麝香酮調節SHH介導的自噬對卵巢癌細胞惡性進展的影響

汪愛華 張飛忠 王紅英

摘要：目的 探究麝香酮調節超音刺猬蛋白（SHH）介導的自噬對卵巢癌細胞惡性進展的影響。方法 檢測0、2、4、8、16、24 μmol/L的麝香酮處理后的人卵巢癌細胞SKOV3存活率，篩選出麝香酮最佳細胞作用濃度。體外培養SKOV3細胞并構建其移植瘤小鼠模型，隨機均分為對照組，麝香酮組，麝香酮+自噬抑制劑氯喹（CQ）組，麝香酮+空載組，麝香酮+SHH過表達組，按照分組分別以麝香酮、CQ、空載質粒及SHH過表達質粒處理后，檢測各組移植瘤小鼠腫瘤體積和質量；分別以EdU染色、TUNEL染色、細胞劃痕、Transwell侵襲實驗、免疫印跡法、實時熒光定量PCR檢測SKOV3細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲、SKOV3細胞及其移植瘤小鼠腫瘤組織自噬相關蛋白（LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1）與SHH表達。結果 與對照組相比，麝香酮組細胞增殖率、遷移率、侵襲數目、腫瘤體積和質量、腫瘤組織SHH mRNA及蛋白表達水平均降低（P＜0.05），細胞凋亡率、細胞及腫瘤組織LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin-1蛋白表達水平均升高（P＜0.05）。與麝香酮組相比，麝香酮+CQ組和麝香酮+SHH過表達組細胞增殖率、遷移率、侵襲數目、腫瘤體積和質量升高（P＜0.05），細胞凋亡率、細胞及腫瘤組織LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin-1蛋白表達水平均降低（P＜0.05）；麝香酮+SHH過表達組細胞及腫瘤組織SHH mRNA及蛋白表達水平升高（P＜0.05）；麝香酮+空載組細胞各指標變化差異無統計學意義（P＞0.05）。結論 麝香酮可通過下調SHH而促進卵巢癌細胞自噬，進而抑制其增殖、體內生長、遷移及侵襲，促進其凋亡，最終抑制其惡性進展。

關鍵詞：卵巢腫瘤；麝香酮；超音刺猬蛋白；自噬；惡性進展

中圖分類號：R737.31文獻標志碼：ADOI：10.11958/20230541

Impacts of muscone on malignant progression of ovarian cancer cells by regulating SHH mediated autophagy

Abstract： Objective To investigate the effect of muscone on malignant progression of ovarian cancer cells mediated by regulating sonic hedgehog （SHH） mediated autophagy. Methods Survival rates of human ovarian cancer cell line SKOV3 treated with 0， 2， 4， 8， 16， and 24 μmol/L muscone were detected， and the optimal cell action concentration of muscone was selected. SKOV3 cells were cultured in vitro， and their transplanted tumor mouse models were constructed. Cells were randomly grouped into the control group， the muskone group， the muskone+chloroquine （CQ，an autophagy inhibitor） group， the muskone+empty group and the muskone+SHH overexpression group. After grouping and treatment with musconeand， CQ， empty plasmid and SHH overexpression plasmid， the tumor volume and weight in transplanted tumor mice were detected. EdU staining， TUNEL staining， cell scratch， Transwell invasion assay， immunoblotting and real-time fluorescence quantitative PCR were used to detect proliferation， apoptosis， migration and invasion of SKOV3 cells， the expression of autophagy related proteins （LC3Ⅱ/LC3Ⅰ， Beclin-1） and SHH in SKOV3 cells and transplanted tumor mice in each. Results Compared with the control group， the cell proliferation rate， cell migration rate， number of invasions， tumor volume and weight， and the expression of SHH mRNA and protein in tumor tissue were decreased in the muskone group （P＜0.05）， and the apoptosis rate， LC3Ⅱ/LC3Ⅰ， Beclin-1 protein in cells and tumor tissue were increased （P＜0.05）. Compared with the muscone group， the cell proliferation rate， cell migration rate， number of invasion， tumor volume and weight were increased in the muscone+CQ group and the muskone+SHH overexpression group （P＜0.05）， and the apoptosis rate， LC3Ⅱ/LC3Ⅰ and the expression of Beclin-1 protein in cells and tumor tissue were decreased （P＜0.05）. There were no significant differences in the above indicators in the muscone+empty group （P＞0.05）. Conclusion Muscone can promote autophagy of ovarian cancer cells by down-regulating SHH， thereby inhibiting their proliferation， in vivo growth， migration and invasion， promoting their apoptosis， and ultimately inhibiting their malignant progression.

