miR-10b靶向TGFBR1/SMAD3通路對特發性矮小癥的軟骨細胞增殖、肥大的影響機制

胡娜 李正宇 葉春風 吳英 姚慶 黃世祥 李文 朱海琴

摘要：目的 研究miR-10b對特發性矮小癥（ISS）的影響及作用機制。方法 收集ISS患兒（ISS組）和體檢健康兒童（健康對照組）各54例，qPCR檢驗血清miR-10b表達量，分析ISS組患兒血清miR-10b表達與患兒臨床資料的關系。采用miR-10b inhibitor、si-TGFBR1及各自陰性對照轉染C28/I2細胞，利用CCK-8實驗檢測C28/I2細胞增殖能力，Western blot檢測侏儒相關轉錄因子2（RUNX2）、X型膠原α1鏈（COL10A1）、轉化生長因子β受體1（TGFBR1）、SMAD3、pSMAD3蛋白表達量。在StarBase數據庫篩選miR-10b靶點，利用雙螢光素酶報告基因實驗驗證miR-10b與TGFBR1的靶向關系。結果 ISS組血清miR-10b表達量高于健康對照組，且miR-10b表達越高，患兒的身高、IGF-1、骨特異性堿性磷酸酶的下降越明顯（P＜0.05）。與NC組相比，miR-10b inhibitor組細胞增殖能力升高，RUNX2、COL10A1、TGFBR1、pSMAD3蛋白表達上調（P＜0.05）；StarBase數據庫提示miR-10b存在TGFBR1的結合位點，雙螢光素酶報告基因實驗證實兩者結合。與si-NC相比，si-TGFBR1組TGFBR1表達量下調，細胞增殖能力下降（P＜0.05）。結論 miR-10b通過靶向TGFBR1/SMAD3通路在特發性矮小癥中抑制軟骨細胞的增殖、肥大。

關鍵詞：特發性矮小癥；受體，轉化生長因子βⅠ型；miR-10b；Smad3蛋白質

中圖分類號：R752.8文獻標志碼：ADOI：10.11958/20230659

The mechanism of miR-10b targeting TGFBR1/SMAD3 pathway on chondrocyte?proliferation and hypertrophy in idiopathic short stature

Abstract： Objective To investigate the effect and mechanism of microRNA-10b （miR-10b） on idiopathic short stature （ISS）. Methods A total of 54 children with ISS and 54 healthy children were collected. The serum expression of miR-10b was detected by RT-qPCR， and the relationship between serum miR-10b expression and clinical data of children with ISS was analyzed. miR-10b inhibitor， si-TGFBR1 and their negative control transfection C28/I2 cells were used. CCK-8 experimental detection was used to detect C28/I2 cell proliferation. Western blot assay was used to detect gnome related transcription factor 2 （RUNX2）， collagen type X alpha 1 chain （COL10A1）， transforming growth factor beta receptor 1 （TGFBR1）， SMAD3 and pSMAD3 protein expression. The target of miR-10b was screened in StarBase database， and the targeting relationship between miR-10b and TGFBR1 was verified by dual luciferase reporter gene assay. Results The serum expression of miR-10b was higher in the ISS group than that of the healthy control group， and the higher the miR-10b expression， the more obvious the decrease of child height， IGF-1 and alkaline phosphatase? （P＜0.05）. Compared with the NC group， the cell proliferation ability and RUNX2， COL10A1， TGFBR1， and pSMAD3 protein expression were up-regulated in the miR-10b inhibitor group （P＜0.05）. StarBase database suggested that miR-10b had a binding site of TGFBR1， and dual luciferase reporter gene assay confirmed that TGFBR1 interacted with miR-10b （P＜0.05）. Compared with the si-NC group， the expression of TGFBR1 was down-regulated and the cell proliferation ability was decreased in the si-TGFBR1 group （P＜0.05）. Conclusion miR-10b inhibits chondrocyte proliferation and hypertrophy in idiopathic short stature by targeting TGFBR1/SMAD3 pathway.

