毫針和火針療法治療骨髓抑制大鼠模型的分子作用機制

楊曉琳 李巖

1天津醫科大學第二醫院中醫科，天津 300211；2天津市公安醫院針灸理療科，天津300040

骨髓抑制是指臨床中由于各種原因導致的骨髓中血細胞前體活性下降。骨髓中含有豐富的造血干細胞，可以分化為白細胞、紅細胞和血小板。當機體受到部分抗生素、抗腫瘤藥物、放療的作用時，會出現骨髓抑制的副作用，導致造血干細胞不能正常分化，外周血中的成熟紅細胞、白細胞和血小板減少，患者出現貧血、出血、感染等癥狀。常見的導致骨髓抑制的藥物包括卡鉑、順鉑和環磷酰胺等癌癥化療藥物［1］。對于接受化療的癌癥患者的調查顯示：癌癥患者在化療期間骨髓抑制的發生率極高。60%～70%的癌癥患者因骨髓抑制的出現，必須減少或者停止癌癥的臨床治療。因此，骨髓抑制使癌癥患者的治療計劃受阻，患者的病情和生存質量進一步惡化。臨床上使用的大多數化療藥物可對人體造血系統造成不良的反應，其中一部分化療藥物可以直接損傷外周血細胞，造成外周血象下降，而另一部分化療藥物可以作用于骨髓，造成骨髓損傷，導致血細胞生成障礙，引起外周血細胞減少［2］。因此，骨髓抑制會導致癌癥患者治療過程中產生諸如感染、敗血癥和膿毒癥等［3］，導致患者化療藥物使用量下降，進而導致治療效果不理想。盡管近年來針對骨髓抑制的研究取得了一定的進展，但是如何從根本上解決化療藥物誘發的骨髓抑制現象，仍然是癌癥治療中的難題，始終困擾著癌癥患者和醫護人員［4］。因此，需要新的治療手段以從根本上解決臨床中骨髓抑制的癥狀。

毫針和火針療法屬于中醫微創治療手段。火針和毫針各有所長，火針挾火氣盛，毫針纖細痛微，毫針和火針療法優化了針灸療法，提高了針灸療效。毫針和火針療法已被大多數患者所接受［5］。中醫理論認為，火針和毫針可放血，“宛陳則除之者，去血脈也”；可速刺，以纖細之體攜火直入；可留刺，疾入穴下，留駐穴中；可決血調氣，通經活絡，兼有賀氏“強通”“溫通”“微通”三通之功能［6］。現代醫學認為，毫針和火針療法治療疾病的作用原理是對穴位的剌激有物理的機械刺激和溫熱剌激及生理的無菌性灼傷剌激。三者合一，增強了刺激強度、作用時間。毫針和火針療法，借“火”之力通經活絡，集針之法激發經氣，取灸之溫陽驅散濕寒。如針刺穴下，不用提插捻轉，其經氣自來，即刻退出針來，針還像留在穴中，其經氣纏綿，針感不絕，療效可立竿見影［7-9］。

本研究開展于2022 年3 月至9 月，通過環磷酰胺誘導建立大鼠骨髓抑制模型，并且通過檢測毫針和火針治療前后大鼠血細胞數量、病理情況，骨髓基質細胞的細胞周期以及細胞周期相關蛋白表達等多項指標，探究毫針和火針治療大鼠骨髓抑制的分子機制，為毫針和火針治療骨髓抑制的臨床應用提供理論基礎和臨床支持。

資料與方法

1.實驗動物

SD 大鼠共96只，4～6周齡，體質量為250～300 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物合格證號SCXK（京）2021-0012。飼養于中國醫學科學院放射醫學研究所實驗動物中心（SPF 級）；飼養條件：常規飼養7 d 以適應環境，飼養期間給予大鼠標準顆粒飼料及純凈飲水，光和暗循環各12 h，相對濕度45%～65%，溫度18～23 ℃。

