大麥耐鹽近等基因系葉片響應鹽脅迫的轉錄組學分析

摘要：為解析大麥耐鹽基因QSl.TxNn.2H響應鹽脅迫的分子機制，以包含耐鹽基因QSl.TxNn.2H的1對近等基因系N53（鹽敏感）和T66（耐鹽）為供試材料，通過轉錄組測序（RNA-Seq）分析對照和鹽脅迫（300 mmol/L NaCl）處理120 h的近等基因系葉片中響應鹽脅迫的差異表達基因，根據測序結果進行DEG篩選、GO富集和KEGG分析，并使用qPCR技術分析基因的表達水平，驗證轉錄組測序結果。研究表明，從N53中共鑒定到6 652個DEG，其中3 348個基因上調，3 304個基因下調；T66中只鑒定到1 447個DEG，716個基因上調，731個基因下調。GO富集表明，DEG主要富集在細胞過程、代謝過程、轉運蛋白活性、細胞膜等。KEGG富集表明，耐鹽系T66中特異性富集激素信號轉導和植物MAPK信號通路，并篩選到12個在近等基因系間差異表達的基因。使用qPCR技術分析了鹽脅迫中與離子運輸相關的HvHKT、HvNHX和HvVHP基因的表達水平，結果與轉錄組里基因表達趨勢一致，驗證了轉錄組數據的準確性。QSl.TxNn.2H可能通過調控離子相關基因如HvNHX1、HvNHX4、HvHTK1.3、HvHTK2.2、HvVHP1.2和HvVHP1.1的表達調控大麥耐鹽性。此外，在QSl.TxNn.2H定位區間內，有10個DEG，為QSl.TxNn.2H候選基因鑒定提供了參考。研究結果初步探索了耐鹽基因QSl.TxNn.2H調控大麥耐鹽性的分子機制，并分析了QSl.TxNn.2H定位區間內的DEG，為大麥耐鹽育種提供了候選基因及理論依據。

關鍵詞：大麥；鹽脅迫；轉錄組；差異表達基因；KEGG富集；候選基因

中圖分類號：S512.301；S512.303" 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）24-0044-09

收稿日期：2024-09-12

基金項目：江蘇省高等學校大學生創新創業訓練計劃（編號：202411117241Y）；國家自然科學基金（編號：32301871）；省部共建青稞和牦牛種質資源與遺傳改良國家重點實驗室開放課題（編號：XZNKY-CZ-2024-02）；江蘇省重點及面上項目（編號：BE2023334）；國家大麥青稞產業技術體系建設專項（編號：CARS-05）；江蘇高校優勢學科建設工程項目。

作者簡介：李璐飛（2002—），男，山西晉中人，主要從事大麥遺傳育種研究。E-mail：2711607287@qq.com。

通信作者：朱 娟，博士，講師，主要從事大麥遺傳育種研究。E-mail：007670@yzu.edu.cn。

土壤鹽漬化是全球農業面臨的重大挑戰，世界上約20%的灌溉農田受到土壤鹽漬化的不利影響^［1］，且灌溉不善、氣候變化加劇了土壤鹽漬化問題。我國鹽堿地涉及17個省區，主要分布在東北平原、西北干旱區、黃淮海平原及東部沿海地區，嚴重威脅我國的糧食安全^［2］。我國約有1億hm2鹽堿地，其中約0.1億hm2具有開發利用潛力，培育推廣耐鹽作物品種，是有效利用鹽堿地、保障糧食安全生產的重要舉措。

鹽脅迫下，高濃度的Na+在細胞中積累，過量的Na+會導致K+缺失，最終產生毒害，破壞植物體內的離子穩態^［3］。因此，維持細胞質內較高的鉀鈉離子比，維持植物體內的離子平衡，是植物耐鹽的關鍵^［4］。目前關于鹽脅迫下植物離子平衡研究主要集中在HKT基因家族（high-affinity K+ transporter，高親和性鉀離子轉運蛋白）、NHX基因家族（Na+/H+ exchangers，Na+/H+逆向轉運蛋白）及VHP基因家族（vacuolar H+-pyrophosphatase，液泡H+-焦磷酸酶）。