Key words： ovarian neoplasms; muscone; sonic hedgehog; autophagy; malignant progression

卵巢癌是全球范圍內常見的惡性腫瘤，因其發病早期不易察覺，患者就診時病情大多已進入晚期，病死率很高，已成為女性癌癥死亡的主要原因之一［1-2］。自噬是一種細胞自我降解過程，在包括卵巢癌在內的癌癥發生發展中起重要作用，觸發并增強自噬可對抗促炎細胞因子促進的卵巢癌過量糖酵解及轉移擴散，進而抑制其惡性進展［3-4］。麝香酮是麝香的主要活性成分，可用于抗癌、抗炎、抗腫瘤多藥耐藥等，且療效顯著［5］。有研究顯示，麝香酮可通過結合雄激素受體、孕激素受體等多個靶標對乳腺癌發揮潛在治療作用［6］；其可顯著抑制肺癌A549細胞的順鉑耐藥性，并抑制小鼠皮下移植瘤的生長［7］。超音刺猬蛋白（sonic hedgehog，SHH）在大腸癌、卵巢癌等惡性腫瘤的發生及惡性進展中發揮至關重要的作用。研究顯示，SHH在癌癥干細胞中過表達，下調其表達可明顯抑制大腸癌的體內生長［8］。SHH與卵巢癌總生存期短有關，并與卵巢型子宮內膜異位癥惡變相關，其高表達提示子宮內膜異位癥相關卵巢癌患者預后不良［9-10］。另有研究顯示，SHH介導癌細胞自噬過程，抑制SHH信號可通過誘導細胞凋亡、細胞周期停滯和自噬來抑制前列腺癌的體內外生長，并減輕其骨轉移［11］。由此推測SHH可能通過調控自噬介導卵巢癌的惡性進展。本研究通過體外培養人卵巢癌細胞系SKOV3，探究麝香酮調節SHH介導的自噬對卵巢癌細胞惡性進展的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物與細胞 BALB/c小鼠購自山東博安生物技術股份有限公司，生產許可證號：SCXK（魯）2020-0006，SPF級，6周齡左右，雌性，體質量18～22 g，飼養在25～27 ℃、濕度40%～55%的動物房內，維持明暗各12 h循環照明；人卵巢癌細胞系SKOV3購自上海蓋寧生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑及儀器 麝香酮（批號110719-201716）購自天津西瑪科技有限公司；氯喹（chloroquine，CQ，批號200-191-2）購自北京謹明生物科技有限公司；SHH過表達質粒及空載質粒購自吉滿生物科技（上海）有限公司；McCoys 5A培養基購自美國Gibco公司；一步法熒光定量PCR試劑盒、總RNA提取試劑盒購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；EdU染色增殖試劑盒、CCK-8試劑盒、TUNEL檢測試劑盒、結晶紫溶液、兔源抗人Anti-LC3、Beclin1、SHH、GAPDH一抗，HRP偶聯山羊抗兔二抗購自英國Abcam公司等。

LD-96A小型酶標儀購自山東萊恩德智能科技有限公司；MF53-M倒置熒光顯微鏡購自山東千司科學儀器有限公司；TE62全濕蛋白電轉印系統、SE400垂直蛋白電泳系統購自美國Amersham公司等。

1.2 方法

1.2.1 麝香酮最佳細胞作用濃度篩選 快速取出凍存的SKOV3細胞，于39.5 ℃水浴內凍融，1 000 r/min離心5 min，洗滌細胞沉淀，加入McCoys 5A培養基（含1%青-鏈霉素雙抗及10%胎牛血清）進行復蘇培養。傳代后接種于96孔板，接種密度為1×104個/孔，培養24 h后，以終濃度0、2、4、8、16、24 μmol/L的麝香酮處理［7］，0 μmol/L麝香酮處理的細胞為對照組，同時設空白對照組（不接種細胞只加入培養基）。48 h后每孔加入20 μL CCK-8試劑繼續培養1.5 h，采用酶標儀于450 nm波長處測定細胞光密度（OD）值，計算細胞存活率。細胞存活率=（麝香酮處理組OD值-空白對照組OD值）/（對照組OD值-空白對照組OD值）×100%，篩選出麝香酮最佳細胞作用濃度進行后續實驗。