Key words： idiopathic short stature; receptor， transforming growth factor-beta type Ⅰ; miR-10b; Smad3 protein

特發性矮小（idiopathic short stature，ISS）是矮小癥中最常見的類型，即患者生長激素水平正常，而身高在不伴有潛在病理狀態下低于同齡、同性別人群身高平均值2個標準差（SD）［1］。ISS病因不明，占所有身材矮小兒童的60％～80％，嚴重影響兒童生長發育與生活質量，給心理健康造成極大影響，早發現、早診斷對改善患兒終身高至關重要。近年來，非編碼RNA生物標志物研究成為熱點。研究表明，血液中微小RNA（microRNA，miRNA）在不同生理、病理狀態下具有特定的表達水平和模式，穩定性、重復性較好，有助于疾病的早期診斷［2-3］。轉化生長因子β（TGF-β）信號通路在胚胎骨發育和出生后骨穩態中都有重要作用，與早期胚胎發育和器官發生、免疫監督、組織修復密切相關［4］。本課題組前期預試驗發現miR-10b在ISS兒童血清中上調表達量最高，本文進一步研究miR-10b與ISS的關系及作用機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年8月—2021年8月在我院接受治療的54例ISS患者（ISS組）。納入標準：（1）身高低于同性別、同年齡、同地區、同種族正常參考值平均數-2 SD。（2）出生時身長和體質量正常，而且身材勻稱。（3）無明顯的慢性器質性疾病（肝、腎、心、肺、內分泌代謝病和骨骼發育障礙）。（4）無心理和嚴重的情感障礙，飲食正常。（5）生長速率稍慢或正常，一般每年生長速率＜5 cm。（6）染色體正常。（7）生長激素（GH）激發試驗GH峰值≥10 μg/L，且胰島素樣生長因子1（IGF-1）濃度正常。（8）骨齡正?；蜓舆t。排除標準：（1）資料不全者。（2）伴有系統性慢性疾病，如先天性心臟病、哮喘、營養不良等疾病者。ISS組男30例，女24例，年齡5～12歲，平均（8.77±0.35）歲，平均身高（122.3±11.42）cm。選取同期進行體檢的健康兒童54例（健康對照組），男29例，女25例，年齡5～12歲，平均（8.69±0.46）歲，平均身高（133.2±10.61）cm，2組性別（χ2=0.037）、年齡（t=1.017）比較差異無統計學意義（均P＞0.05）。ISS組身高較健康對照組下降（t=37.311，P＜0.01）。本研究經我院倫理委員會審核并批準（2019醫研倫審第10號），患兒或家屬均知情并簽署研究同意書。所有對象于入院后首次檢查時采集血液樣本，采集后立即在液氮中冷凍，-80 °C的冰箱中保存待用。

1.2 細胞及試劑 人軟骨細胞系C28/I2、293T細胞購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。DMEM/F12細胞培養基、胎牛血清（FBS）和鏈霉素-青霉素雙抗均購自美國Gibco公司。TGF-β受體1（TGFBR1）、重組人SMAD家族成員3（SMAD3）、磷酸化SMAD3（pSMAD3）、X型膠原α1鏈（COL10A1）、侏儒相關轉錄因子2（RUNX2）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標記的兔抗IgG二抗均購自英國Abcam公司，紅細胞裂解液購自北京索萊寶科技有限公司。BeyoRTTM II cDNA第一鏈合成試劑盒及ECL發光試劑購自碧云天生物技術有限公司。TaqMan? Universal PCR Master Mix、TaqMan miRNA特異性引物、pmirGLO-TGFBR1螢光素酶載體（野生型或突變型質粒）均購自深圳華大基因有限公司，StepOne Plus實時熒光定量PCR儀購自上海凌儀生物科技有限公司。Lipofectamine 3000 購自Invitrogen公司。miR-10b抑制物（miR-10b inhibitor）、模擬物（miR-10b mimic）及其對照（miR-NC）、TGFBR1小干擾RNA（si-TGFBR1）及其陰性對照（si-NC）均購自廣州銳博生物科技有限公司，DAB顯色劑購自武漢博士德公司。雙螢光素酶報告基因購自美國Promega公司。IGF?1、骨特異性堿性磷酸酶（BAP）酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒購于英國Immunodiagnostic systems公司。

