廣西煙草靶斑病病原菌鑒定與防效試驗(yàn)

摘要：采用組織分離法，從感病煙葉中分離并純化出煙草靶斑病菌株，并通過致病性測(cè)定、形態(tài)學(xué)特征以及分子生物學(xué)手段，對(duì)病原菌進(jìn)行鑒定。為篩選出能夠有效抑制煙草靶斑病的藥劑，采用菌絲生長(zhǎng)速率法，測(cè)試了苯甲·丙環(huán)唑等3種類型共8種市售殺菌劑對(duì)廣西賀州分離菌株HZBZ01和HZGP01菌絲生長(zhǎng)的抑制作用。每種類型中選出效果最佳的1種殺菌劑進(jìn)行田間試驗(yàn)，以驗(yàn)證其實(shí)際防效。室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果表明，苯甲·丙環(huán)唑的毒力最高，對(duì)2株供試菌株的平均EC50為2.911×10^-2 mg/L；在生物制劑中，8%井岡霉素水劑的毒力最高；而在生防菌劑中，109 CFU/mL 貝萊斯芽孢桿菌CY30水劑的效果最佳。田間試驗(yàn)結(jié)果表明，使用10%苯甲·丙環(huán)唑乳油112.5 mL/hm2對(duì)煙草靶斑病的防效較為顯著，第3次施藥后7 d內(nèi)防效達(dá)到69.89%，顯著高于其他田間施藥處理。本研究結(jié)果可為防控?zé)煵莅邪卟√峁┯盟巺⒖迹瑸閷?shí)際生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：煙草靶斑病；病原菌鑒定；藥劑篩選；廣西煙區(qū)；防效試驗(yàn)；毒力測(cè)定

中圖分類號(hào)：S435.72" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2024）24-0127-06

收稿日期：2023-11-24

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31960540）；外交部瀾滄江-湄公河合作基金（編號(hào)：201806）；中國煙草總公司廣西壯族自治區(qū)公司項(xiàng)目（編號(hào)：202145000024006）。

作者簡(jiǎn)介：湯佳萸（1999—），女，貴州安順人，碩士研究生，主要從事煙草病原真菌學(xué)研究。E-mail：632778587@qq.com。

通信作者：桑維鈞，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事植物病理學(xué)教學(xué)與科研工作。E-mail：984139246@qq.com。

煙草產(chǎn)業(yè)在我國具有重要的經(jīng)濟(jì)地位，多年來我國煙葉生產(chǎn)取得了長(zhǎng)足的發(fā)展。然而近年來，隨著種植面積的不斷擴(kuò)大和種煙年限的延長(zhǎng)，煙葉生產(chǎn)過程中逐漸出現(xiàn)了如栽培模式落后、煙區(qū)土壤肥力下降等問題，從而導(dǎo)致葉部病害頻繁發(fā)生，嚴(yán)重影響了煙葉的質(zhì)量和經(jīng)濟(jì)效益^［1］。廣西壯族自治區(qū)位于我國西南部，是我國煙草種植大省，該地屬于亞熱帶季風(fēng)氣候，常年處于高溫高濕環(huán)境，極易導(dǎo)致葉部病害發(fā)生。

煙草靶斑病（tobacco target spot）是煙草上的重要病害，自2006年在我國首次發(fā)現(xiàn)后，相繼在云南、四川、湖南等地區(qū)普遍發(fā)生，造成重大經(jīng)濟(jì)損失^［2-5］。該病害由立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）引起，自苗期到大田期均有發(fā)生，病原菌主要通過傷口和自然孔口直接侵染葉片，煙葉組織發(fā)病后，病原菌菌絲體可通過氣流、風(fēng)雨等媒介傳播，引起病原菌的再侵染^［6-7］。廣西地區(qū)常年進(jìn)行稻煙輪作，引起水稻紋枯病（rice sheath blight）的立枯絲核菌通過菌絲體和菌核在土壤越冬后來年再度侵染煙草，從而導(dǎo)致靶斑病的發(fā)生^［8］。2012年，譚海文在廣西煙區(qū)進(jìn)行真菌性病害調(diào)查時(shí)，已在廣西多個(gè)煙區(qū)查見了煙草靶斑病^［9］。因此，對(duì)廣西煙區(qū)靶班病病原菌的分離鑒定及防治試驗(yàn)，是一項(xiàng)至關(guān)重要的工作，可為該煙區(qū)煙葉產(chǎn)質(zhì)量提升及激發(fā)煙農(nóng)積極性提供有力支撐。