1.2.2 SKOV3移植瘤小鼠模型構建及分組 參照文獻［12］構建SKOV3移植瘤小鼠模型。SKOV3細胞傳代后計數并配制1×107個/mL的細胞懸液，將其接種至BALB/c小鼠右腋皮下，每只接種0.1 mL，1周后觀察到小鼠右腋下長出米粒大小腫塊即表示移植瘤模型構建成功。按照隨機數字表法將小鼠分為對照組、麝香酮組、麝香酮+CQ組、麝香酮+空載組、麝香酮+SHH過表達組，每組10只。除對照組外，其余各組于腫瘤部位皮下注射16 mg/kg麝香酮（1.6 g/L麝香酮溶液注射10 mL/kg，1次/d）［7］。同時麝香酮組小鼠腹腔注射10 mL/kg生理鹽水；麝香酮+CQ組小鼠腹腔注射50 mg/kg CQ（5 g/L CQ溶液注射10 mL/kg）［12］；麝香酮+空載組小鼠于腫瘤部位皮下注射空載質粒（注射劑量參考說明書），并腹腔注射10 mL/kg生理鹽水；麝香酮+SHH過表達組小鼠于腫瘤部位皮下注射SHH過表達質粒（注射劑量參考說明書），并腹腔注射10 mL/kg生理鹽水；對照組小鼠分別于腫瘤部位皮下、腹腔注射與麝香酮+SHH過表達組等劑量的生理鹽水，各組小鼠均每隔1 d注射1次，連續處理28 d。

1.2.3 移植瘤小鼠腫瘤體積和質量檢測及標本采集 各組處理完成24 h后，頸椎脫臼處死小鼠，剪開右腋下皮膚剝離出腫瘤組織塊，測量其腫瘤長徑a及短徑b，計算腫瘤體積=（a×b2）/2；用手術剪取下約0.4 g腫瘤組織置于適量RAPI緩沖液內，研碎并勻漿，3 000 r/min離心20 min，收集上清液得到總蛋白樣品液，以BCA法檢測其總蛋白濃度并調至各組相同，分組標記后存在-80 ℃備用；再次剪下約0.4 g腫瘤組織存于液氮備用。

1.2.4 SKOV3細胞分組處理及標本收集 SKOV3傳代后接種于24孔板，接種密度為1×105個/孔，培養24 h后根據隨機數字表法分為對照組、麝香酮組、麝香酮+CQ組、麝香酮+空載組、麝香酮+SHH過表達組。對照組細胞不進行處理，麝香酮組細胞以終濃度16 μmol/L的麝香酮處理，麝香酮+CQ組細胞以終濃度16 μmol/L的麝香酮和5 μmol/L的CQ［12］聯合處理，麝香酮+空載組以終濃度16 μmol/L的麝香酮處理的同時轉染空載質粒，麝香酮+SHH過表達組以終濃度16 μmol/L的麝香酮處理的同時轉染SHH過表達質粒，轉染步驟按照脂質體2000說明進行。處理48 h后收集細胞沉淀，以RAPI緩沖液于冰水浴內裂解2 h，3 000 r/min離心20 min，收集上清液，得到總蛋白樣品液，以BCA法檢測其總蛋白濃度并調至各組相同，分組標記后存于-80 ℃備用；重復上述實驗操作后再次收集各組細胞沉淀存于液氮備用。

1.2.5 EdU及TUNEL染色法分別檢測各組SKOV3細胞增殖、凋亡 （1）EdU染色。SKOV3傳代后接種于24孔板，接種密度為1×105個/孔，培養24 h后分組處理48 h（方法同1.2.4），每組添加適量EdU溶液繼續培養3 h，PBS洗滌、10%甲醛固定細胞，然后按照EdU細胞增殖試劑盒說明進行EdU染色，PBS洗滌、DAPI染色、PBS洗滌后，于熒光顯微鏡下采集細胞圖像，用Image J軟件定量各組細胞（核呈現紅色的EdU陽性細胞與呈藍色的總細胞）數目，計算其增殖率，增殖率=EdU陽性細胞數目/總細胞數目×100%。（2）TUNEL染色。SKOV3傳代后接種于24孔板，接種密度為1×105個/孔，培養24 h后分組處理48 h（方法同1.2.4），PBS洗滌、10%甲醛固定細胞后行TUNEL染色，具體染色按照TUNEL檢測試劑盒說明書進行，PBS洗滌、DAPI染色液孵育10 min、PBS洗滌后，于熒光顯微鏡下采集細胞圖像，用Image J軟件定量各組細胞（核呈現紅色的凋亡細胞與呈藍色的總細胞）數目，計算其凋亡率。凋亡率=凋亡細胞數目/總細胞數目×100%。

