煙草疫霉拮抗細菌M10-4的篩選及其生防和促生效果

摘要：為獲得防治煙草黑脛病的生防資源，采用稀釋涂布法及室內平板對峙法從煙草根際分離篩選煙草疫霉Phytophthora nicotianae）生防菌株。通過形態學、生理生化特性和16S rDNA 序列分析進行鑒定，并明確其抑菌廣譜性及促生特性。篩選獲得一株對煙草疫霉拮抗效果較好的生防細菌M10-4，抑菌率為73.97%，鑒定為吡咯伯克霍爾德氏菌（Burkholderia pyrrocinia），它對辣椒疫霉病菌、煙草赤星病菌、煙草鐮刀菌根腐病菌、柑橘炭疽病菌、煙草靶斑病菌都有一定抑制效果，對煙草黑脛病的田間防效為60.7%。該生防菌株具有產IAA能力，產IAA達6.754 mg/L，具有溶鉀、溶磷、產蛋白酶的能力，對煙草的株高、最大葉長、總鮮重、總干重、地上部干重等促生效果明顯。吡咯伯克霍爾德氏菌M10-4在病害防控和促生作用上效果明顯，可作為PGPR進行研究，具有較好的應用前景。

關鍵詞：煙草；疫霉；吡咯伯克霍爾德氏菌；生物防治；促生作用

中圖分類號：S435.72" 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）24-0133-08

收稿日期：2023-12-13

基金項目：湖南省重點研發項目（編號：2023NK2019）；中國煙草總公司項目［編號：110202101050（LS-10）、110202201019（LS-03）］。

作者簡介：梅斯釔（1998—），女，江西九江人，碩士，主要從事植物病害生物防治研究。E-mail：453516175@qq.com。

通信作者：唐前君，博士，教授，主要從事植物病害生物防治研究，E-mail：Tangqianjun@126.com；劉天波，高級農藝師，主要從事植物病害生物防治研究，E-mail：tianboliu@126.com。

由煙草疫霉（Phytophthora nicotianae）引起的煙草黑脛病是煙草上一種重要土傳病害，在世界煙區普遍發生^［1］，給我國煙草種植業造成重大損失^［2］。目前，控制煙草黑脛病的主要方法有品種遺傳改良、物理防治、化學防治和生物防治等。化學防治具有簡便性、高效性，是煙草黑脛病首選的防治方法^［3］，但過于依賴化學殺菌劑，不僅使病原菌產生抗藥性，還會破壞生態環境，造成農藥殘留、土壤板結、影響非靶標生物生存等問題^［4］。

近年來，為了減少化學殺菌劑的使用，環境安全友好、無毒無殘留的生物防治手段越來越受到研究者們的關注^［5］。張蒙蒙等在病株根際分離的貝萊斯芽孢桿菌YCYM-09菌株對煙草黑脛病的室內防效為61.5%^［6］。李苗苗等研究發現，3種芽孢桿菌GY1、GY10、GY12混合施用對煙草疫霉的平板抑菌率為86.9%，盆栽防效為74.53%^［7］。章舸從根際土壤中篩選得到的放線菌H-3對煙草疫霉的抑菌率達81.90%^［8］。生防菌除了可以防治病害，還能促進植物生長發育，可以作為微生物肥料使用^［9］。吳風光等發現，用芽孢桿菌A03制成的菌肥對煙草角斑病、赤星病有較好拮抗作用，能提高土壤中的礦質元素含量，從而使烤煙增產^［10］。王典等發現，哈茨木霉CGMCC23294在田間對煙草黑脛病防治效果最高達83.6%，同時促進煙株根系發育和莖葉生長，上等煙比例提高^［11］。目前對防治煙草黑脛病的生防菌篩選主要集中在芽孢桿菌、放線菌等，但由于煙葉種植制度和土壤生態環境的差異，需要不斷挖掘和發現新的本地土著生防菌。目前，對伯克霍爾德氏菌（Burkholderia sp.）作為煙草黑脛病生防菌的研究鮮有報道，研究其防效及促生作用，對豐富煙草病害生防菌株種類和開發生物菌劑具有重要意義。

本研究從煙草根際土壤中分離篩選出1株對煙草黑脛病有拮抗作用的生防細菌，開展了形態學、生理生化特征和分子生物學鑒定，測定抑菌譜以及促生特性，以期為豐富生防資源及煙草黑脛病的生物防治提供理論支撐。

