木質素高效降解復合菌群構建及其降解效果

摘要：為構建一組高效降解木質素的復合菌群，并提高堆肥過程中辣椒秸稈內木質素的降解率。利用苯胺藍褪色試驗并測定菌株木質素降解酶（木質素過氧化物酶、錳過氧化物酶、漆酶）活性，從豬糞桑枝堆肥材料中篩選木質素降解菌株，以5株菌株為最小單位構建符合菌群。進行室內發酵試驗，以CK（自然發酵）為對照、設置7種接菌處理（接種量均為3%）即單一菌劑（CB12、CF53、CF30、CF18、CF5）、復合菌劑（CS1）、市售菌劑（EM），測定木質素和纖維素降解率。結果表明，豬糞桑枝堆肥材料中的Achromobacter CB12、Bacillus altitudinis CB38、Bjerkandera CF5、Trichoderma harziana CF18、Myrothecium CF30、Cladsporium CF53對木質素具有較高的降解效果。菌株CF5、CF18、CF30、CF53、CB12的組合（復合菌群CS1）對木質素的降解能力優于其他菌株組合。復合菌群CS1木質素過氧化物酶活性和對辣椒秸稈中木質素的降解率分別是7.99 U/L和40.33%，較單一菌株分別提高了1.71倍和1.51倍。可見，符合菌群CS1綜合表現良好，作為構建出的較優菌群，可有效提高堆肥時辣椒秸稈中木質素的降解效果，推進辣椒秸稈的肥料化。

關鍵詞：木質纖維素；堆肥；復合菌群；木質素降解；水解酶

中圖分類號：S182；S141.4" 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）24-0233-08

收稿日期：2023-12-16

基金項目：廣西重點研發計劃（編號：桂科AB22080097）；中國科學院鄉村振興項目（編號：KFJ-XCZX-202303）。

作者簡介：高付來（1999—），男，河南南陽人，碩士，主要從事甘蔗黑穗病的生物防治技術研究。E-mail：1079679996@qq.com。

通信作者：劉秋梅，博士，副研究員，主要從事微生物肥料研究，E-mail：liuqiumie@isa.ac.cn；夏世斌，博士，教授，主要從事生態修復及碳減排研究，E-mail：xiashibin@126.com。

我國作為農業大國，每年產生的農作物秸稈數量龐大。據統計，2021年我國秸稈產量約8億t，居世界首位且秸稈產量依然呈上升趨勢^［1-2］。秸稈中包含豐富的C、N、P等營養物質和微量元素，將其肥料化還田能減少化肥施用，從而實現秸稈的資源化^［3-5］。然而，秸稈中的木質纖維素降解效率較低，限制了其完全肥料化。木質纖維素主要由纖維素、半纖維素和木質素等組成，其中，木質素擁有緊密的碳水化合物結構，并以共價鍵的形式嵌入纖維素和半纖維素之間，形成了天然的物理屏障^［6］。這限制了纖維素和半纖維素的酶解，因此，提高木質素的降解效率是突破辣椒秸稈肥料化技術瓶頸的關鍵。

生物法降解木質素具有能耗小、無污染、成本低的特點，是近年來國內外研究的熱點^［7］。木質素降解菌的來源多為腐爛的樹葉和木材，其中白腐真菌、褐腐真菌和鏈霉菌是目前廣泛研究的菌種。白腐菌可以分泌漆酶和木質素過氧化物酶，選擇性破壞木質素單體間的醚鍵（C—O—C）和碳碳（C—C）鍵，以提高木質素的降解率^［8-9］，如Ceriporiopsis subvermispora、Dichomitus squalens和Phanerochaete chrysosporium。此外，Trametes versicolor和Fomes fomentarius等白腐菌對纖維素和半纖維素也有一定的降解作用^［10］。褐腐菌通過產生羥基自由基（·OH）氧化木質素和分泌胞外酶2種方式降解木質素^［11］。鏈霉菌能通過分泌漆酶和過氧化物酶破壞木質素中的羰基（CO）和甲氧基（—OCH3）^［12］。此外，部分類芽孢桿菌屬和木霉屬的微生物也具有一定的木質素降解能力^［13-14］。已發掘的微生物中，真菌的木質素降解能力通常強于細菌。但是，細菌具有繁殖快、環境耐受性強以及基因組小的優勢。多項研究表明，復合菌群具有更加完備的協同酶系統，對木質素的降解效率高于單一菌株^［15-18］。如，將2株芽孢桿菌復合后對木質素的降解效果有所提升；利用康寧木霉（Trichoderma koningiopsis）和黃孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）構建的復合菌劑對木質素和纖維素的降解能力優于單一菌株；將毛曲菌（Trametes hirsuta）S13和平菇菌（Pleurotus ostreatus）S18復合后，結木質素降解酶活力得到了提升，并且煙桿中木質素的降解率提高到了41.1%^［16-18］。因此，構建高效復合菌群是提高木質素生物降解率的有效途徑。在湖南省，辣椒作為重要的經濟作物，每年產生大量辣椒秸稈。然而，當前對木質素降解菌群的研究主要集中在玉米秸稈和小麥秸稈上，對辣椒秸稈的研究尚顯不足。此外，在現有的研究中，所使用的菌株大多并非來源于堆肥材料，這使得研究的實用性和針對性受到限制。

