基于網絡藥理學和分子對接探究祖卡木顆粒治療支氣管哮喘的作用機制

候艷敏,徐 梅,張麗娟,李俞瑤,周文欣,王航宇,王金輝,3,劉 冬,張 珂

(1.石河子大學藥學院/新疆植物藥資源利用教育部重點實驗室,2. 石河子大學醫學院第一附屬醫院,新疆 石河子 832002;3. 哈爾濱醫科大學藥學院,黑龍江 哈爾濱 150081)

近年來,以氣管哮喘為代表的各種呼吸系統疾病,隨著全球氣候變化和環境污染的影響,發病率呈明顯上升趨勢,給人們的身體健康和生命安全帶來了重大威脅[1]。支氣管哮喘,簡稱哮喘,常表現為氣道慢性炎癥,是一種異質性疾病。這類慢性炎癥與氣道高反應性相關[2],并伴有可逆的氣流受限,會反復出現如喘息、氣短、胸悶、咳嗽等癥狀。支氣管哮喘如果沒有及時進行診治,隨著病程的延長可產生氣道不可逆性縮窄和氣道重塑[3],因此,明確其發病的機制,尋找有效的治療方法和研制出有效的藥物對哮喘的防治有著十分重要的現實意義和較高的經濟價值。

祖卡木顆粒(zukamu granules,ZKMG)中主要含有山柰、睡蓮花、破布木果、薄荷、大棗、洋甘菊、甘草、蜀葵子、大黃、罌粟殼,具有調節異常氣質,清熱,發汗,通竅等功效,可用于治療感冒咳嗽,發熱無汗,咽喉腫痛等病癥。現如今,對ZKMG的研究顯示,ZKMG具有解熱、鎮痛抗炎的作用,但是對其具體的作用機制報道較少[4]。

大量研究證明,中藥能夠改善哮喘發生的各個環節,如緩解氣道炎性反應[5]。近年來,網絡藥理學逐漸成為中藥研究領域中最常用的方法之一,這個概念最早是2007年由Andrew L Hopkins提出[6]。網絡藥理學是建立在高通量組學數據分析、計算機虛擬計算和網絡數據庫檢索的基礎上,側重于生物學,生物網絡的構建和分析,揭示藥物的有效性,毒性和代謝特征[7]。它的出現終結了“一個藥物、一個靶標、一種疾病”為主導的藥物研發模式,開啟了多靶點與多種疾病間復雜網狀關系的新型研究模式。本研究采用網絡藥理學方法系統分析ZKMG抗支氣管哮喘的作用機制,并通過體內實驗進行驗證。

1 實驗材料

1.1 實驗動物新疆醫科大學實驗動物中心提供SPF級健康BALB/c雌性小鼠60只,體質量(18～22)g,實驗動物生產許可證號:SCXK(新)2018-0001。給予實驗鼠正常光照,自由飲食飲水,適應性飼養1周后進行實驗安排,動物實驗經石河子大學醫學院第一附屬醫院實驗動物倫理委員會批準。

1.2 主要試劑卵清蛋白(ovalbumin,OVA)(北京索萊寶科技有限公司,批號912E054),地塞米松磷酸鈉注射液(天津金耀藥業有限公司,批號51705171),MDA測試盒,T-SOD測試盒,NO測試盒,GSH-Px測試盒,BCA總蛋白定量測定試劑盒,快速瑞氏-姬姆薩染色試劑盒(南京建成生物工程研究所,批號20210609、20210508、20210511、20210518、20210528、20170923),蛋白裂解液(RIPA)、苯甲基磺酰氟(PMSF)(北京索萊寶科技有限公司,貨號:R0010、P8340),特超敏ECL化學發光試劑盒(碧云天生物技術有限公司,貨號:P0018A),小鼠IL-17A、IL-23 ELISA試劑盒(杭州聯科生物技術有限公司,貨號A21710141、A22310216),IκBα抗體、NF-κB p65抗體(武漢博士德生物有限公司,貨號:BM3932、BA0610),Phospho-IκBα抗體(Cell Signaling Technology公司,批號9246S),一抗:ERK1/2 、p-ERK1/2、p38、p-p38(博士德生物工程有限公司 BM4326、BM5446、PB9290),β-actin抗體、山羊抗兔、山羊抗小鼠(北京中杉金橋生物技術有限公司,貨號:16A00205、ZB-2301、ZB-0312)。