1.2.6 細胞劃痕及Transwell侵襲實驗分別檢測各組SKOV3細胞遷移、侵襲 （1）細胞劃痕實驗。SKOV3傳代后接種于12孔板，接種密度為2×105個/孔，培養24 h后，用1 mL槍頭在每孔中央劃出1條直線，將劃痕中細胞沖洗掉后，于顯微鏡下采集細胞圖像，用Image J軟件定量各組劃痕面積并記為S1，然后分組處理細胞48 h（方法同1.2.4），再次測量各組劃痕面積并記為S2，計算各組細胞遷移率。遷移率=（S1-S2）/S1×100%。（2）Transwell侵襲實驗。SKOV3傳代后接種于24孔板，接種密度為1×105個/孔，培養24 h后分組處理48 h（方法同1.2.4），收集細胞計數后每組取出2.5×105個細胞，以不含胎牛血清的McCoys 5A培養基重懸后混勻，接種在24孔Transwell板上室并同時在其下室加入適量含10%胎牛血清的McCoys 5A培養基，培養24 h后以PBS洗滌、10%甲醛固定下室內細胞，結晶紫染色液孵育10 min、PBS洗滌、DAPI染色液孵育10 min、PBS洗滌后，于顯微鏡下采集細胞圖像，用Image J軟件定量各組細胞數目即為侵襲數。

1.2.7 實時熒光定量PCR檢測各組SKOV3細胞及其移植瘤小鼠腫瘤組織SHH表達 取出1.2.2中的腫瘤組織和1.2.4中的細胞沉淀，用總RNA提取試劑盒并按照其說明指導分別提取兩者中總RNA，然后取適量總RNA采用一步法進行實時熒光定量PCR擴增，具體步驟按照一步法熒光定量PCR試劑盒說明書進行。反應條件：95 ℃預變性1 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，42個循環。以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法計算SHH基因相對表達量，引物序列見表1。

1.2.8 免疫印跡法檢測各組SKOV3細胞及其移植瘤小鼠腫瘤組織自噬相關蛋白及SHH蛋白表達 取出1.2.2中的腫瘤組織和1.2.4中的細胞蛋白樣品液，于4 ℃冰箱內放置2 h解凍后，加入適量上樣緩沖液煮沸變性，每組取含20 mg總蛋白的樣品液，于SDS-PAGE濃縮膠內上樣。100 V恒壓下電泳80 min，使蛋白于SDS-PAGE分離膠內按分子質量大小分開，40 mA穩流下濕轉1.5 h，將分離膠內蛋白全部移到PVDF膜上。以5%脫脂奶粉封閉非特異性抗原后將LC3、GAPDH、Beclin-1、SHH蛋白條帶裁下，分別浸入均稀釋2 000倍的兔源LC3、GAPDH、Beclin-1、SHH一抗溶液，4 ℃孵育12 h后以TBST緩沖液洗膜（3次，5 min/次），孵育稀釋1 000倍的HRP偶聯山羊抗兔二抗溶液2 h，TBST緩沖液洗膜（3次，5 min/次），以化學發光試劑孵育顯色，攝制各組檢測蛋白圖像后用Image J軟件定量其灰度，算出其與內參GAPDH的灰度比值后統計分析其相對表達量。

1.3 統計學方法 采用GraphPad Prism 8.0軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差（[[x] ±s

]）表示，多組間差異比較采用單因素方差分析，組間多重比較行SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 麝香酮對SKOV3細胞存活率的影響 2、4、8、16、24 μmol/L的麝香酮均可降低SKOV3細胞存活率（P＜0.05），見圖1。半數抑制濃度為15.30 μmol/L，選擇16 μmol/L的麝香酮進行后續實驗。