本研究以堿木質素為唯一碳源，采用褪色試驗和木質素降解酶活力檢測的方法，從豬糞堆肥樣品中分離篩選出具有木質素降解能力的菌株。通過形態學和分子生物學方法對這些菌株進行鑒定，并以木質素降解酶活力為篩選指標，構建了高效復合菌群CS1。通過室內發酵試驗，明確了該復合菌群對辣椒秸稈的降解效果，為辣椒秸稈的肥料化和資源化利用提供了理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株樣品來源

菌株來自腐熟期的堆肥試驗堆樣品（材料以豬糞桑枝為主），取各個部位均勻混合后采用四分法混合收集樣品。碳氮比為15.51、pH值為9.78、含水量為24.00%、總氮含量為22.09%、總碳含量為22.09%。辣椒秸稈和玉米秸稈來源于長沙附近農戶，粉碎后過20目篩備用。所有試驗均在中國科學院亞熱帶農業生態研究所（湖南省長沙市芙蓉區遠大二路644號）進行，試驗時間為2020年6月至2021年12月。

1.1.2 培養基

（1）馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）-苯胺藍培養基：馬鈴薯200.00 g/L、葡萄糖 20.00 g/L、瓊脂20.00 g/L、苯胺藍0.10 g/L，加入 1 L 蒸餾水，115 ℃滅菌30 min，用于真菌的初篩。

（2）LB-苯胺藍培養基：蛋白胨10.00 g/L、酵母膏5.00 g/L、NaCl 10.00 g/L、瓊脂20.00 g/L、苯胺藍0.10 g/L，加入1 L蒸餾水，115 ℃滅菌30 min，用于細菌的初篩。

（3）液態產酶培養基：堿木質素 2.00 g/L、K2HPO4 1.00 g/L、MgSO4·7H2O 0.10 g/L、CaCl2 0.08 g/L、FeSO4·7H2O 0.05 g/L、MnCl2 0.02 g/L、KH2PO4 1.00 g/L、蛋白胨2.00 g/L，用于檢測木質素降解菌的產酶能力。

1.2 試驗方法

1.2.1 木質素降解菌的篩選

（1）初篩：將單菌株接種于PDA-苯胺藍或LB-苯胺藍培養基，每種菌株設置3個平行樣本，在30 ℃恒溫、避光條件下進行培養。細菌樣本培養36 h后進行觀察，真菌樣本培養3 d后進行觀察，確認是否存在褪色圈^［17］。若存在褪色圈，以A值來判斷菌株降解木質素的能力，A值越大表明菌株的降解能力越強。A=D/d，其中d代表菌株直徑，D代表變色圈直徑。

（2）復篩：選取Agt;1的真菌和Agt;3的細菌作為樣本，接種在液態產酶培養基上，30 ℃下在180 r/min搖床中分別培養3 d、36 h，然后測定木質素降解酶活力。

1.2.2 酶活力測定

取發酵培養液在4 ℃、12 000 r/min 條件下離心10 min，取其上清液作為粗酶液。利用藜蘆醇（VA）氧化法分光光度法、2，2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）氧化法分光光度法和2，6-甲氧基苯酚（2，6-DMP）氧化法分光光度法，分別測定漆酶（Laccase，Lac）、錳過氧化物酶（Mn-dependent peroxidase，Mnp）、木質素過氧化物酶（Lignin Peroxidase，LiP）的活力。酶活性單位（U）分別為 1 min 氧化1 μmol VA、ABTS和2，6-DMP所需酶量^［19］。

