水稻秸稈腐熟過程中理化性質及微生物群落變化

摘要：為進一步揭示秸稈腐熟過程中微生物群落的結構變化和理化性質變化的關系，對秸稈進行腐熟處理，對其不同時間的理化性質和微生物多樣性進行分析。理化性質檢測結果如下：在整個腐熟過程當中，秸稈中纖維素逐漸暴露，溫度先上升后下降。pH值先下降后上升，E4/E6值在20 d時最低，30 d時最高，總碳含量和總氮含量一直處于下降趨勢，秸稈中的碳氮比整體上處于上升趨勢。生物可降解指數先上升至4.102后下降至3.840。電導率在40 d時上升至0.67 mS/cm。秸稈腐熟處于10 d和30 d時漆酶活性較高，分別達到0.96、0.98 U/mL。秸稈腐熟處于 40 d 時纖維素酶活性達到了0.04 U/mL。秸稈腐熟處于30 d時木聚糖酶活性達到了0.08 U/mL。苯基桿菌屬（Phenylobacterium）的出現伴隨著木聚糖酶活性增加，曲霉屬（Aspergillus）豐度的變化與漆酶活性變化相似。功能預測結果表明，微生物群落包含纖維素、木質素、尿素、芳香化合物降解功能。微生物群落與環境因子的相關性分析解釋了環境因子對于樣本中物種組成的影響。本研究明確了秸稈腐熟中理化性狀及發酵垛中微生物多樣性的改變，并為以秸稈腐熟相關酶活性為指標篩選秸稈降解菌株提供理論依據。

關鍵詞：水稻秸稈腐熟；理化性狀；微生物多樣性；功能預測；高通量測序

中圖分類號：S5141.4；S182" 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）24-0241-08

收稿日期：2023-12-18

基金項目：國家自然科學基金（編號：31671796）。

作者簡介：姜子豪（1999—），男，黑龍江哈爾濱人，碩士研究生，主要從事發酵工程研究。E-mail：920856119@qq.com。

通信作者：俞志敏，博士，副教授，主要從事啤酒釀造微生物、微生物代謝工程、糖生物學研究。E-mail：yuzhimin2005@163.com。

我國為農業大國，秸稈產量巨大，秸稈作為農作物的副產品，富含大量的有機物質以及礦物質。大部分秸稈都被焚燒或者棄置處理，不僅會對環境造成污染，還會對這部分資源造成極大的浪費。因此，如何綠色利用這種生物資源，是我國農業可持續發展面臨的問題。

目前，我國的秸稈資源主要采用堆肥技術使其變廢為寶，秸稈經過發酵，其中的有機物質被降解，一部分轉化成可被微生物利用的營養物質，一部分轉化成腐殖質增加土壤肥力。已有研究表明，在堆肥過程中，微生物的一系列生命代謝活動在秸稈降解過程中起到關鍵作用^［1］。其中微生物在不同腐熟時期所產生的酶是秸稈腐熟的重要因素，目前已有研究表明，秸稈腐熟過程中主要為纖維素酶、半纖維素酶和木質素降解酶共同協作產生效果，許多研究者利用菌株是否產纖維素酶為指標篩選出產纖維素酶且酶活性較高的菌株作為秸稈腐熟的功能菌，將其加入到秸稈中加快腐熟進程，提高腐熟質量，目前，已被多數人認可。目前，發現的能夠降解纖維素的細菌主要有芽孢桿菌屬（Bacillus）、纖維單胞菌屬（Cellulomonas）和纖維弧菌屬（Cellvibrio）等^［2］。向腐熟過程中接種某些微生物以增強微生物的腐熟作用會使腐熟更高效或獲得更好的腐熟效果^［3］。王靖然等在蘑菇渣中以產纖維素酶和秸稈降解能力強為指標進行篩選，篩選出1株能在低溫條件下具有降解秸稈能力的菌株mgz-5^［4］。可降解纖維素的真菌，包括根霉屬（Rhizopus）、青霉屬（Penicillium）、曲霉屬（Aspergillus）和木霉屬（Trichoderma）等。周海賓等研究發現，與自然腐熟相比，在秸稈堆肥開始階段接種3%的黑曲霉，纖維素的降解率可提升1.36倍，表明黑曲霉在秸稈腐熟過程中加快了纖維素的降解^［5］。最新研究中發現，多種微生物具有較高的纖維素酶活性，可以促進秸稈腐熟，但菌株的功能表現出不穩定性且多為單一菌株^［1-5］。