2.2 麝香酮對SKOV3移植瘤小鼠腫瘤體積與質量的影響 與對照組相比，麝香酮組小鼠腫瘤體積和質量降低（P＜0.05）。與麝香酮組相比，麝香酮+CQ組、麝香酮+SHH過表達組小鼠腫瘤體積和質量升高（P＜0.05）；麝香酮+空載組小鼠腫瘤體積和質量差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

2.3 麝香酮對SKOV3細胞增殖與凋亡的影響 與對照組相比，麝香酮組細胞增殖率降低，凋亡率升高（P＜0.05）。與麝香酮組相比，麝香酮+CQ組、麝香酮+SHH過表達組細胞增殖率升高，凋亡率降低（P＜0.05）；麝香酮+空載組細胞凋亡率、增殖率差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖2、3，表3。

2.4 麝香酮對SKOV3細胞遷移與侵襲的影響 與對照組相比，麝香酮組細胞遷移率與侵襲數目降低（P＜0.05）。與麝香酮組相比，麝香酮+CQ組、麝香酮+SHH過表達組細胞遷移率與侵襲數目升高（P＜0.05）；麝香酮+空載組細胞遷移率與侵襲數目差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖4、5，表4。

2.5 麝香酮對SKOV3細胞及其移植瘤小鼠腫瘤組織自噬的影響 與對照組相比，麝香酮組細胞及小鼠腫瘤組織LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1蛋白表達水平升高（P＜0.05）。與麝香酮組相比，麝香酮+CQ組、麝香酮+SHH過表達組細胞及小鼠腫瘤組織LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1蛋白表達水平降低（P＜0.05）；麝香酮+空載組細胞及小鼠腫瘤組織LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1蛋白表達水平差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖6、表5。

2.6 麝香酮對SKOV3細胞及其移植瘤小鼠腫瘤組織SHH表達的影響 與對照組相比，麝香酮組細胞及小鼠腫瘤組織SHH mRNA、蛋白表達水平降低（P＜0.05）。與麝香酮組相比，麝香酮+SHH過表達組細胞及小鼠腫瘤組織SHH mRNA、蛋白表達水平升高（P＜0.05）；麝香酮+CQ組、麝香酮+空載組細胞及小鼠腫瘤組織SHH mRNA、蛋白表達水平差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖7、表6。

3 討論

卵巢癌在我國的發病率較高，目前主要依靠手術切除后輔以放化療進行綜合治療，但因耐藥性、擴散轉移、復發等原因易導致治療失敗，因而迫切需要探尋更有效的新型治療手段［13-14］。麝香酮是提取自珍貴中藥麝香的一種3-甲基十五酮化合物，具有顯著的抗腫瘤、逆轉多藥耐藥性等藥理作用，可通過減弱肺癌細胞順鉑耐藥性發揮顯著的抗癌功效［5-7，15］。本研究結果顯示，以麝香酮處理SKOV3細胞及其移植瘤小鼠，細胞增殖率、遷移率、侵襲數目以及小鼠腫瘤體積和質量降低，細胞凋亡率升高。既往研究亦發現，麝香酮作為惡性腫瘤治療藥西黃丸的主要起效成分之一，能通過改善腫瘤微環境而起到抗癌作用［16］。本研究證實麝香酮可降低卵巢癌細胞增殖、遷移及侵襲活性，促使其凋亡，抑制其在小鼠體內生長，最終延緩卵巢癌惡性進展，提示麝香酮在卵巢癌臨床治療中極具開發價值。

自噬可通過降解受損細胞器以修復惡變細胞，并促進腫瘤細胞凋亡，進而發揮腫瘤抑制作用［3-4］。本研究結果顯示，以麝香酮處理SKOV3細胞及其移植瘤小鼠的腫瘤組織自噬相關蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及Beclin-1蛋白表達水平升高。既往研究發現，激活自噬可抑制卵巢癌細胞耐藥性、增殖和遷移，發揮明顯抗癌作用［17-18］。本研究表明自噬參與麝香酮對卵巢癌惡性進展的抑制過程，且麝香酮可增強自噬；以自噬抑制劑CQ和麝香酮聯合處理SKOV3細胞及其移植瘤小鼠，與麝香酮單獨處理相比，可減弱麝香酮對卵巢癌細胞增殖、體內生長、遷移及侵襲的抵抗作用，消除其對卵巢癌細胞凋亡的促進作用，最終逆轉麝香酮對卵巢癌惡性進展的抑制作用，提示麝香酮是通過誘導自噬抑制卵巢癌惡性進展的。

