)、茯苓12 g(批號:20220202-01)、澤瀉10 g(批號:20220601-01)、薏苡仁15 g(批號:20220601-02)、白術10 g(批號:220601)、甘草10 g(批號:220501)。阿侖膦酸鈉片(福善美)70 mg/片(杭州默沙東制藥有限公司,批準文號:國藥準字J20130085),異氟烷(河北金達福藥業有限公司 批準文號:獸藥字031217015),PI3K抗體、p-PI3K抗體、AKT抗體、p-AKT抗體(abcam公司,ab191606、ab182651、ab179463、ab192623),β-actin抗體(Bioswamp,MAB48206),辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG(H+L)(Lot.A0216)、山羊抗兔IgG(BIOMIKY,MK103A),骨保護素(OPG)、核因子kb受體活化因子配體(RANKL)、Ⅰ型前膠原氨基端肽(PINP)Elisa試劑盒(武漢貝茵萊生物科技有限公司,Cat.No:RA20507、RA20750、RA20172)。動物麻醉機(上海塔望生物科技有限公司,型號:AM-1005A),冷凍研磨儀(上海凈信實業發展有限公司,設備編號:APP-SAM-064),電熱恒溫培養箱(上海精宏實驗設備有限公司, 設備編號:APP-GEN-008),光吸收讀板機(Molecular Devices,設備編號:APP-SAM-046),洗板機(Thermo Fisher,設備編號:APP-TOX-039),力學測試儀(MTS Acumen), Micro-CT影像系統(廠家:德國Bruker公司,型號:SkyScan 1176),輪轉式切片機(廠家:Leica,型號:RM2235),烘片機(廠家:Leica,型號:HI1220)。

1.2.3分組、造模、給藥及取材 36只SD大鼠隨機分為6組: 假手術組(Sham)、模型組(OVX) 、阿侖膦酸鈉組(ALN)、溫腎宣痹方低劑量組(WSD)、溫腎宣痹方中劑量組(WSZ)、溫腎宣痹方高劑量組(WSG),每組6只。選用異氟烷吸入式麻醉,麻醉成功后取俯臥位,固定大鼠,于背部正中線旁開約1 cm處作約2 cm縱行切口,切除卵巢,縫合皮下組織及皮膚。假手術組采用相同手術方法,僅切除卵巢周邊等量的脂肪組織。造模成功后進行藥物灌胃干預,溫腎宣痹方高劑組予22.14 g·kg-1·d-1,中劑量組予11.07 g·kg-1·d-1,低劑量組予5.54 g·kg-1·d-1,阿侖膦酸鈉組給予6.25 mg·kg-1·w-1阿侖膦酸鈉,假手術組及模型組給予等量生理鹽水,連續灌胃12周。12周后禁食12 h麻醉大鼠,打開腹腔,暴露腹主動脈,行腹主動脈采血約5～10 mL,促凝離心管中靜置后經離心得血清,置于-80 ℃保存。分離大鼠雙側股骨及脛骨,去除骨組織周圍軟組織。

1.2.4血清中OPG、RANKL、PINP指標檢測 取凍存血清室溫解凍,按照 ELISA 試劑盒說明書進行操作,檢測血清中OPG、PINP、RANKL因子含量。

1.2.5Micro-CT檢測 采用 Micro-CT技術檢測大鼠左股骨組織微結構及骨密度變化。應用德國Bruker公司生產的微CT成像系統進行掃描,空間分辨率為9 μm。然后分別用內置軟件DataViewer觀察股骨三視圖、CTvox進行三維重建和CTAn計算骨密度及骨小梁參數。

1.2.6股骨生物力學檢測 通過骨科生物力學測試儀測定大鼠左側股骨生物力學,將股骨水平放置在測試儀的兩個支撐點上,跨度為20 mm,探頭作用于股骨中點處,下壓速度為0.02 mm·s-1直至其斷裂,分析出最大載荷、彈性載荷等指標。

1.2.7脛骨組織病理學檢測 大鼠脛骨用福爾馬林(0.10)室溫固定3 d, EDTA(0.10)脫鈣,冠狀面切片,層厚為4 μm,依次蘇木精、伊紅染色,封片,鏡檢。