1.2.3 木質素降解菌的鑒定

（1）形態學觀察：將菌株CB38、CB12、CF53、CF30、CF18、CF5分別接種在PDA培養基上，30 ℃恒溫避光條件下培養3 d，并觀察菌落形態特征。

（2）分子生物學鑒定：按照快速DNA提取試劑盒的說明提取菌株DNA。以提取的DNA為模板，利用真菌、細菌通用引物對菌株的18S rDNA或者16S rDNA序列進行PCR擴增。擴增后的產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，測序結果在NCBI網站上進行比對，并基于比對結果構建Neighbor-joining系統發育樹。

（3）引物序列如下：真菌18S rDNA引物序列為ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）；細菌16S rDNA引物序列為27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′）。PCR反應程序：97 ℃預變性3 min；97 ℃ 變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，循環30次；72 ℃終末延伸10 min。

1.2.3 高效降解木質素復合菌群的構建

將互不拮抗的單菌株懸液以等體積隨機配對的方式混合，然后按3%接種量接入堿木質素液體培養基。在 30 ℃ 恒溫、避光條件下培養，每12 h取1次樣，連續收集7 d并測定木質素降解酶活性。

采用單因素試驗對復合菌群的產酶條件進行優化，初始pH值設置為7，接種量設置為3%，培養溫度設置為 30 ℃。采用控制變量法，在單一條件下分別考察初始pH值（4、5、6、7、8、9）、接菌量（1%、3%、5%、7%、9%）對于復合菌群木質素降解酶（錳過氧化物酶、過氧化物酶、漆酶酶）活性的影響。根據復合菌群的動態變化曲線，在培養第6天時進行取樣測定。

1.2.4 室內發酵試驗

設置不接菌（C）、單一菌劑（CB12、CF53、CF30、CF18、CF5）、復合菌劑（CS1）、市售菌劑（EM）共8個處理，進行為期28 d的室內發酵試驗。辣椒秸稈和玉米秸稈按照2 ∶1的比例作為發酵材料，調節含水量至55%～65%。每個處理組稱取30 g混勻后的材料置于500 mL錐形瓶中，115 ℃滅菌30 min，烘干后按照處理組分別接種3%的菌液。接種后，用紗布包裹瓶口，在 30 ℃ 下避光培養28 d。

試驗前和結束時，利用范氏（Van Soest）洗滌分析法測定辣椒秸稈的木質素、纖維素含量，并計算降解率。同時，利用掃描電子顯微鏡觀察試驗結束時秸稈的結構。

1.3 統計分析

使用IBM SPSS Statistics 26軟件進行統計分析，采用Duncans新復極差法進行多重比較。運用Origin 2018軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 木質素降解菌的產酶能力

經過苯胺藍培養基培養，篩選了具有木質素降解能力的11株真菌和7株細菌（表1）。酶活性測定結果表明，18株菌株的木質素降解酶活性存在顯著差異。其中，菌株CB38、CB12、CF30的Lip活性顯著高于其他菌株，分別為8.41、6.59、6.32 U/L。菌株CF18、CB12、CF30的Mnp活性均顯著高于其他菌株，分別為1.08、0.97、0.95 U/L。另外，菌株CF18和CF5的Lac活力顯著高于其他菌株，分別為10.20、10.04 U/L（圖1）。經過比較，篩選出6株具有較高木質素降解酶活性的菌株，分別為CB38、CB12、CF53、CF30、CF18、CF5。

2.2 木質素降解菌的鑒定

這6株菌株具有各自獨特的形態特征（圖2-a）和分子水平（圖2-b）。菌株CB38在培養基上呈現米黃色不透明鋸齒狀的圓形菌落，其序列與Bacillus altitudinis（高地芽孢桿菌）具有高達99%的同源性。菌株CB12與Achromobacter（無色桿菌屬）的同源性超過99%，在培養基上呈現米黃色透明整齊的圓形菌落。菌株CF53生長緩慢，表面無菌絲，孢子為綠色，其序列與Cladsporium sp.（枝孢霉屬）具有99%的同源性。菌株CF30具有白色棉絮狀菌絲，邊緣呈現波紋狀，其序列與Myrothecium（漆斑菌屬）的同源性超過97%。菌株CF18的菌落呈圓形，菌絲生長較為稀疏、顏色為米色，產綠色孢子，其序列與Trichoderma harzianum（哈茨木霉菌）的同源性為97%以上。而菌株CF5的菌落為毛茸茸的白色網狀圓形狀態，不產孢子，其序列與Bjerkandera（煙管菌屬）具有98%以上的同源性。