1.3 方法

1.3.1 人血miR-10b檢測 利用3倍體積的紅細胞裂解液與血液樣本混勻，3 000 r/min離心10 min后移除上清液，可見白色顆粒沉于管底。隨后利用Trizol試劑提取總RNA，使用TaqMan MicroRNA逆轉錄試劑盒將總RNA進行逆轉錄，使用SYBR Green PCR Master Mix進行實時熒光定量PCR（qPCR），以U6基因作為內參。20 μL反應體系：SYBR? Green Realtime PCR Master Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 6 μL。反應條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，55℃ 45 s，72 ℃ 30 s，40個循環。

1.3.2 血清IGF-1和BAP檢測 取ISS組空腹靜脈血5 mL，5 000 r/min離心10 min后取血清，采用ELISA法檢測IGF-1和BAP表達水平，檢測步驟按照試劑盒說明書進行操作。

1.3.3 細胞培養 使用添加10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM/F12培養基培養人軟骨細胞系C28/I2，將細胞置于5%CO2和37 ℃恒溫培養箱中培養。利用胰蛋白酶按照1∶2的比例進行細胞傳代。

1.3.4 細胞轉染 取對數生長期C28/I2細胞，消化后制成單細胞懸液，將2×104個/mL的單細胞懸液接種至6孔板內。待軟骨細胞融合度達到30%～40%時，使用Lipofectamine 3000行瞬時轉染miR-10b inhibitor、miR-NC、si-TGFBR1及si-NC，分別為miR-10b inhibitor組、NC組、si-TGFBR1組、si-NC組。

1.3.5 qPCR檢測基因表達 利用Trizol試劑提取細胞中總RNA，參照1.3.1進行qPCR檢測miR-10b表達，以U6基因作為內參。另使用BeyoRTTM II cDNA第一鏈合成試劑盒逆轉得到cDNA，以GAPDH為內參，使用TaqMan? Universal PCR Master Mix進行qPCR，檢測TGFBR1、pSMAD3的表達水平。反應體系及反應條件同方法1.3.1，以2-ΔΔct法計算目的基因的表達量，引物序列由華大基因公司合成，見表1。

1.3.6 CCK-8實驗檢測細胞增殖 4組細胞接種于96孔板（每孔1×103個細胞），加入培養基正常培養，各時間點（0、24、48、72 h）均于37 ℃下加入CCK-8試劑 1 h。在450 nm波長處檢測光密度（OD）值。

1.3.7 Western blot檢測蛋白表達 采用RIPA試劑提取細胞總蛋白，BCA法進行蛋白定量。蛋白質經10% SDS-PAGE分離，電轉移至PVDF膜。用5%脫脂奶粉孵育1 h，TBST洗滌5次后滴加TGFBR1、SMAD3、pSMAD3、RUNX2、COL10A1、GAPDH一抗（均為1∶1 000稀釋），于4 ℃孵育過夜。與HRP標記的兔抗IgG（1∶5 000）室溫孵育1 h，TBST洗滌5次后用ECL發光試劑檢測蛋白條帶。以GAPDH為內參，使用Image J軟件分析目的蛋白相對表達量。

