甘薯高效原生質體瞬時轉化系統的建立及應用

摘要：" 原生質體瞬時轉化系統簡便高效，已被廣泛用于植物基因功能分析。然而，目前甘薯中尚未建立原生質體瞬時轉化系統。本研究以徐紫薯8號水培根系為試驗材料，通過聚乙二醇（PEG）介導，建立了一個操作簡便且高效的原生質體分離和瞬時轉化系統。結果表明，水培根系制備的原生質體產量高達每1 g 1.106×107個，質粒轉化效率高達69.46%。并利用該系統，首次成功將甘薯蔗糖轉運蛋白（IbSUT4）定位到甘薯細胞膜上。本研究結果為甘薯功能基因研究和分子育種提供了重要技術支撐。

關鍵詞：" 甘薯；原生質體；瞬時轉化；亞細胞定位

中圖分類號：" S531""" 文獻標識碼：" A""" 文章編號：" 1000-4440（2024）12-2201-06

收稿日期：2024-02-25

基金項目：國家甘薯產業技術體系項目（CARS-10-甘薯）

作者簡介：王丹丹（1994-），女，山東煙臺人，博士研究生，主要研究方向為甘薯遺傳育種。（E-mail）wdd201712@126.com

通訊作者：李" 強，（E-mail）instrong@163.com

王丹丹，李成陽，李" 強. 甘薯高效原生質體瞬時轉化系統的建立及應用［J］. 江蘇農業學報，2024，40（12）：2201-2206.

doi：10.3969/j.issn.1000-4440.2024.12.002

Establishment and application of an efficient protoplast transient transformation system in sweet potato

WANG Dandan，" LI Chengyang，" LI Qiang

（Xuzhou Institute of Agricultural Sciences in Jiangsu Xuhuai District/Key Laboratory of Biology and Genetic Breeding of Sweetpotato， Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Sweetpotato Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Xuzhou 221131， China）

Abstract：" The protoplast transient transformation system is simple and efficient， and has been widely used in plant gene function analysis. However， the protoplast transformation system has not yet been established in sweet potato. In this study， the hydroponic roots of Xuzishu 8 were used as materials to establish a simple and efficient protoplast isolation and transient transformation system mediated by polyethylene glycol （PEG）. The results showed that the yield of protoplasts prepared from hydroponic roots was as high as 1.106×107 per gram， and the plasmid transformation efficiency was as high as 69.46%. Using this system， the sweet potato sucrose transporter （IbSUT4） was successfully localized on sweet potato cell membrane for the first time. The results of this study provide important technical support for sweet potato functional gene research and molecular breeding.

Key words：" sweetpotato；protoplast；transient transformation；subcellular localization

甘薯是重要的糧食作物之一，其適應性強、高產和營養豐富，已成為未來保障糧食供應的重要作物。深入挖掘并解析甘薯產量、品質和抗性相關基因，對于培育高產、優質和高抗的甘薯品種具有重要意義。隨著基因組測序技術的快速發展，已成功測序并組裝出多個高質量的甘薯基因組序列，如Ipomoea batatas Beauregard（http：//sweetpotato.uga.edu）和徐薯18的基因組序列。這些基因組數據極大促進了甘薯進化機制的探索及重要性狀遺傳位點的鑒定。然而，由于甘薯具有六倍體和高度雜合的特點，其基因組復雜且龐大，為功能基因的研究帶來了巨大挑戰。甘薯突變體資源有限且遺傳轉化周期較長，也進一步阻礙了研究人員對其基因功能的深入研究。因此，亟需簡便且高效的工具來加速甘薯基因的挖掘與功能分析。

原生質體瞬時轉化是一種基因功能研究方法，相比于穩定的遺傳轉化系統，原生質體瞬時轉化系統可以更加高效、簡便地進行基因功能分析，可用于亞細胞定位分析、體內分子相互作用和信號轉導研究等。利用該系統，可以實現多種植物蛋白質在內源系統中的亞細胞定位分析 。然而，由于部分植物細胞壁較厚或富含多糖、多酚，原生質體的制備較為困難，只能利用異源表達系統進行亞細胞定位分析。并且，由于不同物種之間進化距離差異較大，蛋白質的錯誤靶向可能會導致目標蛋白質在異源系統中喪失活性。因此，針對具體物種建立適用的原生質體瞬時轉化體系至關重要。

