雞miR-133a-3p的表達、生物信息學分析及其靶基因初篩

摘要：為了研究雞不同組織中miR-133a-3p的表達情況并預測其靶基因，進行GO、KEGG富集分析，對關鍵靶基因進行初篩，闡明其在機體中的作用。通過miRBase檢索15個物種的miR-133a-3p序列，采用MEGA 7.0進行多物種序列比對及系統進化樹構建；使用TargetScan、miRDB預測雞miR-133a-3p的靶基因，再取交集，對其進行GO、KEGG富集分析；通過qPCR檢測miR-133a-3p在羅斯308肉雞各組織中的表達量，并檢測其靶基因在不同生長周齡（W0～W6）胸肌中的表達規律。結果表明，不同物種miR-133a-3p的成熟序列同源性極高，物種間保守，系統進化樹分析發現，雞miR-133a-3p與原鴿聚為一支；預測獲得145個靶基因，GO富集分析顯示，靶基因富集到酶活性調控、分子功能負調控、內質網系統形成、肌球蛋白結合等條目，KEGG結果顯示，靶基因富集到p53、mTOR、FoxO、肌動蛋白細胞骨架調控等多條與肌肉生長發育相關的信號通路；對肌肉生長發育相關通路進行分析，挖掘到PIK3CB、NRAS、EGFR、PRKAA1、IGF1R這5個顯著富集基因；miR-133a-3p僅在胸肌、腿肌、心臟中表達，且在胸肌中的表達量顯著高于心臟、腿肌（Plt;0.01）；隨著生長周齡的增長，miR-133a-3p在胸肌中的表達量先升后降，而靶基因IGF1R的表達量呈先降后升的規律，它們的拐點均在第3周齡，二者負相關。綜上說明，雞miR-133a-3p在肌肉組織中特異性表達，很可能通過靶基因IGF1R調控肌肉生長發育。

關鍵詞：雞；miR-133a-3p；生物信息學；表達分析；肌肉生長發育；靶基因篩選

中圖分類號：S831.2" 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）24-0179-08

收稿日期：2024-07-02

基金項目：四川省科技廳科技計劃（編號：2019YJ0341）；國家開放大學產教融合協同育人中心建設試點項目（編號：2023CY3314）。

作者簡介：余春蓮（1991—），女，重慶人，碩士，講師，主要研究方向為畜禽遺傳育種。E-mail：519154841@qq.com。

通信作者：楊煒蓉，博士，副教授，主要研究方向為動物遺傳育種。E-mail：constance890711@126.com。

在畜禽育種與生產中，肌肉發育是一個關鍵的生物學過程，它直接影響動物的生長速度、肉質及經濟價值^［1］。隨著生物信息學和分子生物學的迅速發展，人們對肌肉發育相關基因及其調控機制的認識越來越深入。微小RNA（microRNA，miRNA）是一種長約22 nt的內源性非編碼RNA，通過與肌生成相關基因相互作用，控制成肌細胞增殖、分化等肌生成過程，在肌肉發育中發揮著至關重要的作用^［2］。miR-133是一類肌肉組織特異性表達且高保守的功能型miRNA，它通過其序列結構、豐度表達、多樣性的轉錄方式，調控肌發育相關基因表達，從而調控骨骼肌細胞的增殖和分化過程^［3-5］。miR-133a-3p作為miR-133家族中的一員，已被證實在小鼠、山羊、牛、人和虹鱒魚等物種的骨骼肌細胞增殖分化、肌管形成、肌肉損傷修復、肌肉再生過程中發揮重要功能^［6-11］。然而，miR-133a-3p在家禽中的研究較少，特別是關于它對雞骨骼肌生長發育的研究仍不清楚。在雞這一重要的經濟動物中，肌肉發育的質量直接關系到其生產性能和商業價值，對雞肌肉發育相關miR-133a-3p的研究顯得尤為重要。Li等發現，miR-133a-3p在雞骨骼肌中的表達差異上調，證實它與肌肉生長發育密切相關，然而對它的分子調控機制以及在不同組織中的表達規律并沒有研究^［12-14］。本研究采用生物信息學分析手段，對雞miR-133a-3p的序列特征、保守性、靶基因預測等方面進行綜合分析，旨在揭示其在雞肌肉發育中的潛在調控機制。同時，本研究利用qPCR技術檢測miR-133a-3p在羅斯308肉雞各組織中的表達水平以及miR-133a-3p及其靶基因在不同生長周齡胸肌組織中的表達規律，對靶基因進行初篩。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