2.主要試劑及儀器

環磷酰胺（貨號BP1094）（美國Merck 公司）；4%多聚甲醛（貨號P885233）（上海麥克林生化科技股份有限公司）；快速瑞氏吉姆沙染色試劑（貨號AC11921-3*30 ml）（上海吉至生化科技有限公司）；EDTA 脫鈣液（貨號AR1071）（博士德生化科技有限公司）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（貨號P0012S）、RIPA蛋白裂解液（貨號P0013B）（上海碧云天生物技術有限公司）；細胞周期檢測試劑盒（貨號C1052）（上海碧云天生物技術有限公司）；CD6 抗體（貨號bs-2488R）、CD4 抗 體（貨 號bs-0647R）、Cyclin D1 抗 體（貨 號bs-0623R）、E2F1 抗體（貨號bs-23184R）、GAPDH 抗體（貨號bs-2188R）（北京博奧森生物技術有限公司）；澳洲胎牛血清（貨號C0227）（上海碧云天生物技術有限公司）。

DYCZ-24DN SDS-PAGE 蛋白電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；5200 系列全自動化學發光/熒光圖像分析系統（上海天能生命科學有限公司）；電子顯微鏡（DM4000B，Leika 公司）；低溫冷凍離心機（湖南凱達科學儀器有限公司）；DK-320型全自動多功能酶標儀（上海德卡實驗室系統科技有限公司）；流式細胞儀（NovoCyte，艾森生物有限公司）；血細胞自動分析儀（KT6610VET，南京華仁生物科技有限公司）。

3.動物分組及模型制備

適應性飼養7 d后，96只大鼠全部入組。全部稱取并記錄大鼠體質量，根據體質量情況，依次進行編號，采用隨機數字表法將大鼠分為對照組、模型組、火針組、毫針組，各24只；每組再隨機分為4組，每組6只。除對照組外，其余各組大鼠利用環磷酰胺建立大鼠骨髓抑制模型。腹腔注射環磷酰胺50 mg/（kg·d），單次給藥，連續3 d，利用藥代動力學分析，4 d 后環磷酰胺活性消失，因此給藥環磷酰胺4 d 后，環磷酰胺化療大鼠模型即造模成功。同時，對照組大鼠腹腔注射等量生理鹽水。其余各組大鼠依次在造模成功后4 h進行治療。

對照組和模型組大鼠處理方式：每天陪同抓取、固定，但是不進行治療。火針組大鼠處理方式：根據編號依次將大鼠俯臥固定于鼠板上，針具選用華佗牌毫火針（半寸，0.18 mm×13.00 mm），選取雙側足三里穴（足三里穴位于大鼠后肢膝關節后外側，腓骨小頭下約5 mm 處），于造模后第1 天、第3 天、第5 天、第7 天，采用火針點刺法垂直刺入3 mm，不留針，隔日1次，連續7 d。毫針組大鼠處理方式：根據編號依次將大鼠俯臥固定于鼠板上，針具、選穴同火針組，垂直刺入3 mm，留針6 min，于造模后第1 天開始，每天1次，連續7 d。

4.生化指標檢測

4.1.外周血細胞計數 每組大鼠均選取第4 組進行外周血細胞計數，作為血常規組測量血常規指標（白細胞、紅細胞、血紅蛋白和血小板），分別于造模前、造模完成當日（d0），治療后第1（d1）、3（d3）、5（d5）、7（d7）天，晨起空腹狀態下，采集尾靜脈血10 μl，迅速進行血液稀釋，搖勻后上機測定血常規。

4.2.骨髓切片瑞氏吉姆沙染色 每組大鼠均選取第4 組，治療后第7 天采集尾靜脈血后頸椎脫臼法處死，取出大鼠的股骨組織置于4%多聚甲醛溶液固定24 h，經10%EDTA 脫鈣液慢性脫鈣4～5 周。將脫鈣好的標本經不同濃度的乙醇梯度脫水，二甲苯透化標本，然后進行浸蠟和包埋組織。將包埋好的蠟塊切片（切片厚度約3 μm）再經二甲苯脫蠟，蒸餾水洗滌，滴加1 ml 瑞氏吉姆沙A 液于切片上，并讓染液迅速覆蓋整個標本染色1～2 min，再緩慢滴加瑞氏吉姆沙B 液于A 液上面，用移液器輕輕吹打，使兩液充分混合，染色5～10 min，蒸餾水沖洗后烘烤干燥，封片后在電子顯微鏡下觀察病理變化。