1979年，吳耀武等報道了甘薯愈傷組織原生質體的分離和培養；隨后，學者又從甘薯莖、葉柄和葉肉細胞中陸續分離出原生質體。然而，由于甘薯富含多糖、多酚，原生質體的制備較為復雜，至今尚未建立完整的同源瞬時轉化體系。本研究擬以徐紫薯8號水培根系為試驗材料，初步建立甘薯水培根系高效原生質體制備及瞬時轉化體系，以期為甘薯蛋白質亞細胞定位分析和甘薯基因功能研究和性狀改良提供高效、簡便的工具。

1" 材料與方法

1.1" 材料

試驗選用甘薯品種徐紫薯8號。將徐紫薯8號莖段置于溫室中水培3～5 d，待根系長至2～3 cm時，取水培根系按照Liu等的方法培養徐紫薯8號的愈傷組織，待愈傷組織直徑達到3～5 mm時用于制備原生質體。

1.2" 試劑

纖維素酶（型號Cellulase R-10）和離析酶（型號Macerozyme R-10）來自日本Yakult Honsha 公司。其他用于原生質體制備及轉化的試劑均購自Sigma公司。

1.3" 原生質體分離

原生質體分離參照Nishimaki等和Yoo等的方法并稍作修改。具體操作步驟如下：使用鋒利的刀片將根和愈傷組織（1.0±0.1） g切成2 mm的碎塊，將切好的碎塊立即轉移至裝有7.5 mL新鮮酶解液的培養皿中，酶解前，將含有愈傷組織的酶解液在真空泵中抽真空處理30 min，含有根系的酶解液無需進行抽真空處理，將含有酶解液的根和愈傷組織置于28 ℃培養箱中避光酶解4.5 h，其間每隔1 h輕晃培養皿，用適量的W5溶液沖洗孔徑40 μm細胞過濾器和50 mL錐形離心管，酶解結束后，利用孔徑40 μm細胞過濾器對酶解混合物進行過濾，并用等體積的W5溶液沖洗培養皿和過濾器，隨后將濾液以100 g離心 3 min，同時通過緩慢加速和緩慢減速保護原生質體的完整性。離心結束后，小心去除上清液，加入5 mL W5溶液重懸原生質體，并將懸浮液在室溫下以100 g離心2 min，離心后小心去除上清液，加入1 mL W5溶液重懸原生質體，取100 μL懸浮液在顯微鏡下計算原生質體產量并評估其活性，將剩余的懸浮液置于冰上30 min，30 min后小心去除上清液，利用單分枝酰基甘油（MMg）溶液將原生質體含量調節至每1 mL 1×105～2×105個。所用溶液的配方如表1所示。

1.4" 聚乙二醇介導質粒瞬時轉化

聚乙二醇（PEG）介導的瞬時轉化系統所用35S：GFP和35S：IbSUT4-GFP載體均為本實驗室所有。SCAMP1-mCherry和D53-mCherry載體由南京農業大學萬建民教授實驗室贈與。其中，IbSUT4為甘薯蔗糖轉運蛋白基因，GFP為綠色熒光蛋白基因，mCherry為紅色熒光蛋白基因，35S為GFP啟動子。

原生質體瞬時轉化體系建立方法參考Yoo等的方法并略微修改。具體操作如下：將10 μL質粒（10～20 μg）與100 μL原生質體置于預涂有0.1% BSA的2 mL離心管中，輕輕混合，隨后加入110 μL新鮮制備的40% PEG溶液并充分混合。室溫靜置8 min后，緩慢加入440 μL W5溶液以終止反應，將混合溶液在室溫下100 g離心1 min，棄上清液，用W5溶液重懸原生質體后，再次離心，去除上清液，加入1 mL WI溶液重懸原生質體，將轉化后的原生質體懸浮液放置于12孔細胞培養板中，25～28 ℃黑暗條件下孵育16 h。所用溶液的配方如表1所示。

1.5" 顯微鏡觀察和數據統計

使用血球計數板計算原生質體的產量。使用熒光素二乙酸酯（FDA）將原生質體染色，并在顯微鏡下檢查原生質體活性。在轉化過程中，將攜帶綠色熒光蛋白（GFP）基因的質粒導入原生質體，如果轉化成功，原生質體會表達GFP蛋白并發出綠色熒光，因此可以通過統計表達綠色熒光蛋白（GFP）原生質體的數量計算轉化效率。使用Lecia顯微鏡（型號DM40008，德國Leica公司產品）分析蛋白質亞細胞定位，綠色熒光蛋白（GFP）和紅色熒光蛋白（mCherry）的激發和發射波長分別為470/510 nm和538/584 nm。使用Image J軟件測量原生質體的直徑。使用DPS軟件進行統計分析，采用單因素方差分析（ANOVA）和最小顯著性差分法（LSD）比較處理間差異。每個試驗重復3次。試驗流程如圖1所示。