1.3 主要儀器Thermo 3001全自動酶標儀(美國Thermo公司),超聲霧化器(NB-150U,德國歐姆龍),GT200球磨儀(上海凈信實業發展有限公司),TGL-16B離心機(上海安亭科學儀器廠制造),DYCZ-24DN電泳儀(北京六一生物科技有限公司),Axio Imager A2蔡司正置熒光顯微鏡(北京博瑞斯科技有限公司),UVP凝膠成像儀(美國UVP公司),LEGEND MICRO 21R高速冷凍離心機(賽默飛世爾科技有限公司),DB-09型石蠟包埋機(湖北德力森科技有限公司),石蠟切片機(北京盛科信德科技有限公司)。

2 實驗方法

2.1 活性化合物篩選及建立目標數據庫以口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18為條件,通過TCMSP數據庫檢索祖卡木顆粒中10種中藥的化學成分,篩選化學成分及相應的蛋白靶點,并通過參考文獻進行補充。將化學成分的SMILES號導入SwissADME數據庫中,將GI absorption-High, Druglikeness有2個Yes作為化合物篩選條件,篩選后的化合物利用TCMSP數據庫和SwisstargetPrediction數據庫進行靶標預測。在GeneCards數據庫,輸入“bronchial asthma”,得到疾病靶點,將疾病靶點和成分預測靶點通過Venny將這兩部分相交,得到關鍵靶點。

2.2 構建藥物-組分-靶點網絡圖和蛋白-蛋白交互作用網絡將通過篩選的化合物以及關鍵靶點的數據導入Cytoscape(3.8.1版本)進行數據可視化,構建了藥物-成分-靶點網絡。在STRING數據庫中導入基因靶標,Cytoscape中優化蛋白-蛋白交互作用網絡。

2.3 基因本體富集分析(GO)與京都基因和基因組百科全書通路富集分析(KEGG)利用Metascap平臺對交集靶點進行GO與KEGG富集分析,篩選條件P<0.01,利用微生信在線工具對富集結果進行可視化。

2.4 分子對接選擇PPI網絡中的核心靶點與藥物的核心成分進行分子對接,通過PubChem數據庫獲得核心成分的3D結構,保存為MOL2格式。大分子靶蛋白的PDB格式文件通過PDB數據庫下載。分子活性位點對接借助Discovery studio 4.5軟件進行。

2.5 模型的建立及給藥將60只雌性BALB/c小鼠隨機分為6組,每組10只,分為正常組(Control)、OVA組(5 mg·kg-1),祖卡木顆粒低、中、高劑量組(ZKM-L:1.6 g·kg-1,ZKM-M:4.8 g·kg-1,ZKM-H:14.4 g·kg-1)和地塞米松陽性對照組(DEX,2 mg·kg-1)。

小鼠適應性飼養1周即開始造模,在d 1和d 4時,正常組腹腔注射生理鹽水,其余5組腹腔注射OVA致敏液(0.5 g·L-1,OVA干粉100 mg,2 mg氫氧化鋁,200 mL生理鹽水)進行致敏,造模成功后,在d 21～34,進行實驗干預,每天對正常組以及OVA模型組用生理鹽水進行灌胃,ZKM(L,M,H)組的小鼠用不同濃度祖卡木顆粒進行灌胃給藥治療,DEX組進行腹腔注射地塞米松(2 mg·kg-1)進行治療。在d 27～34,對OVA組、ZKM-L、ZKM-M、ZKM-H以及DEX組用超聲霧化器對小鼠進行1% OVA(OVA 500 mg溶于50 mL生理鹽水,現用現配)霧化刺激,每天30 min,正常組的小鼠采用100 mL生理鹽水進行霧化激發。在末次OVA激發24 h后,對小鼠進行摘眼球取血,血樣置于4 ℃,5 000 r·min-1離心10 min,取上清液,-80 ℃儲存備用。取部分小鼠肺組織灌注1 mL生理鹽水,連續灌注3次,回收率約70%～80%,得肺泡灌洗液(BALF)。每組取部分小鼠左下葉肺固定于10%的福爾馬林溶液中,用于后續的病理學觀察,其余肺組織采集稱質量后置于-80 ℃保存,待進一步檢測。肺系數計算方法:肺系數=肺質量/體質量×100%。

2.6 肺泡灌洗液(BALF)細胞分類計數及染色將采集到的BALF放入EP管中,4 ℃低溫條件下3 000 r·min-1離心10 min后取下層沉淀物進行細胞分類計數和瑞氏-姬姆薩染色,在光學顯微鏡下區分不同細胞。

2.7 肺組織病理學觀察將肺組織固定在10%甲醛中24 h后,進行梯度乙醇脫水,石蠟包埋、切片,對肺組織病理切片進行蘇木精-伊紅染色和三色染色,高倍光學顯微鏡觀察各組織的病理學變化。