飼養試驗于2024年4—6月在四川大恒家禽育種有限公司開展。以羅斯308肉雞為試驗素材，按照動物試驗倫理委員會的要求，于1日齡（W0）飼喂至6周齡（W6）。期間每周齡采集1次樣品，每次采集3只。采集組織樣品包括心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胸肌、腿肌，樣品經液氮速凍后于－80 ℃冷凍保存。

1.2 主要試劑

反轉錄試劑盒（PrimeScript^TM IV 1st strand cDNA Synthesis Mix）購自日本TaKaRa公司；QuantiNovaTM SYBR Green PCR試劑盒、DNase/RNase-free去離子水購自西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；TRIzol^TM Plus RNA 純化試劑盒購自賽默飛世爾科技公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 查詢miR-133a-3p的位置及其序列、結構

利用miBase （https：//mirbase.org/）下載雞（Gallus gallus）、斑馬魚（Danio rerio）、原鴿（Columba livia）、猩猩（Pan troglodytes）、眼鏡王蛇（Ophiophagus hannah）、鯉魚（Cyprinus carpio）、西洋鮭（Salmo salar）、牛（Bos taurus）、豬（Sus scrofa）、兔（Oryctolagus cuniculus）、小鼠（Mus musculus）、人（Homo sapiens）、鵪鶉（Callithrix jacchus）、鴨嘴獸（Ornithorhynchus anatinus）、山羊（Capra hircus）這15個物種的miR-133a-3p序列（表1），并在NCBI上查詢gga-miR-133a-3p（登錄號：MIMAT0001126）在基因組上的定位信息。

1.3.2 miR-133a-3p序列比對及系統進化樹構建

利用MEGA 7.0 軟件的Alignment程序，對已獲取15個物種的miR-133a-3p成熟體進行不同物種間的序列對比；通過MEGA 7.0軟件的 phylogeny程序，計算各模型組合的貝葉斯信息準則分數，采用基于距離參數的鄰接法（neighbor-joining，NJ），構建miR-133a-3p的系統進化樹。

1.3.3 gga-miR-133a-3p靶基因預測及功能分析

分別利用2個在線網站miRDB（https：//mirdb.org/index.html）、Targetscan（https：//www.targetscan.org/vert_80/），預測gga-miR-133a-3p的靶基因。利用在線工具Draw Venn Diagram（https：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）對2個網站的預測結果取交集，以降低假陽性。利用R包ClusterProfiler v4.2對gga-miR-133a-3p的靶基因交集進行基因本體論（GO）及京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析。基于Plt;0.05的篩選標準，選擇顯著富集的GO條目和KEGG通路，最終結果以矩狀氣泡圖的形式呈現。

1.3.4 組織表達分析

采用TRIzol^TM Plus RNA 純化試劑盒提取羅斯308肉雞各組織樣品的總RNA，按照反轉錄試劑盒操作步驟合成cDNA，通過實時熒光定量PCR方法檢測基因的相對表達量。分別以U6、β-actin為內參，每個樣品重復3次，采用2^-ΔΔCT法計算gga-miR-133a-3p及其靶基因的相對表達量，引物信息見表2。擴增體系（總體積為 10 μL）：上下游引物各0.5 μL，SYBR Green 5 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 3 μL；擴增程序：95 ℃預變性 3 min；95 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共39個循環。