為探究不同時期理化性質的變化與微生物群落變化的關系，本研究以秸稈為材料，對秸稈腐熟過程中的溫度、腐熟指標、酶活性與微生物多樣性進行測定，通過分析理化性質與微生物多樣性之間的關系，揭示微生物在秸稈腐熟中的作用以及在這一過程中的生物降解機制。目前，大多數文獻多以產纖維素酶的菌株為主要研究方向，產半纖維素、木質素降解相關酶的菌株鮮有人報道，本研究能夠為以產纖維素酶、漆酶、木聚糖酶為指標篩選高效降解秸稈菌株的相關研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

水稻秸稈取自莊河農場。

1.2 試驗試劑

苯酚、硫酸、羧甲基纖維素鈉、氫氧化鈉、乙酸、乙酸鈉、葡萄糖、酒石酸鉀鈉、3，5-二硝基水楊酸、亞硫酸氫鈉、木糖、酒石酸、酒石酸鈉、過氧化氫、硫酸汞、重鉻酸鉀、硼酸、鹽酸、甲基紅、溴甲酚藍、乙醇，均購自天津市大茂化學試劑廠。藜蘆醇、木聚糖、ABTS，均購自阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.3 試驗儀器

小容量全溫振蕩培養箱（ZQZY-78C，知楚，上海）；電熱鼓風干燥箱；紫外分光光度計（UV 5200，元析，上海）；可見光分光光度計（722S，精密，上海）；凱氏定氮儀（KDN816，纖檢，上海）；消化爐（NYP308，纖檢，上海）；pH計（PHS-3C，雷磁，上海）；熱場發射掃描電子顯微鏡（JSM-7800F，日本電子，日本）；蒸汽滅菌器（SX-500，TOMY，日本）。

1.4 試驗設計

對收割后的秸稈進行浸水處理，調整其含水量至60%～70%，進行堆垛（高50～70 cm），秸稈自然腐熟。秸稈腐熟時間為40 d，在秸稈腐熟進行20 d時進行翻垛處理并適量補充水分（試驗于2023年7月10日至8月29日進行，試驗地點為大連工業大學生物催化技術國家地方聯合實驗室）。

秸稈腐熟過程中，采取五點取樣法，每隔10 d取發酵堆體頂部向下10 cm處秸稈，用于進行擴增子測序分析的樣本于-80 ℃密封保存，40 d后統一送樣測序；用于進行理化性質測定的試驗樣本，分為2個部分，一部分放入自封袋中4 ℃干燥避光保存，用于測定波長465 nm處吸光度/波長 665 nm 處吸光度（E4/E6）、pH值、電導率（EC）、可溶性糖含量、酶活性，另一部分自然風干后進行粉碎，過120目篩，4 ℃干燥避光保存，用于測定全氮含量、總有機碳含量和使用熱發射場掃描電鏡測定秸稈表面特征。

1.5 試驗方法

1.5.1 理化性質的測定

從自封袋中稱取10 g樣品放入錐形瓶中并加入100 mL蒸餾水，將錐形瓶放入搖床中，200 r/min振蕩30 min，將錐形瓶中混合物于8 000 r/min離心5 min后使用0.45 μm濾膜進行抽濾，濾液存放于50 mL離心管中4 ℃保存，用于測量pH值、E4/E6值、電導率、可溶性糖含量、酶活性。

溫度：每10 d采用五點取樣法對發酵垛進行測溫，每個取樣點由深至淺每5 cm進行1次測溫并記錄，并測定和記錄環境溫度。

pH值：用pH計測定濾液pH值并記錄數據。

E4/E6值：將濾液加入到比色皿中用可見光分光光度計測量波長465 nm處的吸光度（E4）和波長665 nm處的吸光度（E6），計算E4/E6值。

電導率：用電導率筆測定濾液的電導率并記錄數據。

可溶性糖（SC）含量：稱取10 g樣品放入錐形瓶中并加入80 ℃的蒸餾水100 mL，提取樣品中的可溶性糖，充分浸提30 min后進行抽濾，取一部分濾液使用苯酚硫酸法測定可溶性糖含量^［6］。

酶活性：纖維素酶的活性采用NY/T 912—2020《飼料添加劑纖維素酶活力的測定 分光光度法》^［7］測定；木聚糖酶的活性采用DB13/T 1090—2009《飼料用酶制劑中木聚糖酶活力的測定——分光光度法》^［8］測定；漆酶的活性采用ABTS法^［9］測定。