SHH可通過調控細胞增殖、凋亡、遷移及自噬介導腫瘤發生及惡性進展，抑制其表達可顯著降低高級別漿液性卵巢癌細胞的運動性、遷移性，并抑制其腫瘤干細胞在裸鼠體內生長［19］，還可提高髓母細胞瘤小鼠的存活率［20］。本研究結果顯示，麝香酮處理后SKOV3細胞及小鼠腫瘤組織SHH mRNA及蛋白表達水平降低。既往研究發現，抑制SHH信號可誘導自噬，并抑制卵巢癌細胞增殖、遷移及體內生長［12］。而本研究證實麝香酮亦可抑制SHH信號，提示SHH參與麝香酮對卵巢癌惡性進展的抑制過程；以麝香酮處理SKOV3細胞及其移植瘤小鼠的同時過表達SHH，可減弱麝香酮對卵巢癌細胞增殖、體內生長、遷移及侵襲的抵抗作用，消除其對卵巢癌細胞自噬與凋亡的增強作用，最終逆轉麝香酮對卵巢癌惡性進展的抑制作用，提示麝香酮誘導自噬來抑制卵巢癌惡性進展是通過下調SHH實現的。

綜上所述，麝香酮可通過下調SHH而誘導卵巢癌細胞自噬，進而降低其增殖、體內生長、遷移及侵襲活性，促進其凋亡，抑制其惡性進展，對卵巢癌發揮抗腫瘤作用，通過抑制SHH信號誘導自噬是其藥理機制之一。本研究揭示了麝香酮在卵巢癌臨床治療中具有開發應用潛力，對于改進卵巢癌治療技術具有積極價值。

參考文獻

［1］ PORTER R，MATULONIS U A. Immunotherapy for ovarian cancer［J］. Clin Adv Hematol Oncol，2022，20（4）：240-253.

［2］ KHANLARKHANI N，AZIZI E，AMIDI F，et al. Metabolic risk factors of ovarian cancer：a review［J］. JBRA Assist Reprod，2022，26（2）：335-347. doi：10.5935/1518-0557.20210067.

［3］ FENG C，YUAN X X. Role of autophagy and its regulation by noncoding RNAs in ovarian cancer［J］. Exp Biol Med，2023：15353702231151958. doi：10.1177/15353702231151958.

［4］ VIDONI C，FERRARESI A，VALLINO L，et al. Glycolysis inhibition of autophagy drives malignancy in ovarian cancer：exacerbation by IL-6 and attenuation by resveratrol［J］. Int J Mol Sci，2023，24（2）：1723. doi：10.3390/ijms24021723.

［5］ 齊娜，段文娟，李雅婧，等. 麝香酮藥理作用的研究進展［J］. 世界科學技術-中醫藥現代化，2020，22（8）：3042-3047. QI N，DUAN W J，LI Y J，et al. Research Progress on the Pharmacological Action of Muscone［J］. Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology，2020，22（8）：3042-3047. doi：10.11842/wst.20181223004.

［6］ ZHAO Y R，TAO S X，WANG Q，et al. A network-based pharmacological study on the mechanism of action of muscone in breast cancer［J］. Transl Cancer Res，2022，11（5）：1195-1206. doi：10.21037/tcr-22-667.

［7］ 盧鵬，樊晶晶，羅旭，等. 麝香酮對肺癌細胞的順鉑耐藥和小鼠體內的腫瘤生長的作用［J］. 廣西醫科大學學報，2020，37（11）：1948-1953. LU P，FAN J J，LUO X，et al. The effect of Muscone on lung cancer cells resistance to cisplatin and tumor growth in mice［J］. J Guangxi Med Univ，2020，37（11）：1948-1953. doi：10.16190/j.cnki.45-1211/r.2020.11.003.

［8］ ZHANG M，TAO Z Y，GAO L J，et al. Toosendanin inhibits colorectal cancer cell growth through the Hedgehog pathway by targeting Shh［J］. Drug Dev Res，2022，83（5）：1201-1211. doi：10.1002/ddr.21951.