1.4 數據分析

gga-miR-133a-3p及其預測靶基因的組織表達量數據均使用SPSS 24.0軟件進行單因素方差分析；試驗結果用平均值±標準差表示，最后將數據導入Graphpad Prim 9.0，繪制柱狀圖和折線圖。

2 結果與分析

2.1 gga-miR-133a-3p的結構與定位

gga-miR-133a-3p定位于雞20號染色體上基因LOC101747836內部；前體序列gga-miR-133a全長95 bp，其5′-UTR、3′-UTR分別加工生產2個成熟的miRNA，分別為gga-miR-133a-5p、gga-miR-133a-3p，并構成發夾結構（圖1）。

2.2 miR-133a-3p不同物種間序列比對分析

對15個物種的miR-133a-3p成熟體序列進行多序列比對分析，結果見圖2。各物種間miR-133a-3p成熟體序列基本相同，同源性極高，且序列長度基本相同，均為21～23 nt。其中21個堿基（即第2～22位堿基）高度保守，僅第1、23位的U堿基存在個別缺失。各物種的miR-133a-3p的種子序列（UGGUCCC）完全一致。

2.3 miR-133a-3p系統進化樹構建

利用MEGA 7.0 軟件對miR-133a-3p在雞、原鴿、鵪鶉、豬、牛、山羊、兔、小鼠、西洋鮭、鯉魚、眼鏡王蛇、猩猩、人、鴨嘴獸、斑馬魚這15個物種的前體序列進行比對分析，構建系統進化樹。結果（圖3）表明，miR-133a-3p在進化中保守性較高，成熟序列基本相同；雞與原鴿聚為一支，二者同為鳥類。

2.4 gga-miR-133a-3p靶基因預測

通過2個在線數據庫miRDB、TargetScan對 gga-miR-133a-3p的靶基因進行預測，分別預測到380、221個靶基因； 取2個預測結果的交集降低其假陽性，共得到145個共同靶基因（圖4）。

2.5 gga-miR-133a-3p靶基因的GO富集分析

對gga-miR-133a-3p的靶基因進行GO富集分析，分為BP（生物學過程）、CC（細胞組分）、MF（分子功能）3個部分，結果見圖5。在BP中，靶基因主要富集于mRNA代謝過程調控、細胞因子響應、酶活性調控、分子功能負調控、酶聯蛋白受體信號途徑等條目；在CC中，靶基因主要與內質網系統、高爾基氏體、細胞核、囊泡等的形成有關；關于MF，靶基因主要具有與肌球蛋白結合、酶活性等分子功能。

2.6 gga-miR-133a-3p靶基因的KEGG富集分析

對gga-miR-133a-3p的靶基因進行KEGG通路富集分析，結果如圖6所示。靶基因主要參與線粒體自噬、磷酸酰肌醇信號系統、肌動蛋白細胞骨架調控、mTOR、FoxO、p53、嘌呤代謝、泛酸和輔酶A生物合成等信號通路。肌肉發育相關信號通路及其靶基因見圖7。其中PIK3CB、NRAS是肌動蛋白細胞骨架、mTOR、FoxO 這3條信號通路的共同基因；EGFR是肌動蛋白細胞骨架、FoxO信號通路的共同基因；PRKAA1、IGF1R是mTOR、FoxO信號通路的共同基因。

2.7 gga-miR-133a-3p組織時間表達譜及靶基因初篩

gga-miR-133a-3p 的組織表達情況如圖8-A所示，在肝臟、肺臟、脾臟、腎臟中均未檢測到 gga-miR-133a-3p表達，僅在胸肌、腿肌、心臟中表達，且在胸肌中的表達量極顯著高于心臟、腿肌（Plt;0.01），在腿肌中的表達量極顯著高于心臟（Plt;0.01）。gga-miR-133a-3p 的時間表達情況如圖8-B所示，在羅斯308肉雞胸肌中，隨著周齡（W0～W6）的增長，miR-133a-3p表達量呈先升后降的規律，且在3周齡達到表達量峰值。對5個肌肉發育相關信號通路富集靶基因在不同生長階段胸肌中的表達規律進行檢測，結果如圖8-C所示。IGF1R的mRNA表達量隨著周齡的增長呈先降再升的規律，與miR-133a-3p表達量先升后降的規律相反，且它們的拐點均出現在3周齡。