1.2.8PI3K/Akt通路蛋白檢測 提取大鼠右側股骨組織總蛋白,測定蛋白濃度,以40 μg總蛋白進行上樣電泳,轉膜,在Western blot快速封閉液中室溫孵育20 min封閉非特異性結合位點,加入 PI3K、p-PI3K、Akt 和p-Akt一抗4 ℃孵育過夜,TBST洗膜3次,相應的二抗孵育1 h后TBST洗膜,滴加ECL發光試劑顯影。

2 結果

2.1 WSXBT治療OP的網絡藥理學和分子對接結果

2.1.1WSXBT治療OP疾病潛在靶點的篩選 從WSXBT中共篩選出156個活性成分,靶點550個。OP疾病靶點從DisGenet數據庫中收集到1 149個,OMIM數據庫中46個,GeneCards數據庫中1 373個,GEO數據庫中304個,MalaCards數據庫中853個,對潛在靶點做并集,共獲得3 085個疾病靶點。將WSXBT藥物靶點與OP疾病靶點做交集,篩選到WSXBT治療OP的潛在靶點229個。

2.1.2PPI及“藥物-成分-疾病-靶點”網絡圖構建 利用Cytoscape 3.9.1軟件根據Degree從大到小進行篩選,Degree較高的可作為核心靶點,篩選出STAT3、PIK3R1、RELA、AKT1、PIK3CA等23個核心靶點,運用Cytoscape 3.9.1軟件展現核心靶點互作圖(Fig 1)。WSXBT治療OP的潛在靶點229個,作用于潛在靶點的活性成分144個,另外12個活性成分舍棄,構建“藥物-成分-靶點-疾病” 網絡圖,篩選出核心成分包括槲皮素、異補骨脂黃酮、β-谷甾醇等。

Fig 1 PPI network map of core targets

2.1.3GO功能注釋及KEGG通路分析 WSXBT治療OP的核心靶點在Metascape數據庫中進行GO富集分析,以“PValue Cutoff”為0.01、“Min Enrichment”為1.5為篩選條件,得到生物過程、細胞組分和分子功能模塊相關條目分別為773、31和57個,根據“Enrichment”度分別選取前10進行展示(Fig 2),有顯著性的功能包括一氧化氮合酶調節活性、絲裂原活化蛋白激酶活性、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性、配體激活的轉錄因子活性等。KEGG通路富集分析共發現145條信號通路,選取前 20個相關的信號通路進行展示(Fig 3),包括PI3K/Akt 信號通路、缺氧誘導因子1信號通路 、破骨細胞分化信號通路、雌激素信號通路等。

Fig 2 GO function enrichment analysis

Fig 3 KEGG pathway enrichment analysis

2.1.4分子對接 對PI3K、Akt核心靶點與槲皮素、異補骨脂黃酮、β-谷甾醇等關鍵成分進行分子對接,結合能是分子之間結合所需要的能量,負值代表自然狀態下可以結合,負值越小越容易結合,一般認為結合能≤-5.0 kJ·mol-1有較好結合活性且較穩定[4],具體結合能見(Tab 1),對部分分子對接結合示意圖進行展示(Fig 4)。

2.2 WSXBT對OP大鼠的影響

Tab 1 Molecular docking results

2.2.1WSXBT對血清中OPG、RANKL、PINP的影響 如Tab 2所示,與Sham組比較,OVX組大鼠血清中 OPG 、PINP、OPG /RANKL水平明顯降低,RANKL水平明顯升高,差異有統計學意義(P<0.01);與 OVX組比較,WSZ、WSG組大鼠血清中 OPG水平升高,差異有統計學意義(P<0.05),WSD、WSZ、WSG、ALN組大鼠血清中PINP水平升高,差異有統計學意義(P<0.01);與 OVX組比較,WSZ、WSG、ALN組大鼠血清中 RANKL水平降低, OPG/RANKL水平升高,差異有統計學意義(P<0.01)。

Tab 2 Comparison of OPG, RANKL and PINP levels in serum of rats in each group

2.2.2WSXBT對骨密度及骨組織微結構的影響 如Fig 5所示,Micro-CT二維結構及三維結構顯示,WSXBT可明顯提高大鼠密度,同時改善骨組織微結構。與OVX組比較,其中ALN組及WSG組骨密度(bone mineral density,BMD)明顯提高,差異有統計學意義(P<0.01),WSD及WSZ組骨密度提高,差異有統計學意義(P<0.05);與OVX組比較,ALN組及WSZ、WSG中藥組可提高骨小梁數(trabeculae number,Tb.N)、骨小梁厚度(trabeculae thickness,Tb. Th)、骨體積/組織體積(bone volume/tissue volume, BV/TV),降低小梁分離度(trabecular separation,Tb.Sp)。

