番茄GEF基因家族鑒定及青枯菌脅迫響應分析

摘要：鳥嘌呤核苷酸交換因子（guanine nucleotide exchange factor，GEF）廣泛存在于植物細胞中，它通過調控小G蛋白的活性來參與植物生長發育和脅迫響應等多種胞內信號傳導過程。目前GEF已經在擬南芥、水稻等物種中被發現，但番茄中GEF家族基因的研究尚未報道。本研究從番茄基因組數據庫中共篩選鑒定出了13個植物特有的GEF基因家族成員，并將其分別命名為SlRopGEF1～SlRopGEF13。利用生物信息學手段對其理化性質、進化關系、基因結構、染色體分布、共線性等進行分析，并基于番茄功能基因組數據庫中的轉錄組數據對其組織特異性表達和青枯菌脅迫下的誘導表達模式進行分析。結果表明，13個番茄GEF基因分別定位在9條染色體，各染色體上平均分布1～3個基因；氨基酸序列比對和結構域分析結果顯示，SlRopGEF都具有由多個保守基序組成的典型PRONE （plant-specific ROP nucleotide exchanger）結構域；亞細胞定位預測結果顯示所有的SlRopGEF都定位于細胞核，SlRopGEF2和SlRopGEF11還部分分別定位于細胞膜和葉綠體中；根據物種間進化關系分析將GEF家族成員分為3個亞族；番茄物種內共線性分析檢測到6對共線性關系；物種間共線性分析結果顯示多個番茄SlRopGEF與擬南芥和水稻中GEF家族同源基因存在共線性關系；除SlRopGEF1和SlRopGEF7在根部組織中表達水平較高，其余SlRopGEF更傾向于在花和果實組織中積累；青枯菌侵染處理下，番茄抗病和感病品種中一些SlRopGEF的表達水平顯著性變化，表明部分GEF家族蛋白在調控番茄抗青枯病過程中發揮著一定的作用。本研究結果為接下來探究番茄GEF家族蛋白的免疫功能并解析其通過調控小G蛋白活性以參與番茄抗青枯病提供了基礎科學依據。

關鍵詞：番茄；GEF基因家族；生物信息學；基因表達；青枯菌

中圖分類號：S436.412.1+5" 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）24-0034-10

收稿日期：2023-12-26

基金項目：中國博士后科學基金（編號：2023M733004）；江蘇省科協青年科技人才托舉工程（編號：JSTJ-2023-007）。

作者簡介：駱少丹（1996—），女，貴州安順人，碩士研究生，主要從事番茄青枯病抗性相關基因挖掘與功能分析方面的研究。E-mail：211211801105@stu.just.edu.cn。

通信作者：王 瓊，博士，講師，主要從事植物病理學、植物免疫學方面的教學與研究。E-mail：wangqiong@yzu.edu.cn。

番茄（Solanum lycopersicum）是世界范圍內一種重要且備受喜愛的蔬菜和經濟作物，也是研究果實發育與成熟的理想模式植物。成熟的番茄果實富含維生素C、番茄紅素、有機酸等營養物質^［1］。在我國，番茄栽培面積和產量逐年增加，是種植面積最廣、經濟價值最高的蔬菜作物之一^［2］。但番茄在生長發育過程中經常受到真菌、病毒、細菌等生物脅迫，嚴重危害其產量與品質，造成巨大的經濟損失。

青枯病是由茄科勞爾氏菌（Ralstonia solanacearum）在茄科作物上引起的一種土傳性細菌病害，在我國番茄主產區發病日趨嚴重。青枯菌在入侵植物根部或莖基部的導管系統后，可堵塞或破壞寄主維管束輸導組織，導致植株失水枯萎但仍保持青綠^［3］。在防治番茄青枯病的眾多措施中，培育并種植抗病品種是最為綠色環保且高效的途徑之一，而發掘抗病相關基因則可為育種工作提供新的遺傳資源和理論指導。

鳥嘌呤核苷酸交換因子（guanine nucleotide exchange factor，GEF）是小G蛋白從GDP結合的非活性形式轉換為GTP結合的活性形式關鍵調控因子^［4-5］。GEF蛋白可刺激GDP從小G蛋白上釋放，使細胞內高濃度水平的GTP自發地結合到無核苷酸結合形式的小G蛋白上，從而將小G蛋白激活^［6-7］。PRONE （plant-specific ROP nucleotide exchanger）類型的 GEF是植物所特有的一類GEF蛋白，最初是通過酵母雙雜交技術在擬南芥中發現的，并被命名為RopGEF^［8］。RopGEF具有一個可變的N端和C端以及中央保守的PRONE結構域。PRONE結構域具有催化功能并且直接與下游小G蛋白結合，而C端可變區則具有抑制GEF活性的作用^［9-10］。