3 討論

骨骼肌生長發育是一個復雜的生物學過程，受到眾多基因和信號通路的協同調控。本研究從miRNA分子角度，探究其在肌肉生長發育中的調控機制。miRNA是一類長約22 nt的小分子非編碼RNA，主要通過其種子區序列與靶基因的3′-UTR靶序列特異性識別結合形成沉默復合物，從而抑制靶基因翻譯^{［1，15-16］}。miR-133a-3p是肌源性miRNA-133家族中的一員，已在多個物種中被證實參與肌肉相關基因的表達^［6-11］。本研究通過qPCR檢測技術發現，gga-miR-133a-3p在羅斯308肉雞的腎臟、肺臟、脾臟、肝臟中均未被檢測到，而在胸肌、腿肌、心肌中高度表達，這說明gga-miR-133a-3p是一種肌肉特異性表達miRNA，這與Li等的研究結果^［12-14］一致。羅斯308肉雞屬于快大型肉雞，生長速度快，3～4周齡達到生長速度高峰期，第6周齡（W6）就可生長至2.5 kg的上市體重。在試驗中，我們發現miR-133a-3p表達量隨著羅斯308肉雞生長日齡的增長，呈先增后降再至平穩的規律，并且在3周齡的時候達到表達量的最高峰，出現拐點后表達量緩慢降低；這與羅斯308肉雞的生長曲線規律相吻合，也說明miR-133a-3p是維持肉雞肌肉生長發育的重要因子。賈富民等研究發現，gga-miR-133a-5p雖然也在骨骼肌中高表達，但在其他非肌肉組織中也檢測到表達，并沒有表現出和gga-miR-133a-3p一致的肌肉特異性；說明miR-133a-3p、miR-133a-5p雖然由同一個前體mir-133a加工生成，但其結構差異也導致功能上的差異^［17］。雞的胸肌主要由快肌纖維構成，心肌主要由慢肌纖維構成，腿肌由快肌纖維、慢肌纖維嵌合構成^［18］。gga-miR-133a-3p在胸肌中表達水平顯著高于心肌、腿肌，這表現出明顯的快肌纖維偏向性，推測其與快肌纖維的轉化密切相關。

miRNA的序列和結構決定其分子功能。通過對15個物種的miR-133a-3p序列進行比對，發現各物種的miR-133a-3p成熟體序列幾乎相同，沒有發現堿基突變，僅在第1、23位堿基處存在個別缺失，且種子區序列（UGGUCCC）完全相同。這說明miR-133a-3p在各物種中高度保守，并且具有相同的靶基因，在各物種中功能類似；這與劉芳君等的研究結論“miRNA 在不同物種中相對保守，具有相似的功能和調控機制” ^［19］相吻合。通過構建進化樹，我們發現雞與同為鳥類的原鴿聚為一支，符合物種進化規律。

識別篩選出 gga-miR-133a-3p 的靶基因是探索其功能及機制的關鍵。本研究利用miRDB、TargetScan 這2個在線平臺預測其靶基因，通過取其交集得到145個靶基因。通過GO分析，富集到肌球蛋白結合這一顯著條目；在KEGG分析中，得到肌動蛋白細胞骨架、FoxO、mTOR、p53等與肌肉相關的信號通路；這符合miR-133a-3p在肌肉組織中特異性表達的結果以及參與肌肉生長發育調控的預期。肌動蛋白細胞骨架調控信號通路影響細胞的信號轉導、細胞骨架的組裝與調節、肌肉生長與發育調控等多個方面，通路的異常與失活可能導致肌肉發育受到阻礙^［20］。p53信號通路主要通過其腫瘤抑制、調控細胞周期，影響肌肉細胞的生長、發育和適應性變化^［21］；同時p53信號通路參與調節肌肉細胞的能量代謝和氧化應激反應，保持細胞的穩態，進一步促進和保持肌肉的健康和功能^［22］。mTOR信號通路通過促進蛋白質合成、維持健康的代謝狀態、參與細胞增殖和分化、響應營養和激素刺激等方式，來促進肌肉的生長和發育^［23］。FoxO信號通路在骨骼肌生長發育中發揮著多方面的作用，包括調控細胞增殖與分化、纖維類型轉換、蛋白質合成與降解、代謝適應以及衰老與再生等過程，這些作用共同影響著骨骼肌的結構、功能和適應性反應^［24-25］。綜上，這些通路很可能是miR-133a-3p在肌肉生長發育中發揮功能的橋梁。