針對(duì)煙草靶斑病的防治，孫宏宇綜述了國外已經(jīng)開展的一些化學(xué)防治技術(shù)^［10］，自此我國研究者也開展了許多藥效試驗(yàn)，并取得了大量成果。孫美麗等通過室內(nèi)毒力測(cè)定及田間試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，苯醚甲環(huán)唑、嘧菌酯可作為煙草靶斑病防控優(yōu)選藥劑^［11］；尹秀娟等通過菌絲生長(zhǎng)速率和田間試驗(yàn)防治煙草靶斑病的高效配方藥劑為咯菌腈與丁子香酚1 ∶1復(fù)配^［12］；聶忠揚(yáng)等認(rèn)為，戊唑醇對(duì)于貴陽煙區(qū)的靶斑病菌株具有很好的抑制效果，可以用于開展后續(xù)大田防治試驗(yàn)^［13］。以上藥效試驗(yàn)的結(jié)果值得我國各地?zé)焻^(qū)在靶斑病防治時(shí)借鑒。

筆者所在課題組在廣西自治區(qū)賀州煙區(qū)開展病害調(diào)查過程中發(fā)現(xiàn)，煙草品種K326上靶斑病危害程度較重，為因地制宜地篩選出防治廣西煙草靶斑病的藥劑，展開了針對(duì)廣西煙區(qū)煙草靶斑病的研究。本試驗(yàn)采用組織中分離法從感染煙草靶斑病的煙葉組織分離純化出煙草靶斑病病原菌，進(jìn)行致病性測(cè)定、形態(tài)學(xué)鑒定及基于ITS的分子生物學(xué)鑒定，以明確病原菌的分類地位，并通過室內(nèi)毒力測(cè)定及田間試驗(yàn)篩選出針對(duì)廣西煙草靶斑病的有效藥劑，因綠色防控需求，特選取化學(xué)藥劑、生物農(nóng)藥及生防菌劑進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，旨在為廣西煙草靶斑病的綠色防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株

2022年6月，筆者所在課題組在廣西自治區(qū)富川縣福利鎮(zhèn)白竹村及葛坡煙草種植基地，采集典型癥狀的靶斑病病葉置于采集袋內(nèi)，并記錄時(shí)間、地點(diǎn)、編號(hào)等，帶回實(shí)驗(yàn)室保濕培養(yǎng)，用于后續(xù)病原菌分離。

1.1.2 主要培養(yǎng)基和試劑

試驗(yàn)所用培養(yǎng)基為馬鈴薯瓊脂葡萄糖（PDA）培養(yǎng)基（青島海博生物技術(shù)有限公司）。

1.1.3 供試藥劑

供試藥劑如表1所示。8種市售殺菌劑包括3種類型，其中化學(xué)農(nóng)藥有苯甲·丙環(huán)唑、丙唑·戊唑醇，生物農(nóng)藥有大蒜素、小檗堿、井岡霉素，生防菌劑有貝萊斯芽孢桿菌CY30、哈茨木霉、枯草芽孢桿菌。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌的分離與純化

采用組織分離法用無菌剪刀在鏡檢病斑的病健交界處剪取5 mm×5 mm大小的葉片組織，經(jīng)75%乙醇浸泡30 s及1%次氯酸鈉消毒3 min后，無菌水漂洗3次，再用無菌濾紙吸凈水分后接種于PDA培養(yǎng)基上，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱（型號(hào)為RXZ-380A，寧波江南儀器廠）中暗培養(yǎng)。待接種點(diǎn)周圍長(zhǎng)出菌絲，用無菌接種針挑取邊緣菌絲接種至PDA培養(yǎng)皿上進(jìn)行純化培養(yǎng)。