GEF在植物生長發育和抗逆過程中都發揮著重要作用。擬南芥GEF家族蛋白AtRopGEF1和AtRopGEF4與AtROP11互作并特異性地調控脫落酸（ABA）介導的氣孔關閉過程^［11］。AtRopGEF7激活AtRAC1，并通過調控關鍵轉錄因子表達水平從而維持根部干細胞生態位^［12］。OsRopGEF7B調節水稻花器官的發育，影響水稻結實率^［13］。藍莓基因組共編碼32個GEF蛋白，其中VcGEF3參與根毛和表皮毛發育調控^［14］。進一步研究發現，一些GEF蛋白的活性還受其上游類受體激酶（receptor-like kinase，RLK）的調控，比如擬南芥花粉特異性類受體激酶AtPRK2和AtPRK6直接磷酸化RopGEF的C端，從而逐級激活RopGEFs-ROPs介導的花粉管極性生長途徑^［15-16］。類似地，長春花類受體激酶家族蛋白FERONIA與RopGEF互作并將其激活，進而參與ROS介導的根毛發育、花粉管信號感知以及白粉病感染等多種胞內活動^［17-19］。此外，水稻類受體激酶OsCERK1被幾丁質信號激活后可磷酸化OsRacGEF1的C末端第549位絲氨酸，從而將OsRacGEF1激活。被激活的OsRacGEF1可通過與小G蛋白OsRac1互作將其激活，隨后誘導一系列免疫反應以防御稻瘟病菌的入侵^［20］。越來越多的證據表明RLK-GEF-Rop/Rac是調控植物生長、發育以及脅迫響應的關鍵信號通路，且在不同物種中具有一定的保守性。近期筆者所在課題組對番茄ROP家族9個小G蛋白（SlRop1-9）的亞細胞定位、免疫功能以及是否參與調控抗青枯病進行了系統性分析，發現在本氏煙草中瞬時過表達激活狀態的SlRop3和SlRop4可抑制青枯菌的增殖^［21］。鑒于SlRop3和SlRop4極有可能具有正調控番茄青枯病抗性的能力，而GEF蛋白是細胞內小G蛋白的激活者，那么番茄中必然存在可以調節SlRop3和SlRop4活性狀態的GEF蛋白。但是，至今尚未見任何有關于番茄中GEF蛋白的系統性分析以及其參與調控青枯病抗性功能的報道。

本研究采用生物信息學技術對番茄GEF家族進行了全基因組鑒定，對鑒定到的13個GEF基因折理化性質、基因結構、共線性關系和進化關系等進行了分析，并利用番茄轉錄組數據對其組織特異性表達和青枯菌侵染脅迫下的表達模式進行了初步分析，為進一步探究番茄GEF家族蛋白的抗青枯病功能以及揭示GEF-ROP模塊調控番茄青枯病抗性的分子機制奠定了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗時間和地點

試驗于2023年3—8月在揚州大學植物保護學院植物病理系實驗室完成。

1.2 試驗材料

本研究選用番茄Ailsa Craig品種作為試驗材料，培養于28 ℃、75%濕度、12 h光周期的人工氣候室10 d，然后收集番茄幼苗的新鮮根、莖、葉，液氮速凍并保存于-80 ℃。

1.3 番茄GEF基因家族的檢索和理化性質預測

將水稻OsRacGEF1（Os09g0544800）編碼的氨基酸序列導入番茄基因組數據庫（https：//solgenomics.net/）進行BLAST搜索，下載番茄GEF基因組序列、編碼序列（coding sequence，CDS）和蛋白序列。在擬南芥基因組網站TAIR（https：//www.arabidopsis.org/）和水稻基因組數據庫RAP-DB（https：//rapdb.dna.affrc.go.jp/）中分別下載擬南芥和水稻的GEF基因家族蛋白序列。

使用Expasy網站在線工具ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）分析SlRopGEF基因的理化性質。利用Cell-PLoc 2.0網站中的Plant-mPLoc服務器（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）預測番茄GEF家族蛋白的亞細胞定位。