1.3.8 miR-10b與TGFBR1靶向關系的預測與驗證 使用StarBase v2.0數據庫（https：//starbase.sysu.edu.cn/index.php）預測miR-10b與TGFBR1的結合位點；進行雙螢光素酶報告基因測定確認TGFBR1和miR-10b之間的結合關系。在12孔板中，1×105個細胞懸液培養至40%，利用Lipofectamine 2000將miR-10b模擬物或NC（50 nmol/L）和1 μg pmirGLO-TGFBR1螢光素酶載體（野生型或突變型質粒）共轉染293T細胞。在轉染后24 h進行螢光素酶活性檢測。細胞分組：TGFBR1 3?-UTR-WT+miR-10b mimic/NC、TGFBR1 3?-UTR-MUT+ miR-10b mimic/NC。

1.4 統計學方法 采用GraphPad Prism 8軟件進行數據分析。符合正態分布的計量資料以[x] ±s表示，2組間均數比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-10b在ISS中的表達 qPCR結果表明，ISS組血清miR-10b表達量高于健康對照組（2.68±0.25 vs. 1.12±0.21，t=35.111，P＜0.01）。以miR-10b中位表達量2.54為界，將ISS組分為miR-10b高表達組（≥2.54）和低表達組（＜2.54）各27例。

2.2 ISS組患兒血清miR-10b表達與患兒臨床資料的關系 miR-10b高、低表達組患兒體質量和BMI差異均無統計學意義（P＞0.05）；miR-10b低表達組身高、IGF-1、BAP高于高表達組（P＜0.05）。見表2。

2.3 抑制miR-10b表達促進軟骨細胞的增殖、肥大 qPCR結果表明，miR-10b inhibitor組miR-10b表達量低于NC組。CCK-8實驗結果顯示，抑制miR-10b后48、72 h，C28/I2軟骨細胞增殖能力較NC組升高（P＜0.05），見表3。Western blot結果顯示，抑制miR-10b表達后，RUNX2及COL10A1蛋白表達量上調（P＜0.05），見圖1。

2.4 miR-10b調控TGFBR1/SMAD3通路 Western blot結果顯示，與NC組相比，抑制miR-10b表達后TGFBR1、pSMAD3表達上調（P＜0.01），見圖2。

2.5 miR-10b靶向調控TGFBR1 StarBase數據庫分析發現，miR-10b能與TGFBR1 mRNA的3'-UTR結合，見圖3A。雙螢光素酶報告實驗表明，在TGFBR1 WT中，與NC組相比，miR-10b mimic組螢光素酶活性降低（P＜0.05），在TGFBR1 MUT中，2組間差異無統計學意義，見圖3B。

2.6 敲低TGFBR1表達可抑制C28/I2細胞增殖 qPCR結果表明，si-TGFBR1組TGFBR1表達量低于si-NC組，TGFBR1低表達模型構建成功。CCK-8結果顯示，抑制TGFBR1表達72 h后，C28/I2細胞增殖能力較si-NC組降低（P＜0.05），見表4。

3 討論

ISS是一種內分泌相關疾病，診斷困難，發病機制不明，其發病原因與遺傳、骨骼發育障礙等多因素有關，已成為嚴重影響兒童身心健康的疾病之一［5］。目前，ISS的主要治療方法是重組人生長激素，但ISS患者并不表現生長激素缺乏，因此重組人生長激素對ISS患者療效不一。同時，臨床上使用大劑量重組人生長激素還會引起高血糖、高胰島素血癥及骨和軟骨瘤等不良反應［6］。因此，進一步闡明ISS的發病機制，探討ISS生物標志物是當前臨床關注的重點，做到早發現、早診斷，以期降低ISS患病率或提高ISS患者的生活質量。