總氮含量：稱取0.5 g粉碎后的樣品于消化管中，加入0.4 g CuSO4和6 g K2SO4，以不加樣品為空白對照進行消化，消化后使用全自動凱氏定氮儀測定全氮含量。

總碳含量：參考土壤學大辭典^［10］測定。

總有機碳（TOC）含量：使用HJ 615—2011《土壤 有機碳的測定 重鉻酸鉀氧化-分光光度法》^［11］測定。

生物可降解指數（BI）取決于堆肥中總有機碳含量、可溶性糖含量以及堆肥天數。將總有機碳含量、可溶性糖含量以及堆肥天數（t）代入公式（1）計算BI。

BI=3.166+0.039TOC+0.832SC-0.011t。（1）

形態變化：稱取0.5 g粉碎后的樣品，使用掃描電鏡每隔10 d觀察其形態。

1.5.2 高通量測序

采用高通量測序方法對樣品中微生物的多樣性進行測定，基因組的提取和測序工作由上海天昊生物科技有限公司完成。

1.6 數據處理

本研究所有試驗均進行至少3次重復，數據以平均值±標準差的形式呈現，本研究使用Microsoft Excel 2016進行數據統計，使用SPSS 16進行差異顯著性分析（α=0.05），用Origin 2022進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 秸稈腐熟過程中的溫度變化

由圖1可知，在整個腐熟過程當中，環境最高溫度為28 ℃，最低溫度為17.7 ℃。發酵垛內最高溫度為37.1 ℃，最低溫度為21 ℃，整個腐熟過程中，溫度先上升后下降，于30 d時達到腐熟最高溫。

2.2 秸稈腐熟過程中的理化性質變化

2.2.1 pH值、E4/E6、總碳含量、總氮含量、碳氮比、生物可降解指數、電導率變化

堆肥過程中不同時期的pH值、E4/E6、總碳含量、總氮含量、碳氮比、生物可降解指數、電導率的動態變化見表1。可以看出，隨著秸稈腐熟過程的進行，發酵垛pH值呈先下降后上升再下降的趨勢，0～20 d，pH值先從7.14降低至6.82，后上升至7.51。秸稈腐熟初期pH值下降可能與有機質的不完全降解和氨揮發有關，隨后，垛內微生物利用秸稈中含氮有機物產生NH3，使堆體pH值緩慢上升至微堿性^［12-13］。

E4/E6值在30 d時達到最高值11.56，而后下降至7.64。秸稈經過微生物降解后產生的一種親水酸性物質被稱為腐殖酸。它在秸稈腐熟產物有機質中扮演著重要的角色。腐殖酸被認為是一種復雜的混合物，由具有相似性質和芳香結構的酸性物質組成。腐殖酸分子含有多種活性官能團。從腐熟秸稈中浸提腐殖酸，通過測定浸提液中的 E4/E6 值可以用來評價腐殖酸分子中芳香環的芳構化程度、分子量和縮合程度等特性。浸提液中的 E4/E6 值越高則反映出秸稈腐熟物中腐殖酸聚合度越低，而E4/E6值越低則反映出腐殖酸聚合度越高。本試驗中E4/E6值在20～40 d時上升后下降可能是翻垛所致，2次下降趨勢表明腐殖酸單體聚合。

秸稈中的總碳含量一直下降，最終下降到48.61%。秸稈中的碳源被微生物所利用導致總碳含量降低。秸稈中的總氮含量也一直下降，最終下降到1.60%。由于氨氣的揮發，導致總氮含量降低。隨著腐熟的進行，秸稈中的碳氮比上升至30.381。碳氮比對微生物的生長代謝起著重要作用。在生物質發酵過程中，碳源和氮源被微生物所利用生成CO2、NH3、硝酸鹽、亞硝酸鹽以及腐殖質。因此，在生物質腐熟過程中，碳和氮的變化往往伴隨著微生物群落的變化，總碳含量和總氮含量均呈下降趨勢，由于微生物利用碳源和氮源的速率不同而導致碳氮比在腐熟過程中總體處于一個上升趨勢，所以每個腐熟階段的特征可以用碳氮比表示。腐熟堆肥理論上講應趨于微生物菌體的碳氮比。

秸稈中的生物可降解指數先上升至4.102后下降至3.840。生物可降解指數是由堆體中的總有機碳含量、可溶性糖含量和堆體發酵天數綜合評價的腐熟指標。生物可降解指數可以評價秸稈是否腐熟，有研究表明，生物可降解指數在2.9以上時秸稈未腐熟，腐熟的秸稈生物可降解指數在2以下^［14］。