4.3.骨髓有核細胞懸液的制備及骨髓單核成纖維細胞培養 每組大鼠均選擇4 個時間點進行骨髓有核細胞懸液的制備，分別選取第1 組，分別于造模后第1 天；選取第2 組，分別于治療后第3 天；選取第3 組，分別于治療后第5 天；選取第4 組，分別于治療后第7 天，頸椎脫臼法處死大鼠，經75%乙醇消毒后，置于超凈工作臺中取大鼠的雙側股骨組織，用手術剪剖開股骨兩端，兩側股骨用1 ml DMEM 培養基反復沖洗骨髓腔收集原代骨髓細胞，最后，經過篩網過濾制成骨髓單核細胞懸液。將骨髓單核細胞懸液按1×106個/ml 的細胞密度接種于含有10%胎牛血清的完全培養基中，在37 ℃、5% CO2和飽和濕度條件下，細胞換液培養，在培養7 d后觀察骨髓單核成纖維細胞的生長狀況。

4.4.流式細胞法檢測骨髓成纖維細胞的細胞周期 收集各組骨髓成纖維細胞，PBS 緩沖液漂洗1 次，將細胞重懸于0.3 ml 的預冷PBS 緩沖液中，加入0.7 ml 預冷乙醇，輕柔混勻2 次，4 ℃固定過夜。1 000 r/min 離心5 min，有效離心半徑是10 cm，去上清，加入PI 染色緩沖液（50 mg/L PI，0.1 g/L RNase A 和0.05% Triton X-100）總體積1.0 ml/樣品，37 ℃孵育40 min。然后，1 000 r/min離心5 min，有效離心半徑是10 cm，小心去除上清，加入1.0 ml PBS 緩沖液，輕柔混勻，300目篩網過濾后，利用流式細胞儀進行檢測。

4.5.免疫印記法檢測細胞周期相關蛋白的表達 取狀態正常的各組骨髓單核成纖維細胞在RIPA 蛋白裂解液中充分裂解。用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定各組骨髓單核成纖維細胞蛋白濃度。采用SDS-PAGE 電泳法進行蛋白分離，將蛋白采用濕轉法轉移到PVDF 膜上。用5%封閉液封閉后，使用抗CD4（稀釋比例1∶1 000）、抗CD6（稀釋比例1∶8 000）、抗Cyclin D1（稀釋比例1∶1 000）、抗E2F1（稀釋比例1∶8 000）和抗GAPDH（稀釋比例1∶2 000）一抗孵育，4 ℃過夜，然后使用辣根過氧化物酶（HRP）結合的二抗室溫孵育1～2 h。通過全自動化學發光圖像分析系統觀察和記錄蛋白印跡信號，并使用Gelpro32 軟件分析蛋白質的相對表達量。

5.統計學方法

采用SPSS 20.0 軟件進行實驗數據的統計和分析，圖表采用GraphPad Prism 8.0 軟件進行統計和制作。實驗數據滿足正態分布且方差整齊時，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。實驗數據不滿足正態分布或方差不齊時，則選擇Bonferroni 校正和Kruskal-Wallis 檢驗。P＜0.05被認為差異有統計學意義。

結果

1.各組大鼠外周血細胞數量和血紅蛋白含量比較

由表1 結果可見，模型組白細胞數量和血小板數量低于對照組，紅細胞數量和血紅蛋白含量高于對照組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。治療后1、3、5、7 d，火針組和毫針組白細胞數量和血小板數量高于模型組，紅細胞數量和血紅蛋白含量低于模型組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。這表明毫針和火針治療均可以改善環磷酰胺所致的大鼠骨髓抑制狀態。

表1 各組SD大鼠外周血細胞數量和血紅蛋白含量（）

表1 各組SD大鼠外周血細胞數量和血紅蛋白含量（）

注：對照組和模型組大鼠每天陪同抓取、固定，但是不進行治療；火針組大鼠根據編號依次將大鼠俯臥固定于鼠板上，選取雙側足三里穴于造模后第1天、第3天、第5天、第7天，采用火針點刺法治療，火針垂直刺入3 mm，不留針，隔日1次，連續7 d；毫針組大鼠根據編號依次將大鼠俯臥固定于鼠板上，針具、選穴同火針組，垂直刺入3 mm，留針6 min，于造模后第1 天開始，每天1 次，連續7 d。與對照組比較，aP＜0.05；火針組與模型組比較，bP＜0.05；毫針組與模型組比較，cP＜0.05；毫針組與火針組比較，dP＜0.05