1995年Rubio等從小麥中克隆了第1個HKT基因TaHKT2；1，進一步研究發現，HTK基因對Na+也具有轉運作用^［5］。Rosario等研究發現HTK基因功能上差異與第一選擇性成孔區（P-loop ）的Ser/Gly殘基有關^［6］。Ser殘基SGGG型，多為Na+單向轉運體，而Gly殘基GGGG型，多為Na+和K+同向轉運體。在模式作物擬南芥中，AtHKT1可以控制Na+進入和高親和力K+攝取^［7］。athkt1突變體的雄蕊在鹽脅迫下過度積累Na+，會限制雄蕊的伸長，導致雄性不育。AtHKT1在擬南芥雄蕊的韌皮部和木質部周圍特異性表達，為鹽脅迫下提高植物產量提供了新策略^［8］。來自面包小麥的TmHKT1；5-A，通過增強排Na+能力，可以降低葉片中的Na+含量。在鹽堿地中，與不包含TmHTK1；5-A的鹽敏感系相比，含有TmHTK1；5-A的近等基因系產量可提高25%^［9］，具有較大應用潛力。大麥中HvHKT1；5具有Na+轉運能力，敲除HvHKT1；5可以減少Na+從根部向地上部轉移，從而提高大麥的耐鹽性，不同于其他禾本科作物中的HKT1；5，HvHKT1；5負調控大麥的耐鹽性^［10］。

NHX基因家族屬于轉運蛋白的一價陽離子/質子反轉運蛋白（CPA1）家族，對維持離子穩態和pH梯度有關鍵作用。在擬南芥中，鑒定到6個NHX基因，主要分布在液泡和高爾基體中，與離子的轉運和儲存密切相關。Elias等發現擬南芥AtNHX1和AtNHX2定位在液泡，與野生型相比，nhx1/nhx2雙突變體液泡的酸性pH值更高，K+含量更低，表明AtNHX1和AtNHX2對控制液泡pH值和K+穩態具有重要作用^［11］。水稻中OsNHX3受鹽脅迫正向調節表達，且在葉片中的表達水平較高，可能通過控制葉片中Na+區隔化來提高水稻的耐鹽性^［12］。Jabeen等通過分析鹽脅迫下36份野生大麥和2份栽培大麥中HvNHX基因的表達水平，發現HvNHX1和HvNHX3在耐鹽品種中的表達始終高于鹽敏感品種，HvNHX1和HvNHX3的序列存在豐富的變異，西藏野生大麥獨有的HvNHX1和HvNHX3等位基因可以提高大麥耐鹽性，推測HvNHX1和HvNHX3是通過Na+在液泡中的隔離調節鹽脅迫下離子穩態^［13］。

液泡H+泵焦磷酸酶類（VHP）為Na+在液泡中的區域化提供了質子梯度。VHP產生的電化學梯度H+可以驅動次級轉運蛋白，如Na+/H+轉運蛋白。液泡Na+/H+逆向轉運蛋白介導的H+梯度驅動Na+向液泡運輸，不僅可以減少細胞質中多余的Na+，還可以增加細胞的滲透壓，因此在植物耐鹽性中發揮重要作用。上調表達VHP可以為液泡中Na+的區域化提供額外的能量，并賦予轉基因植物耐鹽性。HVP10是大麥Nax3控制排鈉的候選基因，HVP10敲除突變體Na+積累增加，耐鹽性降低^［14］。

RNA-Seq是一種用于研究轉錄組的高通量測序技術^［15］，近年來RNA測序技術已經成為深入研究轉錄組復雜性的強大工具，通過對基因組序列已經探明的物種進行基因組測序，并進行基因表達差異性分析，可以發現大量的單核苷酸多態性位點（SNP）、插入缺失位點（InDel）、結構變異位點（SV）等，有助于理解物種的遺傳多樣性和進化關系^［16］。董明等通過對高粱苗期鹽脅迫的轉錄組數據進行分析，發現高粱苗期響應鹽脅迫主要受到激素信號轉導和光合作用調控，且類黃酮生物合成途徑在耐鹽品種中發揮重要作用^［17］。劉佳月等通過對轉錄組數據分析，挖掘出許多離子運輸、激素信號轉導、代謝過程等相關的基因，為解釋植物耐鹽機制提供了理論依據^［18］。

