生物質灰加生物菌劑對煙草根際土壤微生物群落的影響以及對青枯病的防治效果

摘要：" 為了探究生物質灰和不同生物菌劑配施對煙草根際土壤微生物群落的影響，以及對煙草青枯病的防控作用，本研究先采用高通量測序方法研究了生物質灰配施生物菌劑對土壤微生物群落多樣性和微生物群落結構組成的影響。α多樣性指數分析結果發現，生物質灰配施生物菌劑有利于提高煙草根際土壤微生物菌群豐度和菌群變化程度，生物質灰配施熒光假單胞菌菌劑的土壤Shannon指數和Simpson指數最高，配施光合細菌菌劑的煙草根際土壤Ace和Chao1值最高。通過主成分分析發現，生物質灰配施不同生物菌劑對根際土壤微生物的影響是類似的。另外，生物質灰配施生物菌劑可明顯提高土壤中酸桿菌或放線菌相對豐度，其中生物質灰配施熒光假單胞菌菌劑和光合細菌菌劑土壤放線菌相對豐度更高。利用土壤微生物分離法研究生物質灰配施生物菌劑對微生物群落數量的影響，結果發現與CK相比生物質灰配施生物菌劑可以促進土壤微生物的生長繁殖，顯著提高微生物群落數量，生物質灰配施光合細菌菌劑對微生物的生長繁殖促進作用最為顯著。生物質灰配施生物菌劑后煙草青枯病病情指數明顯低于CK，特別是生物質灰配施光合細菌菌劑的病情指數最低，防治效果最好。

關鍵詞：" 生物質灰；生物菌劑；煙草；根際微生物；煙草青枯病

中圖分類號：" S435.72""" 文獻標識碼：" A""" 文章編號：" 1000-4440（2024）12-2237-07

收稿日期：2024-03-25

基金項目：安徽皖南煙葉有限責任公司重點科技項目（20210563002）

作者簡介：李世金（1985-），男，安徽宣城人，本科，農藝師，主要從事煙葉生產研究。（E-mail）969156275@qq.com

通訊作者：朱啟法， （E-mail）zhuqifa2023@163.com

李世金，林" 碩，馬稱心，等. 生物質灰加生物菌劑對煙草根際土壤微生物群落的影響以及對青枯病的防治效果［J］. 江蘇農業學報，2024，40（12）：2237-2243.

doi：10.3969/j.issn.1000-4440.2024.12.006

Effects of combined application of biomass ash and bio-bacterial agents on the microbial community in tobacco rhizosphere soil and the control effect on bacterial wilt

LI Shijin，" LIN Shuo，" MA Chenxin，" CHENG Tingming，" ZHU Qifa

（Anhui Wannan Tobacco Co.， Ltd.， Xuancheng 242000， China）

Abstract：" In order to explore the effects of biomass ash and different bio-bacterial agents on the microbial community in tobacco rhizosphere soil and the prevention and control of tobacco bacterial wilt， this study first used high-throughput sequencing methods to explore the effects of biomass ash combined with bio-bacterial agents on soil microbial community diversity and microbial community structure. The results of α diversity index analysis showed that the application of biomass ash combined with bio-bacterial agents was beneficial to improve the abundance and change degree of microbial flora in tobacco rhizosphere soil. The Shannon index and Simpson index of soil treated with biomass ash combined with Pseudomonas fluorescens agent were the highest， and the Ace and Chao1 values of tobacco rhizosphere soil treated with biomass ash combined with the photosynthetic bacteria agent were the highest. Through principal component analysis， it was found that the effects of biomass ash combined with different bio-bacterial agents on rhizosphere soil microorganisms were similar. In addition， the relative abundance of Acidobacteria or Actinomycetes in soil could be significantly increased by the application of biomass ash combined with bio-bacterial agents. The relative abundance of soil actinomycetes was higher under the treatments of biomass ash combined with Pseudomonas fluorescens agent and photosynthetic bacteria agent. The effect of biomass ash combined with bio-bacterial agents on the number of microbial communities was studied by soil microbial separation method. The results revealed that compared with CK， biomass ash combined with bio-bacterial agents could promote the growth and reproduction of soil microorganisms and significantly increase the number of microbial communities. The biomass ash combined with the photosynthetic bacteria agent had the most significant effect on the growth and reproduction of microorganisms. The disease index of tobacco bacterial wilt after biomass ash combined with bio-bacterial agents treatment was significantly lower than that of CK. In particular， the disease index of tobacco bacterial wilt treated with biomass ash combined with the photosynthetic bacteria agent was the lowest and the control effect was the best.