2" 結果與分析

2.1" 甘薯不同組織制備得到的原生質體

以愈傷組織和水培根系為材料制備原生質體，比較獲得的原生質體的數量和質量，從而選擇合適的試驗材料（圖2A）。結果表明，水培根系制備的原生質體數量顯著高于愈傷組織（P＜0.05）（圖2B）。經FDA染色后，2種組織制備的原生質體均有綠色熒光信號，表明分離得到的原生質體完整且有活力（圖2C）。進一步分析發現，根系原生質體的直徑顯著大于愈傷組織原生質體（P＜0.05）（圖2D），更利于觀察。

2.2" 甘薯根系原生質體的蛋白質亞細胞定位

孵育時間從4 min增加到16 min，原生質體質粒轉化效率從54.33%提高到72.53%，其中孵育8 min與孵育12 min的原生質體質粒轉化效率無顯著差異（圖3A）。孵育12 min時的完整原生質體的數量顯著低于孵育8 min時的完整原生質體的數量（P＜0.05），因此最佳孵育時間確定為8 min（圖3B）。隨后，利用該系統進一步對蛋白質進行亞細胞定位，以驗證該體系的準確性。結果表明，分泌載體膜蛋白1（SCAMP1） 和核蛋白（D53）均可被準確定位（圖3C～圖3E），表明該系統適用于蛋白質亞細胞定位分析。將35S：IbSUT4-GFP質粒轉入甘薯水培根系原生質體中，在熒光顯微鏡下觀察IbSUT4亞細胞定位。結果表明，原生質體膜上存在GFP蛋白，且GFP蛋白與SCAMP1共定位，表明IbSUT4定位在細胞膜上（圖3F）。

3" 討論

無細胞壁的原生質體是研究基因功能、蛋白質亞細胞定位、信號轉導、細胞融合和培育新品種的理想試驗材料。在擬南芥和水稻等植物中，已經建立了高效的原生質體分離、瞬時轉化系統，在甘薯中，仍亟需一種簡便且高效的原生質體分離、瞬時轉化系統。

多種因素會影響甘薯原生質體的釋放，包括試驗材料的生長狀態、多糖含量、多酚含量以及器官的選擇等。因此，選擇合適的試驗材料是成功分離甘薯原生質體的關鍵。Sihachakr等將甘薯莖和葉柄酶解過夜，得到原生質體。本研究發現，以水培根系和愈傷組織為試驗材料，僅需酶解4.5 h即可獲得原生質體，大大縮短了制備時間。Dhir等使用1%纖維素酶、2%離析酶和0.3%果膠解酶配置酶解液，酶解葉柄后，原生質體產量為每1 g 3.0～5.0×106個。本研究中，僅使用1.5%纖維素酶和0.4%離析酶，原生質體產量達到每1 g 1.106×107個，顯著降低了酶的用量。此外，本研究發現，與愈傷組織相比，利用水培根系制備原生質體產量更高，且所需時間更短。愈傷組織培養耗時且需無菌環境，不適合大規模分離原生質體，而水培根系培養周期短、產量高，是更優質的試驗材料。

前人多采用煙草原生質體進行甘薯蛋白質亞細胞定位分析。然而，與同源原生質體相比，異源原生質體會導致蛋白質定位的偏差。本研究中，利用GFP質粒評估質粒轉化效率，最高達69.46%，明顯高于其他作物，表明基于甘薯水培根系原生質體的瞬時轉化系統能夠高效地將外源DNA引入甘薯細胞。核蛋白和膜蛋白標記物在甘薯原生質體中的正確定位進一步驗證了該體系的準確性，定位結果表明，甘薯蔗糖轉運蛋白IbSUT4定位于細胞膜。此外，本研究提出的甘薯根系原生質體分離及瞬時轉化系統還可用于研究蛋白質與蛋白質、蛋白質與DNA的相互作用，驗證啟動子功能，以及探索信號轉導等分子機制。

綜上所述，本研究成功建立了甘薯水培根系原生質體分離與瞬時轉化體系，可高效、準確地分析甘薯蛋白質在同源系統中的亞細胞定位，這一體系將為甘薯功能基因研究和分子育種提供重要技術支撐。

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（責任編輯：成紓寒）