基于16S rRNA基因測序法分析勃起功能障礙患者口腔微生物多樣性

周偉 朱璋龍 王婉悅 周晶 胡貴瑤 劉瑤 丁維

1貴州中醫藥大學第一臨床醫學院，貴陽 550002；2貴州中醫藥大學第一附屬醫院泌尿外科，貴陽 550001

勃起功能障礙（erectile dysfunction，ED）是指陰莖不能達到或維持足夠的勃起以完成滿意的性交，病程大于3 個月，是男性常見的性功能障礙［1］。ED作為一種身心疾病，雖不危及生命，但其對患者的生活質量、幸福感以及夫妻雙方間關系有著非常不利的影響，也給患者造成了極大的精神痛苦，導致患者缺乏自信心以及自我評價低下，繼而影響患者的人際關系。更重要的是，ED 還是諸多疾病（如高血壓、冠心病、糖尿病、高脂血癥等）的早期預警信號或伴隨癥狀［2］。近年來，ED 的患病率日益升高，且呈現年輕化的趨勢［3］。根據流行病學調查研究顯示，在40～70 歲年齡段的中老年男性中，ED 發病率為24%～40%，預計到2025 年，在全球范圍內ED患者數量將會突破3.22億［4］。

現代組學技術認為，人體口腔唾液中主要由游離的白細胞、脫落的上皮細胞、細菌及部分遺留的食物殘渣組成［5］。近年來，隨著微生態學的蓬勃發展，研究者們越來越認識到人體微生物與人體生理病理密切相關［6-7］。因此，我們推測口腔菌群與ED 也存在某些聯系。16S rRNA 基因測序能較好地展示菌群微生物的結構特點，已成為研究菌群微生態結構的重要手段［8］。本研究通過16S rRNA高通量測序對ED 患者及健康者的唾液樣本進行測序，對比分析ED患者口腔菌群的結構特征，以探討ED與口腔菌群的關系。

材料與方法

1.研究對象

1.1.ED 組 ⑴診斷標準：參照《勃起功能障礙中西醫結合診療指南（試行版）》［9］，陰莖持續不能達到或維持足夠的勃起以完成滿意的性生活，病程在3 個月以上。⑵納入標準：①符合ED 的西醫診斷標準［10］；②國際勃起功能障礙問卷表5（IIEF-5）評分＜21 分；③男性，年齡在20～65 歲之間；④患者的臨床資料完整，且能積極配合治療，自愿簽署知情同意書。⑶排除標準：①陰莖畸形、器質性或藥物性ED者；②嚴重肝、腎功能損害者；③合并心血管、消化、呼吸、內分泌及血液等系統嚴重的原發性疾病；④目前或近期（4周內）確診或正在接受牙周疾病治療的患者；⑤唾液樣本采樣不合格或樣本質檢不通過者。

1.2.健康對照組納入標準 無嚴重肝、腎功能損害；無合并心血管、消化、呼吸、內分泌及血液等系統嚴重的原發性疾病；③年齡范圍20～65 歲，有正常性生活，且無ED 病史；唾液樣本采樣合格且質檢通過的實驗者。

2.分組

選擇貴州中醫藥大學第一附屬醫院泌尿外科門診ED患者15 例（ED 組），年齡（43.33±9.76）歲；健康者15 例（正常對照組），年齡（41.27±10.71）歲，兩組受試者的年齡比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

本研究經貴州中醫藥大學第一附屬醫院倫理委員會批準（K2023-005）。

3.舌苔樣本采集

唾液樣本收集與留樣凍存當日，所有受試者在清晨空腹、不刷牙狀態下，先采用100 ml 0.9%氯化鈉充分漱口2～3 次，再用3 根無菌棉簽分別在舌周及牙周區域表面輕輕擦拭，擦拭同時旋轉棉簽，使其充分沾染唾液成分，擦拭完畢后將棉簽頭端折斷后置于5 ml 凍存管中，10 min 內轉存于-80 ℃冰箱凍存。收集樣本成批后送至指定的專業檢測公司進行檢測和分析。

4.進行16S rRNA測序

遵循16S rRNA 測序流程，首先采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）和十二烷基硫酸鈉（SDS）法提取出樣本的基因組DNA，再使用2%的瓊脂糖凝膠對DNA 的純度和濃度進行電泳鑒定，經鑒定合格后取適量放于離心管中，使用無菌水將樣本濃度稀釋至1 mg/L，以稀釋后的基因組DNA 作為模板，選擇特定的測序區域（本次研究引物對應區域為高變區V3-V4 區）［11］，使用帶Barcode 的特異性引物和高效高保真酶進行聚合酶鏈式反應（PCR）擴增，擴增后的產物再次進行電泳分離檢測，檢測合格后進行等比例混樣、純化，最后進行文庫構建，合格后使用NovaSeq6000測序系統進行上機測序［12］。