濾液的電導率呈先上升后下降最后上升的趨勢，40 d時上升至0.67 mS/cm。電導率可代表秸稈腐熟過程中垛體內固體所含可溶性鹽的量，是評價秸稈腐熟產物進行堆肥是否會對植物產生毒害的一個重要指標，在一定程度上反映堆肥對植物的毒性以及對植物的生長抑制作用，電導率過大，堆料作為有機肥施用可能對土壤微生物活性產生不利影響，最終抑制作物生長。電導率的下降可能是因為微生物生長消耗堆料中的可溶性鹽，發酵中期電導率上升可能是因為微生物活動過程中降解有機質產生更多的可溶性鹽^［15-18］。

2.2.2 秸稈腐熟過程中漆酶、纖維素酶、木聚糖酶活性的變化

堆肥過程中不同時期酶活性的動態變化如圖2、圖3、圖4所示。秸稈腐熟處于10、30 d時漆酶活性較高，分別達到0.96、0.98 U/mL。秸稈腐熟處于40 d時纖維素酶活性達到了最高值 0.04 U/mL。秸稈腐熟處于30 d時木聚糖酶活性達到了0.08 U/mL。作物秸稈主要由3種物質組成，即纖維素、半纖維素和木質素，占秸稈干重的80%以上，包含10%～25%木質素、20%～30%半纖維素和40%～50%纖維素，是植物細胞壁結構的主要成分。纖維素酶主要包括內切葡聚糖酶（EG）、外切葡聚糖酶（CBH）、β-葡糖苷酶（BG），3種酶協同作用將纖維素分解為葡萄糖單體。半纖維素相對于纖維素，其聚合度小得多，可反應的官能團多，所以容易降解，主要通過β-1，4-外切木聚糖酶、β-1，4-內切木聚糖酶和β-木糖苷酶的協同作用降解。木聚糖則被β-1，4-外切木聚糖酶和β-1，4-內切木聚糖酶切割為聚合度較低的多糖，然后再被 β-木糖苷酶徹底降解。木質素降解酶主要包括以血紅素糖蛋白為主的過氧化氫酶、錳過氧化物酶及以多酚氧化物為主的漆酶^［19-23］。

2.3 秸稈腐熟過程中的形態變化

使用熱發射場掃描電鏡對不同時間的秸稈腐熟物樣品進行觀察，秸稈腐熟過程中的形態變化如圖5所示。0 d的秸稈中含有的木質素、纖維素被包含在蠟質層中，蠟質層表面光滑致密未被破壞；10 d的秸稈表面蠟質層開始分解，與0 d相比，秸稈表面出現微生物覆蓋；進入20 d后，秸稈的表面蠟質層被破壞，被蓋住的纖維逐漸顯露出來；秸稈腐熟過程進入30 d時，秸稈中表面結構部分被破壞，出現殘缺，纖維素較多裸露出來；對腐熟40 d的秸稈觀察的結果顯示，秸稈結構明顯變得破碎。

2.4 秸稈腐熟過程中微生物群落分析

2.4.1 腐熟過程中細菌多樣性分析

稀釋度曲線如圖6-a所示，可以看出，測序數據合理。由圖 6-b 可知，有22種細菌在整個腐熟過程中都存在，在0、10、20、30、40 d時，特有的細菌物種分別為398、487、1 016、525、694種。所有細菌物種在屬水平上的物種組成柱狀圖如圖6-c所示。可以看出，0 d時假單胞菌屬（Pseudomonas）和鞘脂桿菌屬（Sphingobacterium）的相對豐度較高，經歷腐熟過程后，它們的相對豐度逐漸降低。10 d時出現寡養單胞菌屬（Stenotrophomonas）、假黃色單胞菌屬（Pseudoxanthomonas），研究表明，假黃色單胞菌屬具有降解木質纖維素的途徑；20 d時Ohtaekwangia為優勢菌種；30 d出現噬幾丁質菌屬（Chitinophaga）。研究表明，Ohtaekwangia和噬幾丁質菌屬可抑制真菌生長，導致發酵垛內真菌微生物量降低^［24-25］。40 d 時根瘤菌屬（Rhizobium）、小單胞菌屬（Micromonospra）的豐度上升，苯基桿菌屬（Phenylobaterium）的出現伴隨著木聚酶活性增加。