2.8 小鼠血清中IL-17A以及IL-23的含量取小鼠血清進行IL-17A以及IL-23的含量檢測,具體實驗操作按ELISA試劑盒說明書中的方法進行。

2.9 測定MDA、NO的含量以及T-SOD和GSH-Px的活力將小鼠肺組織,用冷0.9%生理鹽水制成10%的組織勻漿,4 ℃,3 500 r·min-1,離心10 min,取上清用于MDA、NO、T-SOD和GSH-Px含量及活性的檢測,具體操作按照試劑盒說明書進行。

2.10 Western blot用RIPA裂解緩沖液從肺組織中提取總蛋白,根據核蛋白提取試劑盒說明從肺組織中提取核蛋白。蛋白濃度按照BCA蛋白檢測試劑盒進行測定。通過凝膠電泳將等量的蛋白質樣品分離,并將其轉移到PVDF膜上。用5%封閉液封閉后,將膜與一抗進行孵育,4 ℃下過夜。用TBST洗滌4次后,與山羊抗小鼠/兔二抗室溫孵育1.5 h。然后用TBST洗滌4次,用增強化學發光試劑形成膜上的蛋白條帶。用Image-Pro Plus 6.0軟件檢測蛋白條帶的灰度值,用靶帶與β-actin的比值進行半定量分析。

3 結果

3.1 藥物活性成分、靶點的篩選利用TCMSP數據庫以及多種開源數據庫對祖卡木顆粒中10種中藥的化學成分進行檢索歸納,經過OB、DL篩選后,最終獲得194種活性成分,剔除重復靶點后,最終共獲得靶點326個。

3.2 祖卡木顆粒與支氣管哮喘靶點交集在GeneCards數據庫中檢索“Bronchial asthma”,去掉疾病靶點的重復值并進行整合,共計得到靶點1 577個。借助Venny2.1工具繪制Venn,得到交集靶點176個,結果見Fig 1A。

3.3 “藥物-成分-靶點”網絡的構建將上述交集靶點和相對應的成分信息文件導入Cytoscape,構建活性成分-靶點網絡。網絡中有邊(edge)1 722條,節點(node)378個,節點的大小,表示在網絡中的重要性。

3.4 蛋白質相互作用網絡(PPI)的分析為了探討祖卡木顆粒治療哮喘的分子機制,構建PPI網絡。該PPI網絡由176個節點和2 464個邊組成。對該網絡拓撲參數進行分析,得出靶基因的平均度值為28.5,度值越大,節點大小越大,對應的重要程度越高。

3.5 祖卡木顆粒治療支氣管哮喘核心靶點獲取將PPI網絡導入Cytoscape中,借助“CytoNCA”插件計算出節點交互關系的DC、BC、CC、LAC等值,以中位數為標準逐步篩選核心靶點。得到36個核心靶點,其中包括腫瘤壞死因子(TNF)、白蛋白(ALB)、血管內皮生長因子A(VEGFA)、腫瘤蛋白P53(TP53)、表皮生長因子受體(EGFR)等與支氣管哮喘有關的核心靶點。

3.6 GO富集分析及KEGG通路富集分析采用Metascape對核心靶點進行功能與通路的富集分析,并進行結果可視化,共富集到生物學過程883條,細胞組分40條,分子功能64條,通過P值篩選排名前20的條目繪圖。KEGG通路富集條目133條,結合靶點富集數及Count值篩選條目進行分析并作圖。氣泡大小代表基因靶點富集數,氣泡顏色由綠逐漸轉紅表明其顯著性越強。主要涉及蛋白質多糖與癌癥通路、PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路等,結果見Fig 1B,C。

3.7 分子對接結果選擇PPI網絡中排名前6的靶點以及排名前10的關鍵成分進行分子對接。根據PPI網絡分析,將槲皮素、山奈酚、木犀草素、豆甾醇、柚皮素、原阿片堿、異鼠李素、蘆薈大黃素、芹菜素以及7-甲氧素-2-甲基異黃酮作為關鍵成分,TNF、ALB、VEGFA、TP53、EGFR、SRC作為靶點,進行分子對接,選擇Discovery studio 4.5軟件評分靠前的結果進行可視化展示,具體結果見Tab 1。