1 材料和方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株 煙草疫霉及抑菌譜測定用的辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici）、煙草赤星病菌（Alternaria alternata）、煙草鐮刀菌根腐病菌（Fusarium falciforme）、柑橘炭疽病菌（Gloeosporium frucrigenum）、煙草靶斑病菌（Rhizoctonia solani）均保存于湖南農業大學植物保護學院農業微生物基因組學研究室。

1.1.2 培養基 LB液體培養基（1 L）：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g（固體LB培養基只需在液體LB的基礎上加入15 g瓊脂粉）。馬鈴薯瓊脂固體培養基PDA（1 L）：去皮新鮮馬鈴薯 200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉15 g。燕麥培養基（1 L）：燕麥片30 g，瓊脂粉15 g。Salkowski比色液^［12］：15 mL濃硫酸中加入25 mL超純水，加入0.75 mL的0.5 mol/L FeCl3·6H2O。

1.2 煙草黑脛病生防菌的分離篩選

采用稀釋涂布法分離菌株^［13］。取黑脛病發生嚴重的煙田中健康植株的根際土壤，將取得的煙草根際土壤除雜過篩，稱取10 g于250 mL錐形瓶中，無菌水定容至90 mL，置于30" ℃、180 r/min的搖床中充分振蕩混勻20～30 min。將土壤懸浮液稀釋成10^-2～10^-6 5個稀釋倍數的菌懸液。在超凈臺中用移液器吸取各梯度的土壤溶液0.1 mL至LB平板上涂布，各稀釋設置3個重復，28 ℃恒溫培養。2 d后觀察菌落生長情況，挑取菌落特征不同的單菌落多次平板劃線純化，甘油保存備用。

采用平板對峙法篩選生防菌株^［14］。將培養5 d的煙草疫霉PDA平板用打孔器（直徑5 mm）打取菌餅，作為靶標菌放置在新的PDA平板中央，用無菌吸頭將分離的菌株發酵液對稱點接在距煙草疫霉菌餅2 cm處，以未接菌株的為空白對照，每個處理3次重復。置于28 ℃恒溫培養箱倒置暗培養5～7 d，待對照黑脛病菌絲長滿平板，測量處理菌落直徑，并計算抑菌率。按以下公式計算抑菌率^［15］：

抑菌率=對照組菌落生長直徑-處理組菌落生長直徑對照組菌落生長直徑-菌餅直徑×100%。

1.3 菌株M10-4鑒定

1.3.1 形態學鑒定 將菌株M10-4劃線于固體LB平板，置于30 ℃恒溫培養箱中培養1～2 d，觀察菌落大小、形態、顏色、光滑程度等特征。挑取單菌落進行革蘭氏染色，在光學顯微鏡下觀察顏色，電鏡觀察芽孢、莢膜、鞭毛等菌體特征。用購于北京奧萊博科技有限公司的芽孢染色液（Moeller法）試劑盒、莢膜染色液（Hiss法）試劑盒、鞭毛染色液（Leifson法）試劑盒進行染色驗證。

1.3.2 生理生化鑒定 參照《常見細菌系統鑒定手冊》^［16］和《伯杰細菌鑒定手冊》^［17］進行生理生化特性測定。

1.3.3 分子鑒定 挑取菌株M10-4單菌落到 10 μL 無菌水中，重懸混勻，利用細菌擴增通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）進行擴增。PCR擴增體系（20 μL）為Mix 10 μL、ddH2O 8.2 μL、引物1492R 0.4 μL、引物27F 0.4 μL、模板DNA" 1 μL。反應條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性 30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，35個循環；72 ℃ 延伸5 min，4 ℃保存。PCR產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行基因序列測定，將所測得的序列在NCBI上進行BLAST比對。以大腸桿菌為外群，利用MAGAX軟件，采用Neighbor-Joining法構建拮抗菌株的系統發育樹。

1.4 菌株M10-4抑菌譜測定

采用平板對峙法分別將辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici）、煙草赤星病菌（Alternaria alternata）、煙草鐮刀菌根腐病菌（Fusarium falciforme）、柑橘炭疽病菌（Gloeosporium frucrigenum）、煙草靶斑病菌（Rhizoctonia solani）與M10-4對峙培養，操作及抑菌率計算方法同“1.2”節。