研究發現，PIK3CB、NRAS、EGFR、PRKAA1、IGF1R在肌動蛋白細胞骨架調控、mTOR、FoxO、p53等肌肉發育相關信號通路中顯著富集，推測它們可能是miR-133a-3p發揮肌肉生長發育相關調控作用的重要靶基因。結合相關文獻，PIK3CB編碼磷酸肌醇3激酶（PI3K）催化亞單位β亞型的一個亞型，屬于PI3K信號通路中一員，在肌肉損傷時表達顯著上調，并已證實通過IGF-I/PI3K通路促進小鼠損傷骨骼肌的修復和再生^［26］。N-Ras蛋白是NRAS基因編碼的產物，屬于RAS/MAPK信號通路的一部分，在肌肉細胞增殖和分化中起間接作用^［27］。EGFR編碼一種跨膜蛋白，即表皮生長因子受體（EGFR），屬于受體酪氨酸激酶（RTKs）家族，通過PI3K-AKT-mTOR途徑調控基因轉錄、細胞周期、蛋白質合成、細胞存活等過程，從而促進肌肉細胞的增殖和分化^［28］。PRKAA1基因作為AMPK的α1催化亞基，通過調節AMPK的活性，影響肌肉細胞的能量代謝、蛋白質合成和肌肉再生過程，從而間接影響肌肉的生長和發育^［29］。大量研究已證實，IGF1R是協調肌肉生長、增強肌肉修復、增加肌肉質量和力量的關鍵因素之一；miR-322通過靶向IGF1R加重地塞米松誘導小鼠肌肉萎縮^［30-31］。CircRILPL1通過結合miR-145激活IGF1R/PI3K/AKT通路促進牛肌肉增殖和分化^［32］。以上研究表明，PIK3CB、NRAS、EGFR、PRKAA1、IGF1R這5個基因在肌肉生長發育中發揮著重要作用。本研究對這5個靶基因在不同生長周齡羅斯308肉雞的胸肌組織中的表達量進行檢測，發現IGF1R的mRNA表達趨勢與gga-miR-133a-3p呈負相關，說明它很可能是miR-133a-3p發揮肌肉生長發育相關調控作用的重要靶基因，但其具體的分子調控機制還需通過靶標試驗及分子功能機制試驗作進一步的驗證。

4 結論

miR-133a-3p序列在各物種間較為保守，符合進化規律；靶基因富集分析結果表明，PIK3CB、NRAS、EGFR、PRKAA1、IGF1R在肌動蛋白細胞骨架調控、mTOR、FoxO、p53等肌肉發育相關信號通路中顯著富集；雞miR-133a-3p僅在心臟、胸肌、腿肌中有表達，在胸肌中表達量顯著高于心臟、腿肌，是肌肉組織特異性表達miRNA，隨著周齡的增長，miR-133a-3p在胸肌中的表達量呈先升后降再至平穩的規律，且在3周齡達到表達量峰值；IGF1R在胸肌中的mRNA表達量隨著周齡（W0～W6）的增長呈先降再升的規律，與miR-133a-3p表達量的變化規律相反，說明它很可能是miR-133a-3p發揮肌肉生長發育相關調控作用的重要靶基因。

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