3.8 祖卡木顆粒對哮喘小鼠肺系數的影響小鼠肺濕重與正常組相比較,OVA模型組(P<0.01)差異有統計學意義,與模型組相比較,ZKM-H(P<0.05)與DEX(P<0.05)差異均有統計學意義。由結果提示OVA模型組小鼠肺濕重增大,出現一定程度的水腫,通過給藥后小鼠肺濕重有所降低。其中劑量組ZKM-H效果較為明顯(P<0.05),結果如Fig 2所示。

3.9 哮喘小鼠肺泡灌洗液細胞計數及染色為了進一步研究ZKMG對OVA誘導的哮喘小鼠的作用,對小鼠肺泡灌洗液中的總細胞數和各類細胞進行計數,如Fig 3,4所示,相較于正常組,模型組的總細胞數以及各類炎癥細胞數均明顯增加。相較于模型組,3個劑量組與陽性藥組的總細胞數、單核細胞、淋巴細胞和嗜中性粒細胞的數量均明顯減少。

Fig 1 Network pharmacology

Tab 1 Molecular docking software score

Fig 2 Lung wet weight and lung coefficient in asthmatic mice n=8)

3.10 祖卡木顆粒對哮喘小鼠肺組織病理形態的影響通過HE染色與Masson染色進一步評估祖卡木顆粒的抗哮喘作用。由Fig 5結果顯示,與正常組相比,模型組的肺組織中,細胞排列紊亂,并伴隨大量炎性細胞浸潤。與模型組相比,ZKMG劑量組和陽性藥組表現出明顯的抗哮喘作用,減輕肺部炎癥現象,肺部細胞排列也趨于正常化。

Fig 3 Cell Richter-Jimsa staining in alveolar lavage fluid of each group

Fig 4 Cell counts in alveolar lavage fluid of each group n=8)

Fig 5 HE staining of lung tissues of asthmatic mice (400×)

由Fig 6結果顯示,哮喘模型組小鼠相對于空白對照組小鼠,肺組織纖維化明顯,而ZKMG干預組小鼠肺纖維化程度明顯改善。

3.11 ZKMG對哮喘小鼠肺組織中NO,T-SOD,GSH-Px以及MDA的影響為了解ZKMG對哮喘的影響是否參與氧化應激過程,本研究對小鼠肺組織中的NO、T-SOD、GSH-Px以及MDA進行含量檢測,結果如Fig 7,與正常組相比,OVA模型組肺組織中MDA和NO含量明顯增加(P<0.01),T-SOD和GSH-Px活性明顯降低(P<0.01)。與OVA組比較,ZKM劑量組和DEX組肺組織中MDA和NO的含量相對降低(P<0.05或P<0.01),T-SOD和GSH-Px的活性明顯升高(P<0.05或P<0.01)。提示,ZKMG可以增加抗氧化劑活性物質的含量,并有助于緩解OVA誘發的哮喘。

Fig 6 Masson staining of lung tissue in asthmatic mice (400×)

3.12 ZKMG對哮喘小鼠血清中IL-17A與IL-23的影響檢測血清中IL-17A與IL-23細胞因子的表達水平,以探討ZKMG對哮喘炎性介質的影響。結果Fig 8,與正常組相比,OVA誘導哮喘模型的IL-17A與IL-23細胞因子在血清中的表達明顯增加(P<0.05);與OVA模型組相比,ZKM劑量組和DEX組中IL-17A與IL-23的表達水平明顯降低(P<0.05),并且呈明顯的劑量依賴性。這表明ZKMG可以抑制OVA誘發的哮喘小鼠的血清中IL-17A與IL-23的表達。

Fig 7 MDA, NO content, T-SOD and GSH Px activity in lung tissue in serum of asthmatic mice n=8)

3.13 ZKMG對哮喘模型小鼠肺組織中NF-κBp65、IκB-α、p-IκB-α蛋白以及MAPK通路相關蛋白表達的影響網絡藥理富集分析結果表明,ZKMG治療支氣管哮喘的機制可能與TNF、VEGFA和ALB有關,它們在炎癥反應中發揮作用。與OVA組相比,ZKMG抑制了NF-κB p65蛋白的過度表達,抑制了IκBα蛋白的磷酸化。此外,在炎癥反應中,MAPK通路也扮演著重要的角色。因此,我們分析了磷酸化的ERK1/2和磷酸化的p38的水平。如Fig 9所示,OVA組明顯增加了p-ERK1/2和p-p38的表達,在ZKMG處理后,這些表達均減少。