1.2.2 病原菌的致病性測(cè)定

采用科赫法則驗(yàn)證菌株的致病性。菌株在PDA培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)3 d后，用直徑5 mm的滅菌打孔器打取菌餅。選取健康的煙株，將菌餅接種于無傷煙株中部位置葉片的兩側(cè)，并在接種部位附近放置濕潤(rùn)的無菌棉球保濕，以接種PDA瓊脂塊為空白對(duì)照，每株接種3張葉。用自封袋對(duì)接種葉片進(jìn)行套袋，煙株置于28 ℃、相對(duì)濕度75%、12 h光照/12 h黑暗周期的人工氣候箱中培養(yǎng)，定期觀察記錄發(fā)病情況，待出現(xiàn)明顯病狀后，對(duì)發(fā)病葉片進(jìn)行病原菌的分離純化，并與原接種菌株進(jìn)行菌落形態(tài)等表型比較，若基本一致則可判定接種菌株為致病菌。

1.2.3 病原菌的形態(tài)學(xué)觀察

將菌株接種在馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基 （PDA） 上，28 ℃恒溫暗培養(yǎng)5 d，對(duì)菌株的培養(yǎng)性狀進(jìn)行直觀描述，并挑取菌絲體制作玻片在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.4 病原菌的分子鑒定

將病原菌接種于覆有半透膜的PDA培養(yǎng)皿中央暗培養(yǎng)3 d，用無菌手術(shù)刀刮取邊緣菌絲。采用EZup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒［產(chǎn)品編號(hào)為B518259，生工生物工程（上海）股份有限公司］抽提菌株DNA，并用引物ITS1 （5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）/ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）對(duì)菌株進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)程序參考文獻(xiàn)［14］，PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后由生工生物工程（上海）股份有限公司代為測(cè)序。所得序列通過BLAST比對(duì)分析，從GenBank中收集用于比較的其他序列相關(guān)信息，通過CExpress軟件將序列進(jìn)行拼接和剪切，以BioEdit進(jìn)行序列比對(duì)及剪切，應(yīng)用MAGA 11的鄰接法（neighor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap檢驗(yàn)重復(fù)次數(shù)為1 000次。

1.2.5 室內(nèi)毒力測(cè)定

生長(zhǎng)速率法：將煙草靶斑病菌作為目的菌，對(duì)其進(jìn)行室內(nèi)藥劑篩選。將培養(yǎng)7 d的供試菌株用直徑為5 mm的打孔器沿菌落同一圓周打取菌餅，將菌絲面朝下接種在PDA平板中間位置，以加無菌水的培養(yǎng)基平板為對(duì)照（CK），每個(gè)處理3次重復(fù)，28" ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3 d，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率、毒力回歸方程、有效抑制中濃度EC50及相關(guān)系數(shù)。

平板對(duì)峙法：將市售生防菌劑稀釋成菌懸液備用。在PDA平板正中央接種直徑為5 mm的病原菌菌餅，以病原菌菌餅位置為中心，在正四方各2.5 cm處用長(zhǎng)牙簽蘸取適量生防菌菌懸液，對(duì)照組點(diǎn)滴適量無菌水，均以菌液無流動(dòng)為適量，各處理均3次重復(fù)。28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算菌落平均直徑以及各生防菌對(duì)病原菌的抑菌率。

1.2.6 田間防效試驗(yàn)

試驗(yàn)地位于廣西壯族自治區(qū)百色市靖西市化峒鎮(zhèn)三友村，面積為0.66 hm2，種植烤煙品種K326。2023年5月12日（煙草生長(zhǎng)中后期，已查見靶斑病發(fā)生）使用背負(fù)式電動(dòng)噴霧器進(jìn)行第1次施藥，共設(shè)3個(gè)藥劑處理：10%苯甲·丙環(huán)唑乳油112.5 mL/hm2（推薦用量，下同）、8%井岡霉素水劑1 125 mL/hm2、109 CFU/mL貝萊斯芽孢桿菌CY30水劑562.5 mL/hm2，另設(shè)噴施清水的對(duì)照。其后每隔7 d噴施1次，共噴3次。每個(gè)處理3次重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組排列，共12個(gè)小區(qū)，小區(qū)間設(shè)立保護(hù)行。煙田正常水肥管理。

采用定株調(diào)查法，每重復(fù)定25株，調(diào)查并記錄每株的總?cè)~片數(shù)和各級(jí)病葉數(shù)，共調(diào)查4次，即首次施藥前1 d和每次施藥后7 d。病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照GB/T 23222—2008《煙草病蟲害分級(jí)與調(diào)查方法》，記錄各處理煙草發(fā)病情況，計(jì)算病情指數(shù)與防效。