5.實驗數據統計及分析

5.1.測序數據處理及可操作的分類單位（OTUs）聚類和注釋 首先對測序得到的下機數據進行Reads拼接和質控，得到原始Tags，再經嵌合體過濾，得到有效數據。為研究各樣本的物種組成，再利用Uparse 算法［13］對所有樣本的全部有效數據以97%的一致性將序列聚類成為OTUs，再使用數據庫對OTUs進行物種注釋分析［14］，獲得分類學信息并分別在不同分類水平上（界、門、綱、目、科、屬、種）統計各樣本的群落構成，分析不同樣本或不同組別間共同的特征OTUs。

5.2.物種相對豐度展示 根據物種的注釋結果，為了更直觀地反映高豐度物種及其比例，選取單個樣本及不同組別在各個分類水平上豐度前十的物種，將其繪制成物種相對豐度柱形累加圖。

5.3.樣本復雜度分析 樣本微生物群落多樣性及豐富度常使用樣本復雜度分析，包括α 多樣性分析、物種多樣性曲線以及統計學分析。α 多樣性分析衡量的指標有：Chao1、Coverage、ACE、Shannon、Simpson，其中Chao1 指數反映物種總數；ACE 指數反映OTUs 數目，這兩個指數均可以衡量物種的豐度；Shannon指數表示樣品中分類的總數及其占比，群落多樣性越高，物種分布也越均勻，Shannon指數就越大；Simpson指數表示物種多樣性和均勻程度；Coverage指數表示樣本中物種被測出的概率，其大小可以反映本次測序的結果能否代表該樣本中微生物的真實情況［15］。

6.統計學方法

結果

1.樣本分析

1.1.聚類結果 聚類得到OTUs 結果后，比較分析兩組之間相同的、各自特有的OTUs。本研究采集30例舌苔樣本中，共產生OTUs 數目4 586 個（ED 組3 239 個，正常對照組2 457 個，相同1 110 個），說明本次測序樣本數量足夠，樣本所含物種的豐富度和均勻程度均在合理范圍內。

1.2.樣本復雜性分析 α 多樣性分析可評估微生物群落的豐度和多樣性。由表1 可以看出，兩組ACE、Chaol、Shannon、Simpson 指數差異均無統計學意義（均P＞0.05），表明兩組樣本中物種總數量及群落多樣性未見差異，兩組間構成的核心菌類差異無統計學意義，即正常對照組和ED 組具有相同的核心菌群組成骨架，也說明菌群數量及物種多樣性具有一定的穩定性。

表1 兩組研究對象的口腔微生物α多樣性分析[M（P25，P75）]

2.物種分布情況

2.1.物種相對豐度展示 為了能在不同分類水平上更加直觀地查看各樣本和不同組別之間的相對豐度及其比例，根據物種注釋后的結果，分別選取其豐度前10 的物種，統計其豐度值及其占比，繪制成更為直觀的柱形累加圖（圖1、圖2）。在屬水平上，兩組前10 的優勢菌屬類目大致相同，分別為梭桿菌屬、雷爾氏菌屬、奈瑟氏菌屬、嗜血桿菌屬、普雷沃-7 菌屬、韋榮氏球菌屬、異戊酸桿菌、鏈球菌屬、卟啉菌屬、放線菌屬。

圖1 兩組研究對象的口腔微生物屬水平上物種相對豐度柱形圖

圖2 兩組研究對象的口腔微生物屬水平上單個樣本物種相對豐度柱形圖

2.2.兩組間群落結構差異分析 Anosim 分析是一種非參數檢驗方法，可以通過檢驗組間與組內的差異來判斷實驗樣本的分組是否具有意義，其結果用R值表示（若R＞0，則說明組間有差異，代表分組具有意義，反之則說明組內差異大于組間差異，分組無意義）；統計分析得出的可信度可反映該差異性，用P值表示（若P＜0.05，則代表該差異有統計學意義）。本次樣本組間差異分析值中R值為0.106 5，P值為0.02（R＞0 且P＜0.05），充分說明本次研究樣本ED 組和正常對照組的分組是合理的，且兩組間群落結構差異有統計學意義（P＜0.05）。