2.4.2 腐熟過程中真菌多樣性分析

由圖7-a可知，稀釋度曲線逐漸平穩，確定了測序數據可用。由圖7-b可知，共檢測到19種真菌在整個腐熟過程中都存在，0、10、20、30、40 d檢測到特有的真菌菌種分別為127、105、88、216、103種。對秸稈腐熟的各個時期的真菌多樣性進行監測（圖7-c），0 d主要以紅酵母屬（Rhodotorula）和Papiliotrema為優勢菌屬；10 d的優勢菌屬為曲霉屬（Aspergillus）、鐮刀菌屬（Fusarium）和墨頭菌屬（Coprinopsis），曲霉素豐度變化與漆酶活性變化相似，研究表明，Fusarium在秸稈腐熟過程中可產生相關酶系加速秸稈腐熟過程；20 d出現絲葚霉屬（Papulaspora）；30 d時，Iodophanus為優勢菌屬；40 d時，Ovatospora為優勢菌屬^［26］。

2.4.3 功能預測分析

由圖8和圖9可知，秸稈腐熟過程中的微生物與化學異養、需氧異養、硝酸鹽還原相關，隨著腐熟過程的進行，微生物纖維素、木質素、芳香化合物降解功能豐度增加，可能是由于假黃色單胞菌屬、曲霉屬菌株豐度增加導致。

2.4.4 微生物多樣性與環境因子關聯性分析

由圖10可知，10、20、30、40 d的微生物群落與環境因子的相關性較大，說明10、20、30、40 d發酵垛中的細菌組成受溫度、pH值、E4/E6、生物可降解指數、漆酶活性、纖維素酶活性、木聚糖酶活性、總碳含量、碳氮比、可溶性糖含量的影響。變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）豐度變化與pH值、E4/E6、漆酶活性、生物可降解指數呈正相關關系，浮霉菌門（Planctomycetes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、綠彎菌門（Chloroflexi）豐度變化與木聚糖酶活性、碳氮比、溫度和纖維素酶活性呈正相關關系。研究表明，Actinobacteria的豐度增加，能夠產生纖維素酶從而促進秸稈降解。盡管這些細菌在發酵垛內豐度不高，但這些門水平的細菌豐度變化能夠影響發酵垛內理化性質的變化。由圖11可知，20、30、40 d的微生物群落與環境因子的相關性較大，說明20、30、40 d發酵垛中的細菌組成受溫度、pH值、E4/E6、生物可降解指數、漆酶活性、纖維素酶活性、木聚糖酶活性、總碳含量、碳氮比的影響。子囊菌門（Ascomycota）豐度變化與漆酶活性、木聚糖酶活性、溫度、生物可降解指數、碳氮比和纖維素酶活性呈正相關關系，研究表明，垛體內銨態氮的含量會影響Ascomycota豐度變化^［27］。

3 結論與討論

降解秸稈的核心在于篩選出能高效降解木質纖維素的微生物，并在最佳環境下培養，使其成為優勢菌群，產生大量相關酶系，共同完成秸稈降解。研究顯示，真菌在降解木質素方面優于細菌和放線菌，但高溫發酵可能降低其酶活性。因此，篩選出能穩定降解木質素且適應高溫的菌種，有助于提高纖維素降解效果。王秀紅等對玉米秸稈垛式堆肥不同翻堆時期的細菌菌群進行分析發現，嗜熱脲芽孢桿菌屬、高溫單胞菌屬和芽孢桿菌屬在發酵前期豐度較高，而梭狀芽孢桿菌屬（Clostridium）、Chryseolinea和假單胞菌屬在發酵后期豐度較高。在秸稈腐熟的不同階段，優勢功能微生物的種類和功能呈現多樣性。因此，通過應用高通量測序技術，可以明確堆肥在不同腐熟時期優勢菌群的變化。這對于未來優化菌劑組合、提高腐熟效率具有關鍵意義^［28-30］。

本研究表明，在秸稈發酵過程中，一些豐度較高的菌屬對秸稈腐熟過程沒有貢獻，而一些豐度較低的菌屬如Pseudoxanthomonas、Aspergillus、Actinobacteria可以通過產酶降解秸稈，推動秸稈腐熟進程。功能預測結果表明，微生物群落包含纖維素分解功能、木質素分解功能、芳香化合物降解功能、尿素分解功能，與其相關的菌群可能產生纖維素酶、漆酶、木聚糖酶，并可能對腐熟過程中碳氮比有影響，可加快腐熟進程。本研究可為以纖維素酶、漆酶、木聚糖酶為指標篩選能夠高效降解秸稈的菌株提供理論依據。

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