Key words：" biomass ash;bio-bacterial agents;tobacco;rhizosphere microorganism;tobacco bacterial wilt

煙草種植區土壤連續多年施用大量化肥，易引起土壤質地變化，土壤酸化板結，有毒物質不斷增加，嚴重影響優質烤煙的生產。土壤酸化會降低煙草種植區土壤肥力，影響植株吸收養分，抑制土壤微生物活動和各種土壤酶的活性，還會引起多種土傳性病害，如青枯病等。研究結果表明，將氰氨化鈣施入煙草種植區的土壤中，煙草青枯病和黑脛病的發病率有所下降。生物炭施入煙草種植區土壤能夠改善酸性土壤的物理化學特性，適當提高土壤pH值，促進煙株根系吸取更多的營養物質，還能夠將青枯病病菌吸附在土壤顆粒上，阻礙病菌的移動，抑制病菌的繁殖，降低青枯病的發病率。

生物菌劑含有大量的有益微生物，一些生物菌劑還能夠提高土壤的養分供應能力和透氣性，增強土壤修復能力。人工發酵生產的生物菌劑能夠增加土壤微生物種群多樣性，這些有益微生物可與根際微生物協調共生，保持土壤生態群落穩定，平衡土壤微生物種群。另外，生物菌劑能夠分解土壤中的有害物質以及胞外分泌抗生素，能夠抑制土壤中病原微生物的種群數量，提高農作物對病原菌的抗性，降低土傳性病害的發病率 。隨著種植煙草年數的增加，中國皖南煙區煙草青枯病逐年加重，成為制約該地區煙葉產量和品質的瓶頸。研究發現，協同施用腐殖酸、菜籽餅和生物菌劑可以顯著增加根際土壤微生物代謝活性，且對青枯病和黑脛病具有良好防治效果。聯合施用生物菌劑和黃腐酸能夠大幅度增加煙草根際土壤細菌種群的多樣性，提高對青枯病的防治效果。將土壤調理劑施入煙草田能夠改良土壤微生態環境，增加土壤中微生物種群多樣性，減輕青枯病等煙草土傳病害的發病率。目前，常見單獨使用生物質灰或生物菌劑防控煙草青枯病的研究，但二者配施防控煙草青枯病尚未見報道。本研究將生物質灰和生物菌劑聯合施用防治煙草青枯病，擬探明生物質灰與生物菌劑配施對煙草青枯病的防治效果，以及對煙草田土壤根際微生物種群的影響。

1" 材料與方法

1.1" 試驗田

試驗田地位于安徽省宣城市宣州區文昌鎮福川村，土壤類型為沙壤土，前茬作物是水稻，地塊形狀規整，土壤肥力均一，排灌方便。

1.2" 試驗材料

供試煙草品種為云煙97，由安徽皖南煙葉有限責任公司提供；生物質灰由阜陽國禎燃氣有限公司提供，生物質灰理化性質：pH 值11.16，Fe2O3含量1.06%，CaO含量11.54%，MgO含量2.60%，SiO2含量4.00%，K2O含量2.49%，P2O5含量3.26%；菌劑1為綠康威微生物菌劑，購自中農綠康（北京）生物技術有限公司；菌劑2為熒光假單胞菌菌劑，由西南大學丁偉老師惠贈；菌劑3為光合細菌菌劑，購自長沙艾格里生物肥料技術開發有限公司；菌劑4為芽孢桿菌菌劑，購自浙江省桐廬匯豐生物科技有限公司。