［9］ LONDERO A P，ORSARIA M，VIOLA L，et al. Survivin，sonic hedgehog，krüppel-like factors，and p53 pathway in serous ovarian cancer：an immunohistochemical study［J］. Hum Pathol，2022，127：92-101. doi：10.1016/j.humpath.2022.06.023.

［10］ 趙飛，于新平，趙涵，等. GLI1及Shh在卵巢型子宮內膜異位癥惡變過程中的表達及其意義［J］. 中華婦產科雜志，2022，57（2）：125-132. ZHAO F，YU X P，ZHAO H，et al. Expression and significance of GLI1 and Shh in the malignant transformation of ovarian endometriosis［J］. Chin J Obstet Gynecol，2022，57（2）：125-132. doi：10.3760/cma.j.cn112141-20211219-00736.

［11］ ZHANG X Y，LIU Q B，ZHANG T T，et al. Bone-targeted nanoplatform enables efficient modulation of bone tumor microenvironment for prostate cancer bone metastasis treatment［J］. Drug Deliv，2022，29（1）：889-905. doi：10.1080/10717544.2022.2050845.

［12］ PAN Y B，ZHOU J N，ZHANG W D，et al. The Sonic Hedgehog signaling pathway regulates autophagy and migration in ovarian cancer［J］. Cancer Med，2021，10（13）：4510-4521. doi：10.1002/cam4.4018.

［13］ NAKAI H，MATSUMURA N. The roles and limitations of bevacizumab in the treatment of ovarian cancer［J］. Int J Clin Oncol，2022，27（7）：1120-1126. doi：10.1007/s10147-022-02169-x.

［14］ BOSE S，SAHA P，CHATTERJEE B，et al. Chemokines driven ovarian cancer progression，metastasis and chemoresistance：potential pharmacological targets for cancer therapy［J］. Semin Cancer Biol，2022，86（Pt 2）：568-579. doi：10.1016/j.semcancer.2022.03.028.

［15］ 王志，謝建絮，李婉斯，等. 麝香及西黃方中麝香酮在正常、乳腺癌癌前病變大鼠體內藥動學的比較［J］. 中成藥，2020，42（10）：2545-2550. WANG Z，XIE J X，LI W S，et al. Comparison of in vivo pharmacokinetics of muscone from Moschus and Xihuang Decoction in normal rats and rats with precancerous lesions of breast cancer［J］. Chin Tradit Pat Med，2020，42（10）：2545-2550. doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2020.10.001.

［16］ 任瑤，江一鳴，項蓉蓉，等. 西黃丸組分中藥調節腫瘤微環境中Treg細胞PI3K/AKT通路的抗腫瘤作用機制研究［J］. 藥物評價研究，2019，42（3）：437-443. REN Y，JIANG Y M，XIANG R R，et al. Antitumor mechanism of Xihuang Pills component-based Chinese medicine by regulating Treg cells PI3K/AKT pathway in tumor microenvironment［J］. Drug Eval Res，2019，42（3）：437-443. doi：CNKI：SUN：YWPJ.0.2019-03-010.

［17］ CHEN S，GAO Y，ZHU P，et al. Anti-cancer drug anlotinib promotes autophagy and apoptosis in breast cancer［J］. Front Biosci （Landmark Ed），2022，27（4）：125. doi：10.31083/j.fbl2704125.

［18］ ZHANG M J，YUE H D，HUANG X，et al. Novel platinum nanoclusters activate PI3K/AKT/mTOR signaling pathway-mediated autophagy for cisplatin-resistant ovarian cancer therapy［J］. ACS Appl Mater Interfaces，2022，14（43）：48502-48514. doi：10.1021/acsami.2c15143.

［19］ SNEHA S，NAGARE R P，SIDHANTH C，et al. The hedgehog pathway regulates cancer stem cells in serous adenocarcinoma of the ovary［J］. Cell Oncol，2020，43（4）：601-616. doi：10.1007/s13402-020-00504-w.

［20］ CHEN L P，LI Y，SONG Z H，et al. O-GlcNAcylation promotes cerebellum development and medulloblastoma oncogenesis via SHH signaling［J］. Proc Natl Acad Sci USA，2022，119（34）：e2202821119. doi：10.1073/pnas.2202821119.