大麥（Hordeum vulgare L.）是世界第四大禾谷類作物，具有食用、飼用、釀酒、保健等功能。與其他糧食作物水稻、小麥相比，大麥耐鹽性強，但大麥耐鹽基因挖掘進展緩慢。因此，本研究通過對1對耐鹽性有差異的近等基因系進行轉錄組分析，在轉錄水平上對大麥耐鹽機制進行初步研究，以期為大麥耐鹽遺傳育種提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以包含耐鹽基因QSl.TxNn.2H的1對近等基因系N53（鹽敏感）和T66（耐鹽）為試驗材料。該近等基因系在正常生長時無明顯差異，鹽脅迫后，N53葉片萎蔫甚至死亡，而T66葉片持綠，無明顯鹽害癥狀^［19-20］。

1.2 供試材料培養與處理

取飽滿且大小一致的N53、T66種子，用10%的次氯酸鈉溶液消毒5 min，無菌水沖洗3遍，正常發芽后，選取露白一致的種子，于2023年11月種植于揚州大學氣候室培養，培養條件設置溫度15～20 ℃，12 h光照—12 h黑暗，濕度50%。播種于 3 cm×3 cm×10 cm的小黑盆中，每盆播種4粒。待大麥幼苗生長至3葉1心期進行鹽脅迫處理，鹽脅迫濃度為300 mmol/L的NaCl溶液，同時設置對照加入等量的蒸餾水，均設置3個生物學重復。鹽脅迫4 d之前，近等基因系和對照間無明顯差異（葉片健康生長，株高差異不顯著），而在處理5 d時（120 h），鹽敏感系N53葉片開始出現輕微鹽害癥狀時（葉尖萎蔫）而T66無鹽害表現。因此，收集鹽脅迫下120 h的葉片液氮速凍后于-80 ℃冰箱保存，送樣至百邁客生物公司進行轉錄組測序。

1.3 轉錄組測序與數據分析

采用 Trizol法提取大麥幼苗樣品的總RNA，并利用超微量分光光度計Nanodrop和生物分析儀Agilent 2100檢測RNA濃度和純度。用Oligo（dT）磁珠富集mRNA。將mRNA打斷后，以其為模板合成cDNA，經磁珠純化、末端修復及3′-末端加 A、連接接頭和 USER 酶消化、PCR擴增和純化完成文庫構建，質檢合格后利用Novaseq6000測序平臺進行cDNA的文庫測序。通過內部 Perl 腳本對FASTQ格式的原始數據進行處理，移除接頭序列、Ploy-N序列和低質量序列。利用HISAT2工具軟件比對，將質控數據映射到參考基因組序列，過濾出干凈讀數。將鹽脅迫組和對照組樣品測序得到的序列進行比較，基因表達水平通過FPKM （fragments per kilobase of transcript per million fragments）來估計。利用DESeq R軟件包（1.10.1）進行差異表達基因分析，以Plt;0.01，絕對值 "|log2FC|gt;1.5 作為篩選差異基因的條件。之后進行GO分析和KEGG分析，篩選顯著性高的差異表達基因。基因本體論（GO） 通過clusterProfiler R軟件包進行富集分析；KEGG分析中通過 Kobas軟件來測試差異表達基因的統計富集，使用clusterProfiler R軟件包來尋找顯著富集的KEGG途徑。將差異表達基因分別與GO（gene ontology）和KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）數據庫進行比對，獲得相應差異表達基因的注釋信息。為確保轉錄組數據的可靠性，選取與大麥鹽脅迫相關的HvNHX、HvHKT及HvVHP基因，進行qPCR驗證?；虻木幋a區序列于Ensembleplants 網站 （https：//plants.ensembl.org/Hordeum_vulgare/Info/Index）下載，根據其序列長度，使用 primer 5.0 軟件設計熒光qPCR引物（表1），以大麥GAPDH（HORVU.MOREX.r3.7HG0703580）基因為內參基因，由擎科生物科技有限公司進行合成。在7500 Real-time PCR儀上進行擴增，具體程序：95 ℃ 變性2 min；95 ℃退火10 s；60 ℃延伸30 s。利用2^-ΔΔCT值，并進行定量分析。重復3次。