1.3" 試驗設計

煙草移栽期為2022年3月中旬，起壟前常規施基肥，移栽前穴施生物質灰和生物菌劑。試驗共設7個處理，每個處理100株煙草（表1）。整地劃分小區，將有機肥與氮磷鉀比例為6∶10∶19的煙草復合肥混勻作為基肥，施肥量為1 875 kg/hm2，肥料條施后起壟。移栽前將生物質灰和生物菌劑穴施于井窖內，生物質灰每穴20 g，生物菌劑按推薦劑量穴施，菌劑1稀釋60倍，每株灌120 mL；菌劑2每穴1 g；菌劑3稀釋60倍，每株灌120 mL；菌劑4稀釋300倍，每株灌120 mL。分別于煙草旺長期（2022年5月24日）和成熟期（2022年7月4日）兩次采集土壤樣品。

1.4" 土壤DNA提取、宏基因組測序與分析

于煙草旺長期和成熟期分別從每個處理的100株煙草中隨機選3株，采用“抖根法”抖落大塊不含植株根系的土壤，用刷子刷去根系表面黏附的土壤，收集后充分混勻，取100 g作為第一次根際土壤混合樣品。4次重復一共制備4個混合樣本，再次充分混勻作為二次根際土壤混合樣品。每個處理土壤樣品稱取20 g送至北京百邁客生物科技有限公司開展宏基因組測序。統計分析樣本間微生物的豐度與α、β多樣性，明確樣本間種群結構的差異。

1.5" 高通量測序數據統計與分析

采用Microsoft Excel預處理原始數據，應用Origin 18軟件作圖，應用SPSS 26.0軟件進行方差分析（P＜0.05），通過百邁客云平臺（https：//www.biocloud.net/）分析生物質灰配施生物菌劑對煙草根際微生物群落結構和多樣性的影響。

1.6" 土壤微生物的分離與培養

將10 g根際土壤放入培養皿，加入90 mL無菌水，200 r/min振搖30 min，再將梯度稀釋1×10-1～1×10-6的懸浮液分別涂布于瓊脂平板上，恒溫28 ℃培養，分別于24 h、72 h和7 d后統計細菌、真菌和放線菌的活菌數量。

1.7" 病情及防治效果調查與統計

1.7.1" 病情調查" 2022年6月25日和7月15日分別調查一次青枯病防治效果。調查時記錄各處理的病株數和每株的病情等級，計算和統計各處理的病情指數。

1.7.2" 病情分級標準" 旺長期和成熟期煙草青枯病的調查參照《煙草病蟲害分級及調查方法》。

1.7.3" 防治效果計算方法" 根據病情分級標準計算煙草青枯病病情指數及各處理對青枯病的防治效果，具體公式為：病情指數=∑（各級病株數×對應病級數）/（調查總株數×最高病級數）×100，防治效果=（T1處理病情指數-其他處理病情指數）/ T1處理病情指數×100%。

2" 結果與分析

2.1" 生物質灰配施生物菌劑對煙草根際土壤微生物群落多樣性的影響

采用α多樣性指數比較分析微生物種群的多樣性，Ace和Chao1表示菌群豐度，數值越小表明豐度越低。由表2可以看出，在煙草旺長期和成熟期T1～T6處理Ace、Chao1值均顯著高于CK。T2處理的Ace、Chao1值顯著高于T1處理。旺長期T4、T5處理Ace值顯著高于T2處理，T3、T4、T5處理Chao1值顯著高于T2處理；成熟期T3～T6處理Ace值均顯著高于T2處理，T3、T4、T5處理Chao1值顯著高于T2處理。煙草旺長期和成熟期T5處理的Ace、Chao1值均最高，說明生物質灰配施生物菌劑3更有利于提高微生物的菌群豐富度和多樣性。