2.3 最優木質素降解菌群的確定

2.3.1 復合菌群的組成 表2中數據顯示，篩選出的木質素降解菌株之間不存在拮抗關系。因此，根據最小復合菌群體系的構建方法 將這6種菌株進行隨機組合^［20］。共組成6組復合菌群，編號分別為CS1、CS2、CS3、CS4、CS5、CS6（表3）。

2.3.2 復合菌群的產酶能力

不同菌群木質素降解酶活性變化趨勢相同，所有菌群Lip和Mnp活性都呈現先降低后升高再降低的趨勢，而Lac活性整體呈現先升高后降低的趨勢。此外，所有菌群木質素降解酶活性均在第6天達到峰值（圖3）。

取菌群最佳酶活性值點，與單一菌株最高酶活性值作為對照進行比較。結果表明，6組復合菌群的Mnp最佳活性值均低于Lip和Lac。其中，菌群CS1的Lip和Lac最佳酶活性值顯著高于其他復合菌群，分別為7.99、8.74 U/L，較單一菌株分別提高了56.52%、35.15%，其中CS1的Lip活性是單一菌株的1.71倍。然而，復合菌群CS2、CS3、CS4、CS5的木質素降解酶活性值反而低于單一菌株（圖4）。以上結果表明，菌群CS1具有較高的木質素降解酶活性，而其他復合菌群的酶活性并不理想。因此，后續研究將僅針對構成菌群CS1的單一菌株以及菌群CS1進行辣椒秸稈降解效果探究。

2.3.3 產酶條件優化

菌群CS1的木質素降解酶活性受培養條件影響（圖5）。隨著pH值的升高，菌群CS1的木質素降解酶活性先升高后下降，在初始pH值為7時木質素降解酶活性達到最高，其Mnp、Lip、Lac的活性分別為0.95、6.42、8.27 U/L。這表明偏酸或偏堿的條件對于菌群CS1的酶活性影響較大（圖5-b）。

另外，在接種量大于3%后，菌群CS1的木質素降解酶活性出現了顯著降低的情況。在接種量為3%時，菌群CS1的Mnp、Lip、Lac活性分別達到了1.24、8.82、9.09 U/L（圖5-a）。

2.4 最優菌群CS1的辣椒秸稈降解效果

在對照組、單一菌劑處理和復合菌劑處理間，辣椒秸稈中木質素的降解效果存在顯著差異（圖6）。對照組辣椒秸稈中木質素的降解率僅為4.4%。在單一菌劑處理組中，木質素降解率由大到小依次是CF5、CF30、CF18、CF53、CB12，分別為26.8%、24.6%、23.2%、18.9%、13.9%，顯著高于對照組（Plt;0.05）。這一結果表明，單一菌株對辣椒秸稈中木質素的降解具有促進作用。菌群CS1處理后辣椒秸稈中木質素的降解率為40.33%，是菌株CF5的1.51倍，顯著高于其他處理（Plt;0.05）。與單菌株相比，菌群CS1對木質素的降解率提高了13.57%，同時對纖維素的降解率也有所提高。與市售菌劑相比，菌群CS1的木質素降解率提高了15.97%，纖維素降解率降低了7.5%。這一結果表明菌群CS1在促進辣椒秸稈中木質素降解方面的效果顯著，且優于市售菌劑。

在電子顯微鏡觀察下，對照組、菌群CS1處理組、EM菌劑處理組的辣椒秸稈表面結構存在顯著差異（圖7）。在對照組中，辣椒秸稈表面平坦光滑，木質素以平行的方式緊密排列。而在菌群EM處理組中，辣椒秸稈表面呈現疏松狀態，內部存在碎片化跡象，部分木質素已發生降解。而在菌群CS1處理組中，辣椒秸稈表面存在微生物定殖的情況，木質素被大量破壞，產生了大范圍的空腔。經過EM菌劑和復合菌群CS1處理后，均能破壞木質素形成的天然屏障，使易降解的物質暴露出來，進而促進辣椒秸稈的發酵。