2 結果與分析

2.1 鹽脅迫下大麥幼苗轉錄組分析

對對照（CK）和鹽脅迫處理（S）下12個cDNA文庫（每個樣品3個獨立生物學重復）進行高通量測序，各樣本凈讀數均大于19 507 294，凈數據量大于5.84 G，GC含量在53.75%～55.34%，說明高通量測序數據質量良好，數據量充足，GC含量穩定。對于二代測序，通常認為質量控制參數的標準為Q20大于95%、Q30大于85%，本研究測序結果中Q20 堿基比例大于97.48%，Q30堿基百分比大于93.80%，意味著測序數據準確可靠，滿足轉錄組分析的要求（表2）。

將樣品比對至大麥參考基因組，各樣品比對基因組讀數在94.94%以上，其中唯一比對讀數在91.15% 以上，表明測序結果與參考基因組具有較高的相似性和一致性。唯一比對讀數的比例稍低可能是由于大麥基因基因組部分序列高度保守或者是存在高GC含量區域，導致部分讀數無法唯一地映射到參考基因組上（表3）。

為驗證樣品的可重復性，對N53和T66的12個樣品進行PCA（圖1）。降維之后，4個試驗組的3個生物重復距離相近，重復性好。同時N53CK和T66CK樣品距離相近，N53S和T66S距離遠，說明N53CKY和T66CKY之間基因表達差異較小，而N53S和T66S之間基因表達差異較大。

2.2 差異表達基因（DEG）鑒定

鹽脅迫與對照相比，從N53中共鑒定到6 652個DEG，其中3 348個基因上調，3 304個基因下調；T66中只鑒定到1 447個DEG，716個基因上調，731個基因下調；鹽脅迫下N53和T66相比，共鑒定到 4 845 個DEG，其中2 103個基因上調，2 742 個基因下調（圖2-A）。進一步對N53和T66上調和下調的差異基因進行分析，繪制韋恩圖（圖 2-B、圖2-C），在N53和T66中，515個DEG均上調表達，455個DEG均下調表達。

2.3 差異基因GO富集分析

GO富集分析可以將DEGs分為生物學過程（biological process）、細胞組分（cellular component）和分子功能（molecular function）3個層面。對N53和T66的DEG分別進行GO富集分析。N53富集的結果顯示，從生物學過程層面看，DEG以細胞過程、代謝過程、生物調控和對刺激反應為主；從細胞組分層面看，細胞解刨實體占比最多，細胞內受體其次，含蛋白質復合物最少；分子功能層面看，則以結合、催化活性、轉運蛋白活動為主。T66的GO富集結果與N53相似（圖3）。

進一步從3個層面進行分析（圖4），N53的生物學過程在對蛋白磷酸化、熱反應、蛋白質復合物寡聚化、過氧化氫反應、水反應等過程顯著富集；T66的生物學過程在蛋白磷酸化、熱反應、細胞表面受體信號通路、L-脯氨酸生物合成過程、對生物刺激的反應等過程顯著富集。分子功能富集結果顯示，N53最顯著富集的6條GO是ATP結合、金屬離子結合、蛋白激酶活性、氧化還原酶活性、催化活性、跨膜受體激酶活性。T66最顯著富集的6條GO分別是ATP結合、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性、鈣離子結合、多糖結合、蛋白激酶活性和跨膜受體激酶活性。細胞組分富集結果顯示，N53中的DEG在光系統Ⅱ放氧復合體、葉綠體基質、膜的外源性成分等顯著富集。T66中的DEG在質膜、膜的整體成分和液泡部分顯著富集。

2.4 差異基因的KEGG通路分析

為了研究在N53和T66中響應鹽脅迫的生物學通路，分別對N53和T66中DEGs進行KEGG通路分析。N53的KEGG分析結果顯示，最顯著富集的5條通路分別是碳代謝、氨基酸生物合成、亮氨酸和異亮氨酸降解、戊糖磷酸途徑和乙醛酸和二羧酸代謝。T66的KEGG分析結果顯示，DEG最顯著富集的5條通路分別是淀粉和蔗糖代謝、植物-病原菌互作、精氨酸和脯氨酸代謝、激素信號轉導和植物MAPK信號轉導通路。以上這些代謝途徑可能是大麥響應鹽脅迫的重要途經，其中植物激素信號轉導通路和MAPK信號轉導通路在耐鹽材料T66中顯著富集，該通路可能對提高大麥耐鹽性起關鍵作用（圖5）。