1.5 菌株M10-4發酵濾液對煙草疫霉的抑制效果

將生防菌接入液體LB中發酵48 h后分裝到50 mL離心管中，7 000 r/min離心15 min，用 0.22 μm 的過濾器過濾后加入55 ℃左右的燕麥培養基中，搖勻后倒板。配成濾液濃度為10%、30%的平板，以不加濾液的平板為空白對照，每組3個重復。在平板中央接入5 mm煙草疫霉菌餅，28 ℃恒溫培養5～7 d，待空白對照長滿后，采用十字交叉法測量處理組菌落直徑，挑取菌絲在光學顯微鏡下觀察形態^［18］。

1.6 菌株M10-4對煙草黑脛病的田間防效

2022年3月，選取湖南省湘西自治州煙草黑脛病往年發生較重的煙田進行防效試驗。以菌株M10-4發酵液（1×108 CFU/mL）為試驗組，化學對照藥劑為68%精甲霜靈·錳鋅可濕性粉劑1 000倍液，50%烯酰嗎啉可濕性粉劑1 000倍液，生物對照藥劑為10億CFU/g 枯草芽孢桿菌粉劑，空白對照為清水。每個處理50株，設置3個重復，隨機區組排列，四周設保護行3行，各處理的其他條件都與當地保持一致。分別在移栽時，移栽后7、14、21 d進行灌根。按照《煙草病蟲害分級及調查方法》（GB/T 23222—2008）中的分級標準及調查方法，在最后一次灌根30 d后進行病害調查，記錄小區中的總株數及各級病株數，計算發病率、病情指數、防治效果，公式如下：

發病率=發病株數調查總株數×100%；

病情指數=∑（各級病葉數×各級代表值）調查總葉數×最高級代表值×100；

防治效果=對照病情指數-處理病情指數對照病情指數×100%。

1.7 菌株M10-4的促生作用

1.7.1 產IAA能力測定 在100 mL的LB液體培養基中加入10 mg L-色氨酸，待完全溶解后接種菌株M10-4，放入30 ℃、180 r/min的搖床中培養 48 h。定性觀察^［19］：將培養48 h后的菌液分裝至 2 mL 離心管中，離心取上清，加入等量Salkowski比色液，避光靜置30 min，觀察顏色變化。定量測定^［20］：LB液體培養基加入吲哚乙酸，配置成含吲哚乙酸0、10、20、30 mg/L的標準溶液，各取1 mL至 2 mL 離心管，加入等量Salkowski比色液，嚴格避光靜置30 min，分別測定D530 nm，制作標準曲線。測定加入Salkowski比色液的無菌發酵液D530 nm，代入標準曲線計算菌株M10-4的產IAA量^［21］。

1.7.2 溶鉀、溶磷能力測定 將溶鉀鉀長石培養基^［22］、溶磷無機磷培養基^［23］倒平板，用9 mm打孔器在中央打孔后，用移液器在孔內加入50 μL（D600 nm=2.0）菌液，置于30 ℃恒溫培養箱中培養 6～7 d后觀察有無溶鉀、溶磷圈產生^［24］。

1.7.3 產胞外蛋白酶、纖維素酶、噬鐵素能力測定 將脫脂奶粉培養基^［25］、CMC-Na培養基^［26］、CAS培養基^［27］分別倒平板，用9 mm打孔器在中央打孔后，用移液槍在孔內加入50 μL（D600 nm=2.0）菌液，置于 30 ℃ 恒溫培養箱中培養3 d后觀察有無透明圈產生。纖維素酶試驗用剛果紅染色10 min后，再用 1 mol/L NaCl洗脫，觀察有無透明圈產生。

1.7.4 盆栽促生試驗 待煙草（云煙87）長出3～4張真葉時，挑選大小相近的煙苗移栽至盆中，用M10-4發酵液（濃度1×108 CUF/mL）灌根，以LB液體培養基作為對照，每個處理3次重復，每個重復5株煙。每隔7 d灌根1次，共灌根3次，30 d后測量根、莖、葉的各項指標^［28］。

1.8 數據處理

使用Excel 2019進行數據處理、結果計算及標準曲線的繪制，利用SPSS Statistics 25對各組數據進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 菌株對煙草疫霉的拮抗效果