2.2.3WSXBT對股骨生物力學的影響 與Sham組大鼠相比,OVX組大鼠股骨彈性載荷及最大載荷明顯降低(P<0.01);與OVX組相比,ALN組大鼠股骨彈性載荷及最大載荷明顯升高(P<0.01),給予WSXBT后,WSZ、WSG組大鼠股骨彈性載荷及最大載荷明顯升高(P<0.01),表明WSXBT可以改善大鼠生物力學性能(Tab 3)。

Tab 3 Comparison of elastic load and maximumload in each group

Fig 4 Schematic diagram of molecular docking results

Fig 5 Two-dimensional structure and three-dimensional structure of rats femur Micro-CT

2.2.4WSXBT對脛骨組織病理學的影響 脛骨近端冠狀位HE染色結果顯示(黑色箭頭所示為骨骺線):Sham組骨小梁分布均勻、致密,骨髓中脂滴極少,骨小梁連續且連接成網狀;OVX組骨小梁斷裂,分布雜亂、稀疏,相互分離,髓腔內見大量脂滴聚集; 與OVX組相比,WSD、WSZ組骨小梁排列較整齊,骨小梁稀疏、斷裂好轉,髓腔內脂滴減少;與OVX組相比,WSG及ALN組骨小梁數量明顯增加,厚度明顯提高,排列均勻,骨小梁間距縮小,并且髓腔內脂滴聚集明顯變少(Fig 6)。

Fig 6 Pathological morphology of femoral tissues of rats (×40)

Fig 7 Protein expression of p-PI3K, p-Akt, PI3K, Akt in rat femoral *P<0.05,**P<0.01 vs Sham; #P<0.05,##P<0.01 vs OVX.

2.2.5WSXBT對骨組織中PI3K、Akt蛋白的影響 如Fig 7所示,與Sham組比較,OVX組大鼠骨組織中p-PI3K和 p-Akt蛋白表達水平降低(P<0.05);與OVX組比較,WSZ、WSG組大鼠骨組織中p-PI3K和 p-Akt蛋白表達水平升高(P<0.05)。

3 討論

OP是中老年人特別是絕經后婦女的一種常見病、多發病,因其發病率高,容易并發骨質疏松性骨折[5],致殘率、致死率高,因此,預防和治療OP具有重要的臨床意義。OP屬中醫“骨痿”、“骨枯”、“骨痹”范疇,其病因病機多與肝腎虧虛、氣血瘀滯、脾腎不足等相關。絕經后骨質疏松患者多有腎陰虛癥狀,但陰陽互根互用,互相轉化,陰虛日久常常導致陽虛,而腎陽是人體命門之火,腎精得命門之火的溫養才能夠發揮其滋養的作用,脾胃需要命門之火的溫煦才能夠發揮其運化水谷而生后天之精的功能。諸方受教授認為骨質疏松患者常常伴隨脾腎陽氣虧虛,陽虛則津液運化失常,寒濕痹阻經絡,疼痛乃生。WSXBT中附子、山萸肉、細辛、狗脊及桂枝溫補肝腎;白術、薏苡仁、茯苓、澤瀉健脾除濕;木香、天麻行氣除痹止痛;全方補中有瀉、肝脾腎同補、扶正去邪、標本兼治,對3種類型OP都有一定的療效,臨床上臨證加減治療OP療效確切。

本實驗中阿侖膦酸鈉組及中藥組大鼠骨密度升高,骨組織微結構、組織病理學明顯改善,血清中PINP水平升高,OPG/RANKL水平降低。Ⅰ型膠原是礦化骨中唯一的膠原類型,PINP是Ⅰ型膠原產生時切下來的氨基端末端肽,是骨形成的特異性標志物之一,且受晝夜變化及飲食影響最小[6-7]。絕經后OP患者失去了雌激素對RANKL的抑制作用,導致RANKL誘導的破骨細胞生成增加,破骨增加,導致OP,而OPG可以與RANKL競爭其受體RANK,減少破骨細胞的生成,OPG/ RANKL比值在破骨細胞分化中具有重要的作用[8-9]。 提示WSXBT可能通過促進骨形成,提高OPG/RANKL比值抑制破骨細胞的生成來達到抗OP的目的。