2.各組大鼠骨髓組織病理學結果比較

由圖1 結果可見，對照組（A）骨髓組織切片中可見明顯的骨髓原始細胞（如圖黑色箭頭所示）及桿狀核細胞（如圖黃色箭頭所示）；模型組（B）骨髓組織切片中僅可見骨髓原始細胞（如圖黑色箭頭所示），且細胞數量明顯減少，并未發現桿狀核細胞；毫針組（C）和火針組（D）骨髓組織切片中，與模型組相比，骨髓原始細胞數量明顯增加，并且可見桿狀核細胞。這表明毫針和火針治療對于骨髓抑制的大鼠有明顯的修復作用。

圖1 各組SD大鼠骨髓細胞瑞氏吉姆沙染色結果比較（×100）。A：對照組；B：模型組；C：毫針組；D：火針組

3.各組大鼠骨髓單核成纖維細胞周期結果比較

由表2 可見，大鼠骨髓抑制建模后，骨髓單核成纖維細胞周期停留在G0/G1 期，分裂的骨髓單核細胞無法進入S期，進而進入休眠狀態。火針組和毫針組G0/G1 期細胞百分率的變化趨勢基本相同，但火針組和毫針組G0/G1 期骨髓單核成纖維細胞百分率始終低于模型組，差異均有統計學意義（均P＜0.05），其中火針組變化較毫針組更顯著（均P＜0.05），且S期和G2/M期骨髓單核成纖維細胞百分率始終高于模型組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。結果表明毫針和火針可不同程度釋放G1 和S 期骨髓單核成纖維細胞，使細胞進入快速增殖階段，促進骨髓單核成纖維細胞向各種血細胞分化，進而增加白細胞和血小板的比例，減少紅細胞的比例，彌補各種有核血細胞的缺少，從而有效改善大鼠骨髓抑制狀態。

表2 各組SD大鼠中骨髓單核成纖維細胞周期檢測比較（%（）

表2 各組SD大鼠中骨髓單核成纖維細胞周期檢測比較（%（）

注：對照組和模型組大鼠每天陪同抓取、固定，但是不進行治療；火針組大鼠根據編號依次將大鼠俯臥固定于鼠板上，選取雙側足三里穴于造模后第1天、第3天、第5天、第7天，采用火針點刺法治療，火針垂直刺入3 mm，不留針，隔日1 次，連續7 d；毫針組大鼠根據編號依次將大鼠俯臥固定于鼠板上，針具、選穴同火針組，垂直刺入3 mm，留針6 min，于造模后第1天開始，每天1次，連續7 d。“-”表示無數據。與對照組比較，aP＜0.05；火針組與模型組比較，bP＜0.05；毫針組與模型組比較，cP＜0.05；毫針組與火針組比較，dP＜0.05

4.各組大鼠單核成纖維細胞中細胞周期相關蛋白表達結果比較

選取每組大鼠骨髓單核成纖維細胞進行蛋白表達量檢測。圖2 和表3 結果所示，與對照組比較，模型組大鼠骨髓單核成纖維細胞中細胞周期相關蛋白CD4、CD6、Cylcin D1 和E2F1 相對表達量明顯下調（均P＜0.05）；與模型組比較，毫針組和火針組治療后3、7 d大鼠骨髓單核成纖維細胞中CD4、CD6、Cylcin D1 和E2F1 蛋白相對表達量明顯上調（均P＜0.05）；火針組細胞周期相關蛋白CD4、CD6、Cylcin D1和E2F1表達上調更顯著（均P＜0.05）。