從煙草根際土壤中共分離得到66株細菌，對煙草疫霉有拮抗作用的有M10-4、MX-4、YFZ-8、DL-3、MCL-11、LJH-11等6株菌株（表1），其中以M10-4對煙草疫霉的拮抗效果最好，抑菌率為73.97%（圖1）。

2.2 菌株M10-4鑒定

2.2.1 形態學特征 菌株M10-4在LB平板上 30 ℃ 培養48 h后菌落呈不透明乳白色，圓形，黏稠狀，表面光滑濕潤，邊緣平滑（圖2-a）。革蘭氏染色紅色，為陰性（圖2-b），菌體大小為（0.3～0.5） μm×（0.6～1.2） μm，短桿狀，無莢膜，無芽孢，無鞭毛（圖2-c）。

2.2.2 生理生化特性 菌株M10-4不能水解淀粉，V-P反應、甲基紅反應、吲哚反應均為陰性，不具有運動性；明膠液化、接觸酶反應、氧化酶反應、硝酸鹽還原為陽性，可利用檸檬酸鹽（表2）。

2.2.3 16S rDNA基因序列分析 對菌株M10-4 16S rDNA序列進行PCR擴增，得到長度1 500 bp左右的PCR產物條帶。將序列在NCBI數據庫進行BLAST檢索比對，結果顯示，與吡咯伯克霍爾德氏菌（Burkholderia pyrrocinia）同源性最高，達到99.86%。利用MEGAX軟件構建系統發育樹，菌株M10-4與吡咯伯克霍爾德氏菌（登錄號為CP094459.1）處于同一分支簇（圖3）。結合形態學和生理生化特性鑒定結果，將菌株M10-4鑒定為吡咯伯克霍爾德氏菌。同時將序列提交至NCBI GenBank獲得登錄號OR835659。

2.3 菌株M10-4抑菌譜

菌株M10-4對辣椒疫霉病菌、煙草赤星病菌、煙草鐮刀菌根腐病菌、柑橘炭疽病、煙草靶斑病菌菌均有拮抗作用，抑菌率分別為68.59%、67.98%、66.25%、63.78%、58.05%（表3、圖4）。

2.4 菌株M10-4發酵濾液對煙草疫霉的抑制效果

菌株M10-4的發酵濾液對煙草疫霉有明顯抑制作用，濃度越高，抑制效果越好，濃度為30%時黑脛病菌生長明顯受抑制（圖5），抑菌率達72.75%。濃度為10%的菌株M10-4發酵濾液抑制煙草疫霉菌絲生長，菌絲腫大、畸形，粗細不一，原生質分布不均（圖6）。

2.5 菌株M10-4對煙草黑脛病的田間防效

在最后一次灌根30 d后，記錄田間煙苗患煙草黑脛病的病情等級，計算其發病率、病情指數及防治效果。使用M10-4發酵液處理的發病率為26.67%，病情指數為9.92，均顯著低于化學藥劑、生物藥劑及清水處理組；防治效果達60.70%，顯著高于化學藥劑、生物藥劑及清水處理組（表4）。

2.6 菌株M10-4促生特性

2.6.1 產IAA能力 加入Salkowski比色液避光靜置30 min后，肉眼可見顏色由淡黃色變成淺粉色，證明菌株M10-4可以產生長素IAA（圖7）。用紫外分光光度計測得比色后的發酵濾液D530 nm值為0.058，用4個梯度的吲哚乙酸標準溶液的D530 nm制作成標準曲線（y=0.006 1x+0.016 8，r2=0.978 4），由此計算出IAA產量為6.754 mg/L。

2.6.2 溶磷、溶鉀及產蛋白酶能力 菌株M10-4培養6～7 d后，在溶鉀、溶磷、脫脂奶粉培養基平板上可以明顯觀察到透明圈（圖8） CMC-Na培養基、CAS培養基平板無變化，表明菌株M10-4具有溶鉀、溶磷、產蛋白酶能力，無纖維素酶、噬鐵素的產出。

2.6.3 對煙株的促生作用 與對照組相比，經 M10-4 灌根處理過的煙株長勢更好（圖9）。處理組的株高、最大葉長、總鮮重、總干重、地上部干重均有顯著提升，增長率分別為115.22%、88.68%、70.88%、94.65%、96.13%。最大葉寬、根長、根鮮重、根干重也有一定的增加，增長率分別為18.35%、14.92%、18.89%、50.00%（表5）。