物種的變化程度采用Shannon指數和Simpson指數表示，調查發現，煙草旺長期除了T4處理Shannon指數顯著高于CK外，其余處理與CK差異均不顯著；煙草成熟期T1～T6處理Shannon指數與CK差異均不顯著。煙草旺長期T1～T6處理Simpson指數均顯著高于CK；成熟期T1～T6處理Shannon指數與CK差異均不顯著。本試驗將生物質灰分別配施了4種菌劑，其中T4處理土壤菌群變化程度高，T5處理土壤菌群豐度高，說明在施用生物質灰的前提下，配施熒光假單胞菌菌劑和光合細菌菌劑有利于提高煙草根際土壤微生物的菌群豐度和菌群變化程度。

為了明確生物質灰配施生物菌劑對煙草根際微生物的影響，應用主成分分析法對各個試驗處理與根際土壤微生物群落關系進行分析，結果（圖1）發現各處理前2個主成分方差累積貢獻率為93.81%，第一主成分和第二主成分（PC1和PC2）分別解釋變量方差的90.10%和3.71%。不同處理分布于不同位置，與CK相比，煙草旺長期和成熟期T1～T6處理的根際土壤細菌群落發生明顯變化。旺長期T1、T2 2個處理和成熟期T1、T2 2個處理分布比較緊密，說明施肥或在施肥的同時配施生物質灰對根際土壤微生物種群有類似的影響。T3～T6配施了不同類型的生物菌劑，旺長期T3～T6 4個處理和成熟期T3～T6 4個處理分布相對集中，說明無論在旺長期還是成熟期，生物質灰與不同生物菌劑配施對煙草根際土壤微生物種群的影響差異不大。

2.2" 生物質灰配施生物菌劑對煙草根際土壤微生物群落結構組成的影響

由圖2可見，CK處理的土壤中變形菌門菌最多，酸桿菌、綠彎菌門菌等占比相對較大。與對照CK相比，T1處理土壤中酸桿菌相對豐度略有升高；T2處理土壤中酸桿菌和放線菌相對豐度略有升高。T3～T6處理根際土壤中酸桿菌和放線菌相對豐度均明顯升高，放線菌占比7.2%～10.1%和8.3%～11.4%，酸桿菌占比20.0%～21.5%。其中T4、T5處理放線菌相對豐度高，說明在施用生物質灰的前提下，配施光合細菌或熒光假單胞菌菌劑均能增加煙草根際土壤放線菌的豐度。

2.3" 生物質灰配施生物菌劑對煙草根際土壤微生物種群數量的影響

如表3所示，煙草旺長期和成熟期CK的3種微生物豐度均顯著低于T1～T6處理，總微生物量只有6.710×105CFU/mL和1.440×106CFU/mL。T1處理的總微生物量分別為1.441×106CFU/mL和2.512×106CFU/mL，T2處理的總微生物量分別為1.575×106CFU/mL和4.378×106CFU/mL，說明生物質灰能夠改善土壤條件，有利于土壤微生物的繁殖。T3～T6處理總微生物量顯著提高，特別是T5處理的總微生物量最高，分別達到3.977×106CFU/mL和1.295×107CFU/mL，說明生物質灰配施生物菌劑對微生物的生長繁殖具有顯著促進作用，其中生物質灰配施光合細菌菌劑處理后土壤總微生物量最高，說明在施用生物質灰的前提下，配施光合細菌菌劑對土壤微生物的生長繁殖促進作用最顯著。

2.4 "生物質灰配施生物菌劑對煙草青枯病病情和防治效果的影響

由表4可知，2次青枯病病情調查結果顯示，T1施肥處理病情指數最高，分別為37.72和54.17。T2處理的病指降低，分別為28.46和44.10，防治效果分別為24.55%和18.59%，說明生物質灰可以改善土壤條件，對青枯雷爾氏桿菌具有一定的抑制作用。而相對于T2處理，T3～T6處理病情指數均再次下降，防治效果顯著提高，2次調查分別達到44.14%～68.61%和33.62%～57.23%。特別是T5處理病情指數最低，分別為11.48和23.17，防治效果最高，分別為68.61%和57.23%。結果表明，單獨使用生物質灰對青枯病的防治效果有限，而生物質灰與生物菌劑聯合使用能顯著提高防治效果。本試驗施用了4種生物菌劑，結果發現T5處理對青枯病的防治效果最好，說明生物質灰配施光合細菌菌劑的防治效果最為優異。