病情指數(shù)=∑（各級(jí)病葉數(shù)×相對(duì)級(jí)數(shù)值）/（調(diào)查總?cè)~數(shù)×9）×100；

防效=（對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對(duì)照病情指數(shù)×100%。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel 2017、SPSS 26.0軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離純化、致病性測(cè)定

經(jīng)分離獲得純培養(yǎng)菌株2個(gè)，分別編號(hào)為HZGP01和HZBZ01。將病原菌接種到煙草葉片，早期接種部位產(chǎn)生水漬狀病斑，7 d后變?yōu)楹稚“甙l(fā)生穿孔現(xiàn)象（圖1-B），田間癥狀相似（圖1-A），對(duì)照未表現(xiàn)出病癥（圖1-C） 。自病健交界處再次分離獲得病原菌，鏡檢結(jié)果表明，再次分離獲得的病原菌與原接種菌株是相同的病原菌（圖2）。

2.2 病原菌的形態(tài)特征觀察

病原菌HZBZ01和HZGP01的形態(tài)特征基本相同。菌株HZGP01在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d后，菌落表面有同心輪紋，菌絲發(fā)達(dá)，呈白色，輻射狀向四周擴(kuò)展，生長(zhǎng)后期菌絲顏色轉(zhuǎn)為褐色，數(shù)量增多（圖2-A）。顯微鏡下，菌絲無色透明，分枝部位趨近于直角，分枝外部有一定程度收縮；具隔膜，常生在分枝點(diǎn)附近，具有很明顯的“T”形分枝結(jié)構(gòu)（圖 2-B）。

2.3 分子生物學(xué)鑒定

將測(cè)序所獲得的菌株HZBZ01和HZGP01的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中通過BLAST比對(duì)，從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載與立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）相關(guān)的10個(gè)菌株的ITS序列，通過鄰接法構(gòu)建得到系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖3），比對(duì)結(jié)果顯示，2個(gè)菌株與立枯絲核菌具有100%的同源性。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征與分子生物學(xué)分析 將菌株HZBZ01和HZGP01鑒定為立枯絲核菌。

2.4 室內(nèi)毒力測(cè)定

經(jīng)測(cè)定，供試8種藥劑對(duì)2株病原菌的菌絲生長(zhǎng)存在不同程度的抑制活性（表2、表3）。在化學(xué)農(nóng)藥中，苯甲·丙環(huán)唑的抑菌活性最強(qiáng)，對(duì)2株菌的EC50分別為2.915×10^-2、3.066×10^-2 mg/L，平均值為2.991×10^-2 mg/L，丙唑·戊唑醇效果稍差；在生物農(nóng)藥中，井岡霉素抑菌活性最好，相應(yīng)地，EC50分別為1.847×102、3.923×102 mg/L，平均值為2.885×102 mg/L，大蒜素及小檗堿抑菌活性較差；在生防菌劑中，貝萊斯芽孢桿菌CY30效果最好，對(duì)2株病原菌的抑制率平均值為64.52%。

此外，煙草靶斑病菌不同菌株對(duì)同種藥劑的敏感性存在一定差異。對(duì)于井岡霉素、小檗堿、大蒜素而言，菌株HZBZ01的EC50分別是菌株HZGP01的2.12、1.18、1.10倍；對(duì)于丙唑·戊唑醇、苯甲·丙環(huán)唑來說，菌株HZGP01的EC50分別是菌株HZBZ01的1.13、1.05倍。

2.5 田間防效試驗(yàn)結(jié)果

由表4可知，在試驗(yàn)劑量下，田間使用的3種殺菌劑對(duì)煙草靶斑病均有一定防效，且各藥劑防效均隨施用次數(shù)的增加而提高。在第1次施藥后7 d，苯甲· 丙環(huán)唑處理防效相對(duì)較高，為39.60%，貝萊斯芽孢桿菌CY30處理防效最低，為10.84%。第2次施藥后，各藥劑防效均有所提升，苯甲· 丙環(huán)唑處理防效最高，為51.72%，貝萊斯芽孢桿菌CY30處理防效最低，為26.23%，兩者間存在顯著差異，8%井岡霉素水劑防效居中。第3次施藥后，對(duì)病害產(chǎn)生了更強(qiáng)的控制效果。其中，苯甲·丙環(huán)唑的防效最高，為69.89%，顯著高于其他處理；其次是8%井岡霉素水劑，為52.88%；貝萊斯芽孢桿菌CY30處理防效最低，為32.80%。