圖2 各組SD大鼠中單核成纖維細胞中細胞周期相關蛋白表達結果

表3 各組SD大鼠中骨髓單核成纖維細胞蛋白相對表達量比較（）

表3 各組SD大鼠中骨髓單核成纖維細胞蛋白相對表達量比較（）

注：對照組和模型組大鼠每天陪同抓取、固定，但是不進行治療；火針組大鼠根據編號依次將大鼠俯臥固定于鼠板上，選取雙側足三里穴于造模后第1天、第3天、第5天、第7天，采用火針點刺法治療，火針垂直刺入3 mm，不留針，隔日1次，連續7 d；毫針組大鼠根據編號依次將大鼠俯臥固定于鼠板上，針具、選穴同火針組，垂直刺入3 mm，留針6 min，于造模后第1 天開始，每天1 次，連續7 d。與對照組比較，aP＜0.05；火針組與模型組比較，bP＜0.05；毫針組與模型組比較，cP＜0.05；毫針組與火針組比較，dP＜0.05

討論

本研究表明，毫針和火針治療均可以有效改善大鼠骨髓抑制的癥狀。骨髓抑制大鼠模型的建立可以在動物體內有效模擬化療藥物使用后，癌癥患者產生骨髓抑制的不良癥狀。在本項研究中，筆者成功創建了骨髓抑制大鼠模型，為骨髓抑制的深入研究和科學探索提供了的研究基礎和實踐手段［10］。在本次實驗中，使用腹腔注射環磷酰胺的方法建立骨髓抑制大鼠模型。環磷酰胺是臨床常用的化療藥物，主要有抗腫瘤作用。環磷酰胺能夠與腫瘤細胞的DNA結合，打斷腫瘤細胞的DNA 分子的合成，進而阻斷腫瘤細胞的生長和繁殖［11］。環磷酰胺的不良反應與其劑量相關，比較常見的不良反應有脫發、惡心嘔吐等。這些不良反應都較輕，其嚴重的不良反應是骨髓抑制。環磷酰胺導致骨髓抑制的分子機制是打破骨髓中處于休眠和增殖狀態的造血干細胞的代謝平衡，最終導致機體出現骨髓抑制［12-14］。骨髓抑制影響生成紅細胞、血小板和白細胞的數量，一般在臨床通過檢測這些不同血細胞的數量來進行衡量和評估。

毫針和火針是一門創新的中醫微創治療技術，是針灸學的重要組成部分，是針灸療法中獨特的治療體系。本研究表明，毫針和火針可改善大鼠骨髓抑制，其作用機制可能是通過上調骨髓細胞周期蛋白的表達，使造血干細胞的增殖和休眠重新恢復平衡，進而增加紅細胞、血小板和白細胞的數量［15-16］。另外，足三里穴是足陽明胃經的主要穴位之一，屬“土穴”，能夠燥化脾濕，生發胃氣。如《靈樞》中所述：“邪在脾胃，則病肌肉痛；陽氣有余，陰氣不足，則熱中善饑；陽氣不足，陰氣有余，則寒中腸鳴腹痛；陰陽俱有余，若俱不足，則有寒有熱；皆調于足三里［17］。”《靈樞》中還講到：“著痹不去，久寒不已，卒取其三里骨為干；腸中不便，取三里……善嘔，嘔有苦，長太息，恐人將捕之，邪在膽，逆在胃，膽液泄則口苦，胃氣逆則嘔苦，故曰嘔膽，取三里以下胃氣逆［18］。”《外臺》里講到：“凡人年三十以上，苦不灸三里，令人氣上眼？以三里下氣［19］。”可見足三里是治療“本虛”的要穴，可以調理肝脾，補益氣血，改善腫瘤患者的“本虛”［20］。因此，對于毫針和火針治療效果來講，足三里穴位的選擇也是極為關鍵的。

綜上所述，毫針和火針治療大鼠骨髓抑制的可能作用機制可能是通過調節骨髓單核細胞中CD4、CD6、Cylcin D1 和E2F1 蛋白的表達，從而恢復骨髓基質細胞增殖和休眠的代謝平衡。但是，本研究中并未直接驗證毫針和火針對細胞周期信號通路的調控作用。因此，在今后的研究中，可通過基因敲除和信號通路抑制等方法進一步闡釋毫針和火針治療骨髓抑制的分子機制，為毫針和火針治療骨髓抑制的臨床應用提供更為有利的理論基礎和科學依據。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻聲明 楊曉琳：醞釀和設計實驗，實施研究，采集數據，分析/解釋數據，起草文章，統計分析；李巖：對文章的知識性內容作批評性審閱，行政、技術或材料支持，指導