本研究通過網絡藥理學得到WSXBT共有156個藥物活性成分,綜合分析得到WSXBT治療OP的關鍵成分包括槲皮素、柚皮素、β-谷甾醇、芝麻素等。研究發現槲皮素通過升高Bcl-2、p-mTOR/mTOR、p-Akt/Akt和p-PI3K/PI3K的表達,明顯逆轉檸檬酸鐵銨對MC3T3-E1細胞成骨分化的抑制作用[10]。柚皮素是狗脊及甘草的共有活性成分,研究顯示柚皮素可降低超氧化物歧化酶、丙二醛等超氧化物歧化酶水平,升高血清中護骨素和股骨組織中PI3K蛋白表達水平,明顯改善OP大鼠骨密度[11]。β-谷甾醇是附子、桂枝、木香、山茱萸、薏苡仁、澤瀉、甘草共有成分,研究發現β-谷甾醇具有抗菌、抗炎、抗氧化、降脂、調節骨代謝等多種生物學作用[12]。芝麻素是細辛的活性成分,有研究顯示芝麻素可升高去卵巢骨質疏松大鼠骨鈣素和Ⅰ型膠原表達,促進骨重塑,有明顯的抗骨質疏松作用[13]。提示WSXBT可能是通過槲皮素、柚皮素、β-谷甾醇、芝麻素等活性成分治療OP。

進一步通過對WSXBT治療OP的作用靶點的PPI分析、GO 分析和 KEGG 通路分析,篩選核心靶點有STAT3、PIK3R1、AKT1、RELA、PIK3CA等。分子功能與蛋白激酶結合、轉錄因子結合、磷酸酶結合、蛋白絲氨酸激酶活性、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、蛋白磷酸酶結合等相關;KEGG通路富集分析主要有PI3K-Akt信號通路、雌激素信號通路、NF-kappa B信號通路、破骨細胞分化信號通路等。核心靶點PIK3R1、Akt1是PI3K-Akt信號通路上重要的節點,對成骨細胞、破骨細胞都有重要的調節作用,與OP關系密切[14-15]。人工虎骨粉是骨質疏松診療指南中推薦用藥[1],研究顯示可以激活PI3K/Akt通路促進MC3T3-E1成骨細胞的增殖、分化和礦化來促進成骨,抑制其凋亡[16]。牡荊素可以通過促進PI3K、Akt和內皮細胞NO合成酶(eNOS)的磷酸化增強內皮細胞的遷移和管的形成,對缺氧處理的EAhy926細胞有保護作用,修復OP大鼠骨損傷,促進成骨細胞的生化指標和血管生成指標[17]。分子對接顯示,PIK3R1、AKT1與關鍵成分槲皮素、山奈酚、柚皮素、β-谷甾醇等對接能量全部小于-5 kJ·mol-1,表示關鍵成分與核心靶點結合比較穩定,提示WSXBT可能是通過上述關鍵活性成分靶向PIK3R1、AKT1等核心靶點達到抗OP的目的。本研究通過實驗驗證發現與假手術組比較,模型組大鼠p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt明顯降低;與模型組大鼠比較,WSZ、WSG組大鼠p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt明顯升高,提示WSXBT可能通過PI3K/Akt通路改善絕經后骨質疏松大鼠骨密度;阿侖膦酸鈉屬于雙膦酸鹽類抗骨質疏松藥物,其抗骨質疏松主要通過抑制破骨細胞功能,從而抑制骨吸收,所以與模型組比較,阿侖膦酸鈉組大鼠PI3K/Akt通路蛋白無明顯升高。

綜上,本研究借助網絡藥理學及分子對接技術,初步探得WSXBT治療OP的機制,動物實驗驗證WSXBT可提高骨質疏松大鼠骨密度,加強骨組織生物力學性能,逆轉骨小梁破壞等病理損傷。其機制可能是通過提高OPG/RANKL比值及激活PI3K/Akt通路來達到抗骨質疏松的目的。本實驗仍有其局限性,動物實驗只驗證了部分核心靶點,不夠全面,再者未進行細胞實驗進一步探究WSXBT對成骨、破骨細胞的影響,這將是今后課題組團隊研究的方向,進一步探究WSXBT治療OP的作用機制,為其臨床運用提供科學依據與新的思路。