3 討論與結(jié)論

煙草靶斑病的病原菌為立枯絲核菌，其寄主范圍廣泛，能夠侵染多種重要的農(nóng)作物，如馬鈴薯、梨子、草莓、水稻、棉花等，因此，煙草種植時(shí)應(yīng)避免與上述作物間套作或輪作，防止該病原菌在寄主中傳播，造成更大的經(jīng)濟(jì)損失^［15-20］。但考慮到煙農(nóng)在實(shí)際生產(chǎn)中愿意產(chǎn)生更多的經(jīng)濟(jì)效益，因此在實(shí)際中采取有效的防控措施以防止病害暴發(fā)和減少經(jīng)濟(jì)損失顯得至關(guān)重要。

本研究將煙草靶斑病的病原菌進(jìn)行分離鑒定，并采用菌絲生長(zhǎng)速率法及平板對(duì)峙法測(cè)定了8種殺菌劑對(duì)于煙草靶斑病的抑制效果，結(jié)果表明，10%苯甲·丙環(huán)唑乳油、8%井岡霉素水劑及109 CFU/mL貝萊斯芽孢桿菌CY30水劑對(duì)該煙草靶斑病菌均有良好的抑制效果，前二者平均EC50分別為2.991×10^-2 mg/L、2.885×102 mg/L，貝萊斯芽孢桿菌CY30在對(duì)峙試驗(yàn)中抑制率高達(dá)64.52%。同一處理下，不同分離菌株生長(zhǎng)存在一定差異。

基于室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果，選擇10%苯甲·丙環(huán)唑乳油、8%井岡霉素水劑和109 CFU/mL貝萊斯芽孢桿菌CY30水劑開展田間防治試驗(yàn)。結(jié)果表明，隨著施藥次數(shù)的增加，各藥劑處理對(duì)煙草靶斑病的防治效果均有所提升，其中10%苯甲·丙環(huán)唑乳油的防治效果最好，這與李再明等的試驗(yàn)結(jié)果^［21-22］相同。目前在煙葉生產(chǎn)中，8%井岡霉素水劑已作為防治煙草靶斑病的新農(nóng)藥登記在冊(cè)，但在本次試驗(yàn)中，8%井岡霉素水劑防效相對(duì)較低，為52.88%，這與馬欣等的結(jié)果^［23-24］有所出入，可能與植煙地區(qū)生態(tài)條件和病害發(fā)生程度不同有關(guān)，也可能由于生產(chǎn)中施用次數(shù)過多從而導(dǎo)致當(dāng)?shù)鼐戤a(chǎn)生抗藥性。謝劍波等分離出的1株貝萊斯芽孢桿菌對(duì)水稻紋枯病具有抑制作用，且田間防效可達(dá)52.33%，與常規(guī)防治藥劑5%井岡霉素水劑防效相當(dāng)^［25］，這與筆者的試驗(yàn)結(jié)果有所差異，可能是由生防菌劑的菌株及所防控植物種類不同所致，抑或是當(dāng)?shù)責(zé)熑~的葉際微生物群落不適宜該菌劑的生長(zhǎng)，具體原因有待日后進(jìn)一步研究。根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果，建議在廣西煙區(qū)煙草靶斑病的田間防治中，主要施用10%苯甲·丙環(huán)唑乳油，為避免產(chǎn)生抗藥性，可與8%井岡霉素水劑交替施用。109 CFU/mL貝萊斯芽孢桿菌CY30水劑雖在本次田間試驗(yàn)中效果不佳，但仍可作為備選藥劑與其他藥劑交替施用以降低對(duì)土壤環(huán)境的影響。

綜上，盡管生物防治具有潛在的環(huán)保優(yōu)勢(shì)，但目前對(duì)于煙草靶斑病的防治來說，化學(xué)藥劑依然是最為有效的防治手段。在未來的防治研究發(fā)展方向中，生物防治方面仍然需要更多的創(chuàng)新和突破，以期為煙草靶斑病的防治提供更加環(huán)保和可持續(xù)的技術(shù)措施。

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