3" 討論

本研究使用的生物質灰是生物質電廠利用秸稈生物質燃燒發電產生的灰渣，生物質灰在改善土壤理化性質、增加煙草根際微生物種群以及提高玉米和大豆的產量等方面效果突出。由于生物質灰含有硅、鉀、鈣、鎂和少量生物質炭，具有一定的調節土壤pH值作用，能夠改良土壤理化特性。已有研究結果表明，適量使用生物質灰能夠促進作物生長，抑制土傳病害的發生。本試驗詳細分析了各處理的根際微生物區系，發現單獨使用生物質灰對根際微生物的種群數量和群落結構影響較小，而生物質灰配施生物菌劑能夠大幅度提高煙草根際土壤微生物群落多樣性，顯著促進微生物的生長繁殖。配施生物菌劑還有利于增加煙草根際土壤微生物種群數量，提高土壤中酸桿菌和放線菌相對豐度。研究發現，放線菌的分泌物表現出抗菌活性，酸桿菌的某些種類能編碼多種纖維素酶并有效降解植物殘體，因此有理由推測配施生物菌劑的土壤中抗菌物質豐度更高。目前已有報道，在微生物多樣性較好的土壤中青枯病大流行的可能性顯著降低。生物質灰類似于活性炭，具有很多細小的孔隙，能夠吸附微生物，為微生物的生長繁殖提供空間，但生物質灰的有機營養元素含量較少，對微生物的種群數量影響有限。而配施生物菌劑可起到協同促進作用，生物質灰含有大量化學元素氮、磷、鉀等，施到土壤中相當于增施一定量的無機復合肥，對植物生長具有一定促進作用，反過來又可以刺激植物根系分泌更多的有機物質，利于土壤微生物生長繁殖。這表明生物質灰聯合生物菌劑施用能夠進一步改良土壤微生態環境，優化土壤微生物種群結構。

單獨利用生物菌劑防治煙草青枯病等土傳病害的研究較多，但往往效果不太理想，雖然施用了大量生物菌劑，但多數生防菌很難定殖存活，施用后土壤微生物菌群數量變化不顯著。本課題組于2021年試驗過這4種菌劑單獨使用防治煙草青枯病的效果，防治效果為20%～30%，意味著生物菌劑單獨施用無法取得理想防治效果。因此，本研究嘗試使用生物質灰配施生物菌劑防治煙草青枯病，結果發現生物質灰分別配施4種生物菌劑后防治效果明顯超過單施生物質灰?？赡苁巧镔|灰改變了土壤生態環境，為微生物提供更好的生存條件，生物菌劑存活力和定殖能力增強，因此防治效果顯著提高。另外，生物質灰配施生物菌劑能夠將青枯病的發病時間推后10 d以上，中部煙葉烘烤完畢前發病較輕，煙農可以多烘烤1～2炕煙葉。即使后期青枯病病情加重，對煙農的收入影響也已經降低到可以接受的程度，說明生物質灰配施生物菌劑能夠提升煙農種植煙草的經濟效益。

4" 結論

本研究結果表明，煙草移栽時應用生物質灰配施生物菌劑，可以促進煙草種植區土壤微生物的生長繁殖，提高微生物群落數量和多樣性，特別是生物質灰配施熒光假單胞菌菌劑或光合細菌菌劑對土壤微生物的生長繁殖促進作用更顯著，土壤菌群豐度和變化程度高，可顯著提高土壤中酸桿菌或放線菌相對豐度，而且生物質灰配施生物菌劑可以顯著減輕煙草青枯病，特別是生物質灰配施光合細菌對煙草青枯病的防治效果好。

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（責任編輯：黃克玲）