2.5 富集通路差異基因挖掘

對T66特有的植物激素信號轉導通路和MAPK信號轉導通路富集的DEG，以FPKMgt;1、｜log2FC｜gt;1.5、Plt;0.01為標準，篩選到78個DEG。分析78個DEGs在N53和T66中的表達水平，用log2FC繪制圖6。大部分基因在N53和T66中的表達變化水平一致，但12個DEG在2個材料中差異表達，HORVU.MOREX.r3.UnG0753020、HORVU.MOREX.r3.3HG0220680、HORVU.MOREX.r3.1HG0000690、 HORVU.MOREX.r3.5HG0484690、HORVU.MOREX.r3.4HG0331910在N53中表達水平無顯著變化，在T66中顯著下調表達；HORVU.MOREX.r3.7HG0642890在N53中顯著下調表達，在T66中顯著上調表達。HORVU.MOREX.r3.6HG0561620、HORVU.MOREX.r3.3HG0273500、HORVU.MOREX.r3.2HG0188860、HORVU.MOREX.r3.3HG0304380在N53中顯著上調表達，在T66顯著下調表達。

2.6 qPCR驗證

以FPKMgt;1、Plt;0.01、｜log2FC｜gt;1.5為差異基因標準，分析鹽脅迫中鈉鉀離子運輸關鍵基因HKT基因、NHX基因和VHP基因的表達水平，得到HvNHX1、HvNHX4、HvHTK1.3、HvHTK2.2、HvVHP1.2、NHX7和HvVHP1.1為差異表達基因，其中HvNHX1、HvNHX4、HvHTK1.3、HvHTK2.2、HvVHP1.2在N53中顯著上調表達，NHX7在N53和T66中均顯著下調表達，HvVHP1.1在N53中顯著下調表達。

為了驗證轉錄組數據分析的DEG的可靠性，利用qPCR驗證以上7個差異表達基因，以log2FC繪制熱圖（圖7）。差異基因的轉錄水平和qPCR結果趨勢一致，證明了本研究數據的可靠性。也表明QSl.TxNn.2H可能通過調控離子相關基因如HvNHX1、HvNHX4、HvHTK1.3、HvHTK2.2、HvVHP1.2和HvVHP1.1的表達調控大麥耐鹽性。

3 討論

植物的耐鹽性易受環境影響 是非常復雜的數量性狀^［21］。轉錄組測序技術的發展，為挖掘植物耐鹽基因提供了高效、低成本的方法。本研究通過對1對耐鹽性有差異的近等基因系N53和T66進行轉錄組分析，在N53和T66中分別篩選出6 652個和 1 447 個DEG，N53中3 348個基因上調，3 304個基因下調；T66中716個基因上調，731個基因下調。在鹽敏感材料N53中的DEG數目顯著多于耐鹽材料T66，說明N53的基因表達水平受鹽脅迫的影響更大。Kong等對RPY geng（耐鹽品種）和Chao 2R（鹽敏感品種）進行轉錄組分析，Chao 2R的DEG顯著多于RPY geng，本研究結果與之一致。鹽脅迫對鹽敏感材料的基因轉錄水平影響更大^［22］。

DEG的GO和KEGG分析發現，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性、激素信號轉導和植物MAPK信號通路在T66中特異性富集。絲氨酸/蘇氨酸激酶通過磷酸化下游信號蛋白，把細胞外信號傳入細胞內，影響基因轉錄實現多種生物學功能^［23］。PP2CA（protein phosphatase 2 catalytic subunit alpha）是4種主要的絲氨酸/蘇氨酸激酶之一，也是ABA信號轉導通路核心負調控部分^［24］。KIM等發現水稻中OsRF1靶向OsPP2C09蛋白進行泛素化和降解，OsPP2C09蛋白的降解，使野生型對鹽脅迫更加敏感^［25］。Wu等也發現過表達RGLG1可以增強PP2CA和其他可能的PP2Cs的降解，調節擬南芥耐鹽性^［26］。KEGG分析富集了大量植物激素信號轉導通路基因，該研究中近等基因系的DEGs也發現了大量ABA通路相關轉錄因子如bZIP、CBL、WRKY等，以絲氨酸/蘇氨酸活性為關鍵的ABA信號轉導通路可能對大麥鹽脅迫響應有重要意義。