4 討論

哮喘是世界上最常見的慢性病,哮喘的發病機制有幾種,現階段最被大家認可的哮喘發病機制是氣道免疫-炎癥機制[8-10],當外源性的刺激源通過各種途經進入到體內,被抗原遞呈細胞內吞并激活T細胞。激活的T細胞產生白介素激活B淋巴細胞,從而合成特異性IgE。刺激源如果再次進入體內,會與細胞表面的IgE結合,使細胞合成多種活性介質,導致平滑肌收縮,黏液分泌增多以及炎癥細胞浸潤,會出現反復喘息、氣短、咳嗽、咳痰、喉間哮鳴音等[11]。如果哮喘不能及時進行治療,氣道炎癥和反復發作的上皮損傷,會最終導致氣道重塑。多種炎性因子、多種炎性介質均參與了氣道重構的形成。故哮喘是由多種炎性細胞和炎性因子參與的氣道慢性炎癥性疾病。

Fig 8 IL-17A and IL-23 content in serum of

中藥是我國幾千年來的瑰寶,在疾病防治中具有多成分、多靶點、多途徑的特點。近年來,隨著系統生物學、人工智能、多向藥理學以及其他技術的快速發展,網絡藥理學也應運而生[12]。網絡藥理學可以根據中藥中的成分,運用多種數據庫,快速篩選出潛在靶點,預測作用機制,系統性地分析藥物-成分-疾病-靶點的相互作用[13]。本研究通過網絡藥理學預測了ZKMG治療支氣管哮喘的可能性,并通過體內實驗驗證了其有效性。

ZKMG在維吾爾醫藥中,是治療感冒的首選藥方,具有調節異常氣質,清熱,發汗,通竅等功效。大量臨床應用表明,ZKMG對于上呼吸道感染,具有療效好,見效快,無毒副作用,且適用于不同年齡階段感冒患者的特點。不斷有研究證明,ZKMG具有解熱、鎮痛和抗炎的作用,但是對其具體的作用機制報道較少。基于ZKMG的抗炎作用,我們希望發現其對支氣管哮喘的治療潛力,并開發其新的臨床應用價值。

通過網絡藥理學以及分子對接結果分析,我們發現TNF、ALB、VEGFA是ZKMG中活性化合物治療支氣管哮喘的關鍵靶點。腫瘤壞死因子TNF分為TNF-α和TNF-β兩類,TNF-α是介導炎癥和免疫調節反應的重要因子,TNF-β可以通過上調血管內皮細胞表面黏附分子的表達,激活巨噬細胞,從而促進炎癥反應[14]。ALB,又稱白蛋白,分布于組織和體液中,在組織損傷或炎癥發生時,ALB分解代謝會增加,其濃度會降低。血管內皮生長因子A(VEGFA)屬于VEGF家族,由多種細胞分泌,而VEGF是已知的最強血管通透劑,在支氣管炎性反應和支氣管重塑過程中起著重要的作用[15]。通過GO和KEGG富集分析,我們推測ZKMG抗支氣管哮喘的機制可能是通過NF-κB信號通路、MAPK等通路實現,因此,我們設計了相應的實驗來驗證ZKMG抗支氣管哮喘的作用。

哮喘患者由于支氣管氣道中中性粒細胞的積聚而表現出氧化應激增強,超氧化物歧化酶活性降低會造成氣道高反應以及氣流阻塞,有研究數據表明,哮喘患者呼出的NO濃度高于正常受試者。NO水平的升高和氧化應激的增強可能導致強過氧亞硝酸根的形成,從而導致支氣管氣道中的蛋白質亞硝基化,最終導致氣道炎癥[16]。在本研究中,ZKMG治療降低了OVA誘導的哮喘小鼠肺組織中NO和MDA的水平,增高T-SOD和GSH-Px的活力值,提示ZKMG可以通過降低氧化應激改善氣道高反應性。

IL-17A是由Th17細胞分泌,可作用于上皮細胞,通過激活核因子-κB (NF-κB)、MAPK等信號通路促進炎癥因子與趨化因子的表達[17]。IL-23可以促進Th17的擴增與穩定,IL23的含量可作為評價哮喘嚴重程度及氣流受限的參考標志[18]。在本研究中,經ZKMG治療后,哮喘小鼠肺泡灌洗液中的炎性細胞數量減少,血清中IL-17A與IL-23的含量降低,肺組織炎性細胞浸潤以及膠原沉積現象得到改善。Western blot結果顯示,ZKMG可以通過調控NF-κBp65/MAPK通路相關蛋白表達達到抗支氣管哮喘的目的。

5 結論

本研究利用網絡藥理學以及分子對接研究ZKMG對支氣管哮喘的物質基礎以及可能的作用機制,在體內實驗中驗證了ZKMG治療支氣管哮喘的可能性,為ZKMG新的臨床應用提供了科學依據。