為了進一步尋找各分類水平中組間存在差異的物種，則做組間t檢驗（非正態分布數據使用非參數檢驗：Wilcoxon 秩和檢驗），統計各菌屬豐度占比值及組間檢驗的P值（表2）。在屬水平，豐度前10的菌屬中，ED 組中的鏈球菌屬的豐度高于正常對照組［8.59（4.13，11.75）%比4.23（3.25，7.48）%］，梭桿菌屬的豐度低于正常對照組［9.38（5.61，14.91）%比14.13（7.92，19.03）%］，兩組比較差異均有統計學意義（均P＜0.05）。

表2 兩組研究對象的口腔微生物在屬水平上的優勢菌種前10位豐度比較[%，M（P25，P75）]

討論

口腔是人體微生物聚集的重要場所，舌面上分布著許多凸起的舌乳頭、裂隙和褶皺，正是這種特殊的結構及口腔內適宜的溫度、濕潤的環境、食物殘渣的氧化和腐敗作用，為微生物生長繁育提供了良好環境［16-17］。研究表明，口腔微生物系統是人體最復雜的微生物系統，口腔微生態與諸多疾病有著密切相關性［18］。有研究已經證實了舌苔菌群在心血管、消化、腎臟、免疫等多系統疾病的發生與發展中起到不同程度的作用［18-20］。此外，口腔菌群也被證實與腸道菌群存在密切相關性［21-22］，而腸道菌群與ED 關系密切［23］，在一定程度上說明了口腔菌群與ED也存在著密切聯系。

16S rRNA 基因測序可通過分析微生物群落中的物種分布及群落特征，尋找出不同樣本或組間的差異菌群，挖掘樣本表型與微生物群落特征之間的關聯，進而闡明微生物與宿主環境間的相互作用關系［24-25］。目前，16S rRNA 基因測序已在微生物的鑒定分析中廣泛應用［26］。在本研究中，通過16S rRNA 高通量測序技術初步分析得出了ED 患者和健康人之間口腔菌群結構特征，發現ED 組和正常對照組口腔菌群在總數量及基本種類構成方面差異均無統計學意義，這代表著兩組間有著相同的核心菌群構成骨架。但兩組菌群豐度差異有統計學意義，在菌屬水平上，ED 組中鏈球菌屬的相對含量高于正常對照組，梭桿菌屬的相對含量低于正常對照組（均P＜0.05）。這充分表明，與健康人相比，ED 患者的口腔微生物群發生了顯著變化。有研究表明，口腔鏈球菌能通過抑制其他菌種的生長而對宿主發生改變［27］。此外，口腔內鏈球菌還可以進入血液，從而引起全身性的變化，這可能與ED疾病的發生發展有密切關系。

目前，微生物群落信息在相關疾病的診療方面具有巨大的潛力，但微生物基因組信息的解讀卻是一個長期復雜的過程。考慮到本次研究存在一些局限性（如樣本量較小），加之目前16S rRNA 基因測序技術研究的層面是微生物群落的物種組成、物種進化關系以及群落多樣性，對微生物的結構、基因功能、相互協作關系以及與宿主環境關系的鑒定仍然不夠深入［28］，我們還不能闡明造成ED患者口腔菌群微生態發生變化的具體機制，所以還需要進行更大樣本量的實驗，以及對造成該差異的機制進行深入研究。

總的來說，通過16S rRNA 基因測序能較全面、準確地展示口腔菌群的多樣性及豐度特點，證實了ED 患者的口腔菌群微生態發生了改變，這可能與ED 的發生發展密切相關，但其機制還有待明確。相信隨著研究的不斷深入，ED患者口腔菌群微生態變化的機制將會愈加清晰和完善，期望能成為預防及治療ED 的生物標志物，從而豐富ED 的致病機制，為新藥研發及個性化診療等方面提供新思路，給廣大ED患者帶來攻克疾病的希望。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻聲明周偉：實施研究，采集數據，分析/解釋數據，起草文章；朱璋龍：采集數據，分析/解釋數據，起草文章；王婉悅：實施研究，起草文章；周晶：實施研究，采集數據，起草文章；胡貴瑤：實施研究，起草文章；劉瑤：行政、技術或材料支持，支持性貢獻；丁維：醞釀和設計試驗，對文章的知識性內容作批評性審閱，統計分析，獲取研究經費，行政、技術或材料支持，指導，支持性貢獻