QSl.TxNn.2H是影響N53和T66耐鹽性的關鍵位點，位于大麥2H上10 217 825～15 025 898 bp的區域^［27］。本研究以FPKMgt;1，｜log2FC｜gt;1.5，Plt;0.01為標準，對N53和T66該區域的DEG進行篩選，共鑒定到10個DGE（表4）。HORVU.MOREX.r3.2HG0099930編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶，是細胞內糖酵解途徑中的關鍵酶，是鹽脅迫下維持光合作用和植物發育的重要因子^［28］。HORVU.MOREX.r3.2HG0101890編碼甲基轉移基因，是鹽敏感系N53中表達水平上調程度最大的基因，Hafeez等研究發現，甲基轉移基因對棉屬的鹽脅迫、纖維發育和次級細胞壁的形成有多重反應^［29］。甲基轉移基因主要參與次級代謝和代謝途徑，次生代謝產物（如木質素、類黃酮、酚酸）在植物響應非生物脅迫時增加，為植物提供更好的耐受性。

4 結論

綜上所述，通過對近等基因系N53和T66葉片在對照和鹽脅迫下的轉錄組學測序分析，篩選到在近等基因系間差異表達的基因4 845個，其中2 103個上調表達，2 742個下調表達。GO及KEGG富集分析表明植物激素信號轉導和MAPK信號轉導通路可能是T66耐鹽性調控的的關鍵通路。利用qPCR技術分析與離子運輸相關的HvHKT、HvNHX和HvVHP基因在N53和T66葉片中的表達水平，QSl.TxNn.2H可能通過調控離子相關基因如HvNHX1、HvNHX4、HvHTK1.3、HvHTK2.2、HvVHP1.2和HvVHP1.1的表達調控大麥耐鹽性。在QSl.TxNn.2H定位區間內存在10個差異表達基因，為QSl.TxNn.2H候選基因鑒定提供了參考。

參考文獻：

［1］Zhao S S，Zhang Q K，Liu M Y，et al. Regulation of plant responses to salt stress［J］. International Journal of Molecular Sciences，2021，22：4609.

［2］Wang G Z，Ni G，Feng G，et al. Saline-alkali soil reclamation and utilization in China：progress and prospects［J］. Frontiers of Agricultural Science and Engineering，2024，11（2）：216-228.

［3］Zelm E，Zhang Y，Testerink C. Salt tolerance mechanisms of plants［J］. Annual Review of Plant Biologyl，2020，71：403-433.

［4］Deinlein U，Stephan A B，Horie T，et al. Plant salt-tolerance mechanisms［J］. Trends in Plant Science，2014，19（6）：371-379.

［5］Rubio F，Gassmann W，Schroeder J I. Sodium-driven potassium uptake by the plant potassium transporter HKT1 and mutations conferring salt tolerance［J］. Science，1995，270（5242）：1660-1663.

［6］Haro R，Bauelos M A，Rodríguez-Navarro A. High-affinity sodium uptake in land plants［J］. Plant and Cell Physiology，2010，51（1）：68-79.

［7］Rus A，Yokoi S，Sharkhuu A，et al. AtHKT1 is a salt tolerance determinant that controls Na+ entry into plant roots［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2001，98（24）：14150-14155.

［8］Uchiyama T，Saito S，Yamanashi T，et al. The HKT1 Na+ transporter protects plant fertility by decreasing Na+ content in stamen filaments［J］. Science Advances，2023，9（22）：5495.

［9］Munns R，James R A，Xu B，et al. Wheat grain yield on saline soils is improved by an ancestral Na+ transporter gene［J］. Nature Biotechnology，2012，30（4）：360-364.

［10］Huang L，Kuang L H，Wu L Y，et al. The HKT transporter HvHKT1；5 negatively regulates salt tolerance［J］. Plant Physiology，2020，182（1）：584-596.