1.4 序列比對與系統進化樹構建

分別利用在線軟件MUSCLE（https：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/）和GeneDoc（http：//www.nrbsc.org/gfx/genedoc/index.html）對番茄13個GEF家族蛋白氨基酸序列進行多重比對及將比對結果可視化。

將番茄、水稻和擬南芥GEF基因家族成員的氨基酸序列按上述方法進行多序列比對，使用trimAI軟件對比對結果進行修整以排除不需要的區域，然后使用IQ-TREE軟件（設置bootstrap重復次數為 1 000）構建系統發育樹。

1.5 染色體分布、保守基序、基因結構與共線性分析

使用MEME軟件鑒定番茄GEF家族蛋白序列中的保守基序，設置保守基序最小長度為6，最大長度為50，最大發現數目為15個。在茄科數據庫下載番茄SlRopGEF基因組注釋文件，利用TBtools提取基因起始位置、ID及Chrom等信息，并繪制染色體定位圖并進行物種內共線性分析。采用GSDS在線軟件（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn）繪制番茄GEF基因家族成員的基因結構圖。利用MCScanX軟件分別繪制番茄與水稻、番茄與擬南芥之間的共線性關系圖。

1.6 RNA提取與反轉錄

使用南京諾唯贊公司的FastPure Universal Plant Total RNA Isolation Kit和HiScript II Q Select RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）試劑盒分別進行番茄幼苗根、莖、葉總RNA的提取和反轉錄。

1.7 實時熒光定量PCR

使用南京諾唯贊公司的ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒和美國伯樂CFX96 Touch Real-Time PCR 儀進行實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）試驗。利用qPrimerDB在線數據庫（https：//qprimerdb.biodb.org/）搜索SlRopGEF1～SlRopGEF13基因的特異性實時定量擴增引物序列（表1），并在生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以番茄根、莖、葉的cDNA為模板，通過qRT-PCR檢測GEF家族基因在番茄不同器官中的表達水平。擴增體系總體積12 μL，包括cDNA 2 μL、2×SYBR Master Mix 6 μL、10 μmol/L 正反向引物各0.5 μL和去離子水3 μL。使用SlUbiquitin7基因作為定量分析內參基因，qPCR引物序列見表1。試驗共進行3次生物學重復。

1.8 表達模式分析

利用Tomato Functional Genomics數據庫（http：//ted.bti.cornell.edu/cgi-bin/-TFGD/digital/h-ome.cgi）搜索并下載SlRopGEF基因在番茄Heinz品種的不同器官組織以及不同成熟度果實中的表達水平（RPKM），并使用TBtools繪制基因相對表達熱圖。在線下載青枯菌侵染番茄抗病品種（Hawaii 7996）和感病品種（M82）的轉錄組測序數據（https：//onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/tpj.14175），利用GraphPad Prism 9.5軟件對SlRopGEF基因在青枯菌脅迫后的表達水平進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 番茄GEF基因家族鑒定及理化性質分析

基于水稻OsRacGEF1的序列在番茄基因組數據庫中共搜索到13個番茄GEF基因，根據各基因染色體位置及與水稻GEF基因家族的同源關系依次將其命名為SlRopGEF1～SlRopGEF13。由圖1可知，番茄GEF家族基因分布在9條染色體上，其中12號染色體上分布最多，有3個GEF基因；1號和8號染色體上各分布2個GEF基因；3號、4號、6號、7號、9號和10號染色體上各分布1個GEF基因。接下來對13個SlRopGEF的理化性質和亞細胞定位情況進行預測，結果（表2）顯示，番茄GEF蛋白長度在469～679個氨基酸之間，蛋白分子量大小在53.1～76.2 ku之間，理論等電點在 5.20～8.36之間。SlRopGEF蛋白不穩定系數在46.28～59.42之間，表示全部處于不穩定形態。亞細胞定位預測分析發現，番茄GEF基因家族成員都定位于細胞核中；SlRopGEF2和SlRopGEF11除定位在細胞核外，還分別定位于細胞膜和葉綠體中。