ISS患者的主要臨床癥狀為生長遲緩，具體表現為身高、體質量、骨骼生長、發育異常。骨骼發育主要與骨縱向生長有關，研究表明縱向骨主要與生長板驅動有關，軟骨細胞在生長板內經歷細胞增殖、分化肥大，進而轉化為骨，影響骨的縱向生長［7］。目前，非編碼RNA的穩定性、特異性已引起臨床廣泛關注，在腫瘤、炎癥、發育異常等各類疾病中發揮作用［8］。例如，LncRNA MALAT-1通過吸附miR-22促進上皮性卵巢癌的生長和轉移［9］，下調miR-21是克服結腸癌、肝癌等癌癥耐藥的一種有前景的策略［10］。非編碼RNA可調控軟骨細胞的增殖和凋亡［11-12］，從而可能影響骨的縱向生長。lncRNA對骨代謝平衡有重要調控作用，可通過多種信號通路和轉錄因子影響間充質干細胞成骨分化過程［13］。miR-143可以調節生長板的損傷［14］。既往研究發現，miR-10b過表達可以抑制乳腺癌［15］、胃癌［16］細胞株的生長。另有研究發現［17］，miR-10b-5p可促進成肌細胞增殖，抑制肌纖維形成，但關于miR-10b對ISS的影響尚未見報道。筆者前期預試驗通過對ISS患者和健康人標本進行高通量測序，發現miR-10b在ISS患者血清中高表達，但其具體發病機制尚不清楚。在本研究中，進一步擴大患者樣本量，采用RT-qPCR進一步證實了miR-10b在ISS患者組的表達量較健康對照組上調，提示miR-10b可能與ISS的發生和發展密切相關，是一個潛在的診斷生物標志物。IGF?1與營養、骨代謝密切相關，且在青少年時期隨年齡增長和身體發育而增高，BAP主要由活躍的成骨細胞釋放，其水平升高表示骨代謝增加。本研究中ISS患兒miR-10b表達越高，IGF?1、BAP表達量越低，表明miR-10b與骨代謝、發育有關。骨是體內最具活力的器官，通過骨的形成和吸收不斷進行重塑。一系列的分子和途徑導致成骨細胞分化，而成骨分化又歸因于骨生成或骨形成。RUNX2是一種對成骨細胞分化和軟骨細胞成熟至關重要的轉錄因子［18］。在成骨細胞分化過程中，RUNX2在未定向間充質細胞中弱表達，在前成骨細胞中表達上調，在未成熟成骨細胞中達到最高水平，在成熟成骨細胞中表達下調。近年來發現，許多miRNA可調控RUNX2的表達或活性，從而影響成骨過程。如miR-135和miR-203靶向RUNX2會抑制乳腺癌和轉移性骨病的進展［19］。本研究發現，抑制miR-10b表達后，RUNX2與COL10A1表達量較NC組升高，提示敲除miR-10b顯著促進了軟骨細胞的增殖、肥大。

為探討miR-10b的潛在作用機制，筆者進一步預測并證明TGFBR1基因是miR-10b的直接靶基因。TGFBR1是TGF-β/SMAD通路的重要組成部分，可以將TGF-β信號從細胞表面轉導到細胞質中，這一過程對于軟骨細胞的增殖和分化是必不可少的。TGF-β作為一種多功能多肽細胞因子，在早期胚胎發育和成人體內穩態中起著至關重要的作用。SMAD蛋白不僅是信號轉導蛋白，而且是介導多種信號通路的轉錄調節因子，如TGF-β、BMP和Wnt信號通路。TGF-β在與Ⅱ型受體（TGFBR2）結合后，會將TGFBR1募集到高度保守的近膜區域；然后激活的TGFBR1會磷酸化其下游靶標，包括信號轉導子SMAD家族成員SMAD2和SMAD3［20］。Xiao等［21］發現TGF-β/SMAD信號通路通過調控miR-455-5p/RUNX2軸抑制icmt誘導的終板軟骨細胞退變。本研究發現敲低TGFBR1的表達可抑制軟骨細胞的增殖，另外抑制miR-10b表達可上調TGFBR1蛋白及SMAD3的磷酸化水平，表明miR-10b可能通過靶向調控TGFBR1表達抑制SMAD3信號通路，從而調節軟骨細胞的增殖、肥大。

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