［11］Bassil E，Tajima H，Liang Y C，et al. The Arabidopsis Na+/H+ antiporters NHX1 and NHX2 control vacuolar pH and K+ homeostasis to regulate growth，flower development，and reproduction［J］. The Plant Cell，2011，23（9）：3482–3497.

［12］Fukuda A，Nakamura A，Hara N，et al. Molecular and functional analyses of rice NHX-type Na+/H+ antiporter genes［J］. Planta，2011，233（1）：175-188.

［13］Jabeen Z，Irshad F，Hussain N，et al. NHX-Type Na+/H+ antiporter gene expression under different salt levels and allelic diversity of HvNHX in wild and cultivated barleys［J］. Frontiers in Genetics，2022，12：809988.

［14］Fu L B，Wu D Z，Zhang X C，et al. Vacuolar H+-pyrophosphatase HVP10 enhances salt tolerance via promoting Na+translocation into root vacuoles［J］. Plant Physiology，2022，188（2）：1248-1263.

［15］祁云霞，劉永斌，榮威恒. 轉錄組研究新技術：RNA-Seq及其應用遺傳［J］. 2011，33（11）：1191-1202.

［16］李小白，向 林，羅 潔，等. 轉錄組測序（RNA-Seq）策略及其數據在分子標記開發上的應用［J］.中國細胞生物學學報，2013，35（5）：720-726.

［17］董 明，再吐尼古麗·庫爾班，呂 芃，等. 高粱苗期耐鹽性轉錄組分析和基因挖掘［J］.中國農業科學，2019，52（22）：3987-4001.

［18］劉佳月，李永宏，王照蘭. 轉錄組在植物抗鹽育種中的應用［J］.分子植物育種，2020，18（1）：125-133.

［19］Zhu J，Fan Y，Li C D. et al. Candidate genes for salinity tolerance in barley revealed by RNA-seq analysis of near-isogenic lines［J］. Plant Growth Regulation，2020，92：571–582.

［20］Zhu J，Fan Y，Shabala S，et al. Understanding mechanisms of salinity tolerance in barley by proteomic and biochemical analysis of near-isogenic lines［J］. International Journal of Molecular Sciences，2020，21（4）：1516.

［21］段俊枝，楊翠蘋，王 楠，等. WRKY轉錄因子在植物耐鹽基因工程中的應用進展［J］. 江蘇農業科學，2023，51（5）：71-80.

［22］Kong W L，Sun T，Zhang C H，et al. Comparative transcriptome analysis reveals the mechanisms underlying differences in salt tolerance between indica and japonica rice at seedling stage［J］. Frontiers in Plant Science，2021，12：725436.

［23］Zhang Y X，Tian H D，Chen D，et al. Cysteine-rich receptor-like protein kinases：emerging regulators of plant stress responses［J］. Trends in Plant Science，2023，28（7）：776-794.

［24］Shinozawa A，Otake R，Takezawa D，et al. SnRK2 protein kinases represent an ancient system in plants for adaptation to a terrestrial environment［J］. Communications Biology 2019，2：30.

［25］Kim S，Park S I，Kwon H，et al. The rice abscisic acid-responsive RING finger E3 ligase OsRF1 targets OsPP2C09 for degradation and confers drought and salinity tolerance in rice［J］. Frontiers in Plant Science，2022，12：797940.

［26］Wu Q，Zhang X，Peirats-Llobet M，et al. Ubiquitin ligases RGLG1 and RGLG5 regulate abscisic acid signaling by controlling the turnover of phosphatase PP2CA［J］. Plant Cell，2016，28（9）：2178-2196.

［27］Zhu J，Fan Y，Shabala S，et al. Understanding mechanisms of salinity tolerance in barley by proteomic and biochemical analysis of near-isogenic lines［J］. International Journal of Molecular Sciences，2020，21（4）：1516.

［28］Chang L L，Guo A P，Jin X，et al. The beta subunit of glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase is an important factor for maintaining photosynthesis and plant development under salt stress-based on an integrative analysis of the structural，physiological and proteomic changes in chloroplasts in Thellungiella halophila［J］. Plant Science，2015 236：223-238.

［29］Hafeez A，Ge Q，Zhang Q，et al. Multi-responses of O-methyltransferase genes to salt stress and fiber development of Gossypium species［J］. BMC Plant Biology，2021，21（1）：37.