2.2 番茄GEF家族系統進化、基因結構與保守結構域分析

根據報道可知，擬南芥和水稻基因組分別共編碼14、11個PRONE類型的GEF蛋白^［9，22］。為了揭示番茄GEF基因在進化過程中與其他物種中該家族基因的同源關系，將番茄、水稻和擬南芥中所有GEF基因家族蛋白的氨基酸序列進行比對并構建系統進化樹，結果（圖2）顯示，所有的GEF基因可根據其親緣關系遠近分為3個亞族（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ），同一亞族成員之間具有較高的同源性以及較近的親緣關系，可能發揮相似的功能。亞族Ⅰ由6個AtRopGEF、4個OsRopGEF和5個SlRopGEF組成；亞族Ⅱ有1個AtRopGEF、1個OsRopGEF和2個SlRopGEF；亞族Ⅲ包括7個AtRopGEF、6個OsRopGEF和6個SlRopGEF。其中SlRopGEF1、SlRopGEF2、SlRopGEF4、SlRopGEF7、SlRopGEF9、SlRopGEF10與水稻中調控稻瘟病抗性的關鍵免疫因子OsRacGEF1（即OsRopGEF7）處于同一亞族中，暗示著這些SlRopGEF也有參與番茄的免疫信號通路的可能。

基因結構分析結果（圖3）顯示除SlRopGEF13有13個外顯子外，其余12個GEF基因外顯子數都在5～7個之間。保守基序預測結果表明，番茄GEF家族蛋白序列中存在10個保守基序，依次將其命名為motif1～motif10。進一步分析發現除SlRopGEF4和SlRopGEF13只含有8個保守基序外，其余SlRopGEF都含有9個保守基序；同一亞族GEF同源蛋白的保守基序組成幾乎一致；亞族Ⅰ特異性含有motif 8但不含motif 10，而亞族Ⅱ特異性含有motif 10卻不含motif 8；13個SlRopGEF的所有保守基序都處于GEF蛋白的PRONE結構域內且序列相似度較高（圖3和圖4）。

2.3 GEF基因家族共線性分析

番茄基因組內GEF基因共線性分析結果顯示存在6個旁系同源基因對，分別為SlRopGEF2/SlRopGEF4、SlRopGEF3/SlRopGEF5、SlRopGEF3/SlRopGEF12、SlRopGEF5/SlRopGEF11、SlRopGEF5/SlRopGEF12和SlRopGEF9/SlRopGEF10（圖5）。每組旁系同源基因對之間存在大片段同源現象，且同源片段內部基因排序保守，這意味著功能上可能也是保守的。

番茄與擬南芥和水稻基因組中GEF基因家族的物種間共線性分析結果（圖6）表明，SlRopGEF中有9個基因與AtRopGEF為直系同源基因，其中SlRopGEF3、SlRopGEF5和SlRopGEF12都與AtRopGEF11有共線性，SlRopGEF5和SlRopGEF12都與AtRopGEF12有共線性，SlRopGEF9和SlRopGEF10都與AtRopGEF7有共線性，暗示這3組基因可能發揮相似的功能。此外，SlRopGEF中有5個基因與OsRopGEF為直系同源基因，其中SlRopGEF9和SlRopGEF10都與OsRopGEF5和OsRopGEF10有共線性，SlRopGEF2和SlRopGEF4都與OsRopGEF7（即OsRacGEF1）有共線性，進一步提高了SlRopGEF2和SlRopGEF4在番茄中發揮抗病功能的可能性。相較于擬南芥，水稻中SlRopGEF的直系同源基因數目較少，表明番茄中該基因家族與擬南芥親緣關系更近。番茄SlRopGEF6、SlRopGEF7和SlRopGEF13與擬南芥和水稻基因組GEF基因家族中成員均無共線性關系，這可能是由于進化過程中這些基因發生變異從而獲得了新的特異性功能。

2.4 番茄GEF家族基因在不同組織中的表達分析

為了深入了解GEF基因在番茄生長和發育過程中的表達模式，本研究利用番茄功能基因組數據庫中Heinz番茄品種的轉錄組數據對其轉錄水平進行了分析，結果表明SlRopGEF具有不同的表達譜。由圖7可知，SlRopGEF13在所有組織中的轉錄水平都是最高的，SlRopGEF7的整體表達水平較低；SlRopGEF1和SlRopGEF7在根部組織中表達較多，暗示這2個基因可能參與調控根部某些細胞通路，例如根毛發育、響應土壤環境脅迫等；SlRopGEF3、SlRopGEF4、SlRopGEF5、SlRopGEF6、SlRopGEF8、SlRopGEF11和SlRopGEF12在花器官中顯著表達，它們極有可能在花器官生長、發育或其他信號通路中發揮著重要的作用；SlRopGEF2、SlRopGEF9、SlRopGEF10和SlRopGEF13則傾向于在果實中表達，表明這些基因有調控果實成熟、顏色、形狀、大小或其他果實發育指標的可能。