3 結論與討論

生防菌是生物防治的重要方法之一，分離和篩選優質生防菌株是豐富煙草生防資源的重要手段。煙草根際土壤中有很多可以用作生防的微生物，其中包括芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、鏈霉菌屬（Streptomyces）等具有相對優勢的菌屬^［29］。本研究從煙草根際土壤中分離得到有拮抗效果的菌株M10-4，經形態學、生理生化及分子鑒定其為吡咯伯克霍爾德氏菌（Burkholderia pyrrocinia）。

目前已有報道伯克霍爾德氏菌作為生防菌防治植物病害。解星麗等研究發現，多噬伯克霍爾德氏菌（Burkholderia multivorans）WS-FJ9對林木病原菌物具有很好的生防潛力^［30］。許萌杏等分離得到洋蔥伯克霍爾德氏菌（Burkholderia cepacia）JX-1，其溫室防治番茄青枯病的防效達80.89%^［31］。任嘉紅等研究發現，吡咯伯克霍爾德氏菌JK-SH007對楊樹潰瘍病具有防治及促生作用^［32-33］。劉璐等報道的吡咯伯克霍爾德氏菌S377對棉花黃萎病具有良好的生防潛力^［34］。于曉慶等從煙草根際分離得到吡咯伯克霍爾德氏菌Lyc2，對棉苗立枯病的溫室防效達48.8%^［35］。Wang等的研究表明，occidiofungin是菌株Lyc2抗真菌活性的重要成分^［36］。本研究發現，M10-4的無菌發酵液對煙草黑脛病病原菌有很好的抑制作用，使菌絲無法正常生長，發生畸形、腫大等變化，對煙草赤星病菌、辣椒疫霉病菌、煙草靶斑病菌、煙草鐮刀菌根腐病菌、柑橘炭疽病菌均有抑制作用。同時，M10-4在田間對煙草黑脛病表現出較好的防治效果。

植物根際促生菌（plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）是指對作物具有促生、防治、增產作用的微生物^［37］，可以增強植物對土壤中礦物質的吸收，比如一些不易被吸收的磷和鉀會被轉化為可吸收的形式，從而減少對化肥的依賴；能夠分泌鐵載體，充分利用環境中含量較低的鐵元素，具備產生植物激素、固氮、產生抗生素等功能^［38-39］。伯克霍爾德氏菌可以作為PGPR菌種，在NCBI數據庫中查詢到全基因組序列的吡咯伯克霍爾德氏菌有15種，其中對植物有益處的菌株為DSM 10685、mHSR5、Hargis、Lyc2、CH-67^［38］。韓超等研究發現，吡咯伯克霍爾德氏菌A12對煙草根的生長、葉綠素含量、光合及蒸騰速率均有促進作用^［40］。Li等分離得到了2株具有良好溶磷、固氮、產IAA和鐵載體的吡咯伯克霍爾德氏菌ZJ9和ZJ174^［41］。Han等的研究表明，在鹽脅迫條件下接種吡咯伯克霍爾德氏菌P10能促進花生幼苗的生長^［42］。本研究發現菌株M10-4具有產IAA、溶磷、溶鉀以及產蛋白酶的能力，對溫室內盆栽煙草具有促生作用，能顯著提升株高、最大葉長、總鮮重、總干重、地上部干重，有作為PGPR研究的潛力。

以上結果表明，吡咯伯克霍爾德氏菌M10-4在病害防控、促生方面均表現較好，具有較大的研究意義及應用前景。由于田間的環境較為復雜，存在許多不可控因素，因此在下一步的研究中，應著重于田間促生的效果，除此之外還需評估其生物安全性，研究其是否會產生污染環境的及影響土壤微生物的物質。考慮到實際生產需要，還要更深入地研究生防菌株的發酵條件及其抑菌、促生物質。

本研究中分離的伯克霍爾德氏菌（Burkholderia pyrrocinia）M10-4對煙草疫霉在平板和大田試驗中有較好的抑制作用，無菌發酵液可以破壞煙草疫霉菌絲的正常生長，對辣椒疫霉病菌、煙草赤星病菌、煙草鐮刀菌根腐病菌、柑橘炭疽病、煙草靶斑病菌均有抑制作用。此外，M10-4能夠產IAA、溶磷、溶鉀、產蛋白酶，對盆栽煙株的生長有明顯促進作用，有作為PGPR研究的潛力。

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