3 討論與結論

在好氧堆肥過程中，存在大量能夠降解木質素的微生物，且與白腐菌、褐腐菌等常見木質素降解菌相比，能更好地適應辣椒秸稈肥料化過程中多變的環境條件。微生物主要通過胞外酶來降解木質素，其降解能力與酶活性呈正相關關系^［21-23］。因此，通過測量酶活性，可以反映出微生物的分解能力。本研究發現，Trichoderma harzianum（哈茨木霉）CF18和Bjerkandera（煙管菌）CF5是堆肥過程中降解木質素能力最強的菌株，主要通過分泌Lac來降解木質素。同時，土壤中的哈茨木霉菌也具有產Lac能力和較強的木質素降解能力^［14］。而在汪文強等的試驗中煙管菌主要通過分泌Mnp降解木質素，這可能與菌株產酶時的生存環境有關^［24］。此外，本研究發現Bacillus altitudinis CB38（高地芽孢桿菌）具有較高的Lip酶活性。但是，Bacillus altitudinis CB38參與構成的復合菌群木質素降解酶活性降低，與前人的結果存在一定差異^［25］。這可能是因為部分菌株的代謝產物抑制了木質素降解酶活性，后續可以通過代謝組學的手段，研究菌株代謝產物對木質素降解酶生成過程的影響^［26］。16S rDNA測序結果表明，無色桿菌是腐爛木材木質素降解菌群的主要優勢菌屬之一^［27］，本研究的結果與之相符。最后，本研究還在堆肥中發現了Myrothecium（漆斑菌）CF30和Cladsporium（枝孢霉菌）CF53這2種具備較強木質素降解能力的菌種。特別是Cladsporium CF53，它還具備降解纖維素的能力，這與前人的研究結果^［28-29］一致。

本研究構建了6種復合菌群，其中復合菌群CS1是本研究構建的最優菌群，包含1種細菌（Achromobacter CB12）和4種真菌（Bjerkandera CF5、Trichoderma harzianum CF18、Myrothecium CF30、Cladsporium CF53）。所有菌群的木質素降解酶活性都在第6天左右達到峰值，與前人的研究展現了相似的趨勢^［29］。pH值和溶氧量是菌株酶活性出現峰值的重要因素，木質素降解前期產生了NH3導致pH值升高并逐漸達到菌株最佳生長條件，這一過程中菌株產酶能力隨之上升，而隨后菌株數量的增長引起了培養液中溶氧量和營養物質的減少從而導致酶活性降低^［30］。在單因素試驗中 也發現pH值會對復合菌群的木質素降解酶活性造成較大影響，這可能與菌群自身的最佳生長條件有關。同時，所有菌群Mnp活性較低，可能是因為以堿木質素為碳源的液態產酶培養基和生長條件使得菌株更偏向于產Lip和Lac^［30］。本研究中菌群CS1的木質素降解酶活性是單一菌株的1.2倍，但其他菌群的木質素降解酶活性反而低于單菌株。可能是因為組合菌群的次生代謝產物存在差異，部分次生代謝會抑制酶活性，從而導致了這一結果的產生^［25］。

本研究結果表明，無論是單菌株還是復合菌群，均具有降解辣椒秸稈的能力。其中，復合菌群CS1的降解效果比單一菌株高出1.51倍，這進一步驗證了不同菌種之間酶系互補、相互促進的重要性^［31］。這種優勢使得復合菌群在辣椒秸稈發酵和肥料化過程中更具效率。然而，本研究中菌株的木質素降解酶活性較低，初步的單因素試驗表明，初始培養條件可能是導致這一結果的關鍵因素。此外，本研究還觀察到菌群CS1能在辣椒秸稈表面形成生物膜，這有助于破壞辣椒秸稈的細胞壁，增加其表面空隙，從而增大菌株與木質素、纖維素等物質的接觸面積。復合菌群CS1主要通過產生Lip和Lac來氧化木質素中的酚類物質和非酚類物質間的化學鍵，破壞木質素組成的天然屏障，進一步促進纖維素的降解，進而提高辣椒秸稈的發酵過程和肥料化效果。

由于不同秸稈中木質素的結構和致密性存在差異，導致秸稈的降解效果存在一定的差異。因此，本研究中菌群對辣椒秸稈的降解效果與梅新蘭等的結果^［32］存在一定差異。在木質素降解過程中，細菌和真菌具有專化性。與市面在售的菌劑EM相比，復合菌群CS1對木質素的降解率提高了16%，但纖維素的降解效果不如市售菌劑。這表明復合菌群CS1對木質素具有一定的選擇性。

本研究結果表明，從腐熟期堆肥材料中篩選了木質素降解菌株：無色桿菌CB12、芽孢桿菌CB38、煙管菌CF5、哈茨木霉CF18、漆斑菌CF30以及枝孢霉菌CF53。基于這些菌株，構建了復合菌群CS1。復合菌群CS1的構建能顯著提升木質素降解酶的活性，并進一步提高辣椒秸稈的降解效率。

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