由于本研究重點關注GEF家族基因響應青枯菌入侵脅迫的情況，而根—莖—葉是青枯菌從土壤向番茄入侵的途徑，因此接下來利用qRT-PCR方法對番茄Ailsa Craig品種幼苗的根、莖、葉組織中的SlRopGEF基因表達水平進行檢測。試驗結果（圖8）與轉錄組數據基本一致。

2.5 番茄GEF家族基因受青枯菌誘導表達分析

為了初步探究番茄GEF家族基因在抗青枯病過程中的作用，利用轉錄組數據分別對青枯菌侵染處理（0、3、5 d）后番茄抗病和感病品種中SlRopGEF在根、莖部組織中的表達水平進行分析。結果（圖9）顯示，青枯菌處理后5 d，SlRopGEF1、SlRopGEF4、SlRopGEF7、SlRopGEF9、SlRopGEF10、SlRopGEF11和SlRopGEF13的表達水平在感病或抗病品種的根或莖中受到顯著下調；而抗病品種根部SlRopGEF6和SlRopGEF8的表達水平在青枯菌侵染3 d時受到顯著上調； SlRopGEF2、 SlRopGEF3和SlRopGEF5的轉錄水平并不受青枯菌脅迫的影響；SlRopGEF12由于轉錄水平過低，在各品種組織中都未被檢測到。綜上而言，除SlRopGEF2、SlRopGEF3、SlRopGEF5和SlRopGEF12外，其余SlRopGEF均有可能在調控番茄青枯病抗性中發揮一定的作用。

3 討論與結論

迄今為止，GEF家族基因已在多個物種中被鑒定出來，其中水稻中有11個、擬南芥中有14個、藍莓中有32個，但尚無番茄中GEF家族基因的相關報道^{［9，14］}。本研究基于番茄基因組數據庫共鑒定到13個GEF基因，分布在9條染色體上，并將其命名為SlRopGEF1～SlRopGEF13。理化性質分析結果顯示，SlRopGEF蛋白的等電點介于5.20～8.36之間，其中酸性蛋白占85%左右，說明大部分SlRopGEF可能會定位于酸性細胞環境中。番茄、水稻和擬南芥3個物種中GEF基因家族的進化關系分析結果揭示番茄GEF家族基因可分為3個聚類組，這與藍莓中報道的研究結果^［14］相同。值得注意的是，SlRopGEF1、SlRopGEF2、SlRopGEF4、SlRopGEF7、SlRopGEF9、SlRopGEF10與水稻中OsRopGEF7（也叫OsRacGEF1）處于同一分組中，而OsRacGEF1是正調控稻瘟病抗性的關鍵因子，推測番茄中同組GEF基因可能也具有響應病原菌入侵的相似功能^［20］。保守結構域組成與進化關系分析結果基本一致，即具有相似保守基序的SlRopGEF聚類在同一分組中。組織特異性表達和青枯菌誘導表達分析結果顯示，SlRopGEF1和SlRopGEF7傾向于在番茄根部表達且其表達水平受青枯菌侵染抑制，暗示這2個基因很有可能在番茄根部中參與響應青枯菌

入侵的免疫信號途徑。

根據報道可知，GEF蛋白最典型的功能是在受到上游信號分子刺激后調控小G蛋白的活性：幾乎所有的GEF蛋白都是通過與小G蛋白互作以占據小G蛋白上的鎂離子和磷酸基結合位點以促進GDP的解離，催化小G蛋白從與GDP結合的非活性狀態轉變成與GTP結合的活性狀態^［23］。被激活的小G蛋白通過與不同的下游蛋白互作，從而調控不同的胞內信號通路。比如，水稻OsRacGEF1與小G蛋白OsRac1互作并將其激活，被激活的OsRac1與包括支架蛋白OsRACK1A、OsMPK3/6、NADPH氧化酶、木質素生物合成酶OsCCR1等15個組分互作，調控ROS產生及抗病相關基因的表達以實現對病原菌入侵的防御^［24-27］。筆者所在課題組前期發現番茄中的小G蛋白SlRop3和SlRop4可能正調控番茄青枯病抗性，但是調控其活性的上游GEF蛋白尚未見相關報道^［21］。本研究鑒定出了2個可能響應青枯病脅迫的GEF蛋白——SlRopGEF1和SlRopGEF7，這為進一步探究番茄GEF-ROP模塊參與抗青枯病過程的分子機制提供了一定的研究方向和理論基礎。

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