濕生扁蕾呫噸酮聯(lián)合益生菌調(diào)控TGF-β1/Smads通路及炎性因子干預(yù)大鼠結(jié)腸炎癌轉(zhuǎn)化

盧年華 靳展洪葉 張茜 張萌 李俊珂 趙慧巧 張永鵬

摘要：目的 基于TGF-β1/Smads通路及炎性因子探討濕生扁蕾呫噸酮（GPX）聯(lián)合益生菌干預(yù)結(jié)腸炎癌轉(zhuǎn)化的機(jī)制。方法 將90只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組［飲用右旋糖酐硫酸鈉（DSS）3 d］和給藥組。其中，模型組又分為炎癥期組、炎癌前期組［注射二甲基肼（DMH）4周］、炎癌中期組（注射DMH 13周）、炎癌末期組（注射DMH 21周）；給藥組是在炎癌末期組的基礎(chǔ)上邊建模邊給藥且根據(jù)所給藥物再分組，即飲用DSS 3 d，在飲用DSS的第1天就開始灌胃各組藥物，每日1次，持續(xù)8周，分別為GPX 69.3 mg/kg（GPX組）、益生菌400 mg/kg（益生菌組）、GPX 69.3 mg/kg+益生菌400 mg/kg（聯(lián)合組）、沙利度胺13.5 mg/kg（沙利度胺組）。對各組疾病活動指數(shù)（DAI）、結(jié)腸長度和濕質(zhì)量指數(shù)進(jìn)行比較；觀察大鼠結(jié)腸瘤體特征；HE染色觀察結(jié)腸病理變化；Western blot和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)分別檢測轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β1，Smad4，Smad7和白細(xì)胞介素（IL）-6、腫瘤壞死因子（TNF）-α表達(dá)。結(jié)果 與炎癌末期組比較，各給藥組結(jié)腸長度增加，結(jié)腸壁厚、濕質(zhì)量指數(shù)與瘤體最大直徑降低，TGF-β1和Smad4蛋白表達(dá)水平升高，Smad7、IL-6、TNF-α水平降低，GPX組與聯(lián)合組DAI得分降低（P＜0.05），GPX組、益生菌組和聯(lián)合組的腸黏膜層結(jié)構(gòu)和形態(tài)改善，結(jié)腸隱窩結(jié)構(gòu)與杯狀細(xì)胞數(shù)量增加；與益生菌組和GPX組比較，聯(lián)合組結(jié)腸壁厚、結(jié)腸濕質(zhì)量指數(shù)、瘤體數(shù)量降低，TGF-β1和Smad4蛋白表達(dá)水平升高，IL-6、TNF-α水平降低（P＜0.05）。結(jié)論 GPX和益生菌聯(lián)用可抑制結(jié)腸炎癌轉(zhuǎn)化，其作用機(jī)制可能與調(diào)控TGF-β1/Smads通路和抑制IL-6、TNF-α表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：結(jié)直腸腫瘤；結(jié)腸炎；生物轉(zhuǎn)化；濕生扁蕾呫噸酮；益生菌；TGF-β1/Smads通路

中圖分類號：R735.35文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOI：10.11958/20230462

Gentianopsis paludosa xanthone combined with probiotics inhibits colon inflammation-tumor transformation in rats by regulating TGF-β1/Smads pathway and inflammatory factors

Abstract： Objective To investigate the mechanism of Gentianopsis paludosa xanthone （GPX） combined with probiotics in the intervention of colon inflammation-tumor transformation in rats by regulating TGF-β1/Smads pathway and inflammatory factors. Methods Ninety rats were divided into the normal group， the model group [drinking sodium dextran sulfate （DSS） for 3 days] and the intervention group by random number table method. The model group was subdivided into the inflammatory stage group， the pre-inflammatory cancer group （DMH injection for 4 weeks）， the intermediate inflammatory cancer group （DMH injection for 13 weeks） and the advanced inflammatory cancer group （DMH injection for 21 weeks）. The administration group was subdivided into the groups （after the first day of drinking DSS， drugs for each group were given by gavage once a day for 8 weeks） on the basis of the advanced inflammatory cancer group， including the GPX group （GPX 69.3 mg/kg）， the probiotic group， the combined group （GPX+probiotics 400 mg/kg） and the thalidomide group （thalidomide 13.5 mg/kg）. The disease activity index （DAI）， colon length and wet mass index were compared between all groups. Characteristics of colon tumors were observed， and pathological changes of colon were observed by HE staining. The expression levels of transforming growth factor （TGF） -β1， Smad4， Smad7， interleukin （IL）-6 and tumor necrosis factor （TNF） -α were detected by Western blot assay and enzyme-linked immunosorbent assay， respectively. Results Compared with the advanced inflammatory cancer group， the administration groups showed an increase in colon length， the expression levels of TGF-β1 and Smad4 protein， a decrease in colon wall thickness， wet mass index， maximum tumor diameter， the levels of Smad7， IL-6， TNF-α， and DAI score decreased in the GPX group and the combined group （P＜0.05）. The structure and morphology of intestinal mucosa were improved in the GPX group， the probiotic group and the combination group， and the structure of colonic crypt and goblet cell number were increased. Compared with the probiotic group and the GPX group， the colon wall thickness， colon wet mass index and tumor number were decreased， the protein expression levels of TGF-β1 and Smad4 were increased， and levels of IL-6 and TNF-α were decreased in the combination group （P＜0.05）. Conclusion GPX combined with probiotics could inhibit the transformation of colon inflammation-tumor， and the mechanism may be related to the regulation of TGF-β1/Smads pathway and the inhibition of pro-inflammatory factors of IL-6 and TNF-α.

Key words： colorectal neoplasms; colitis; biotransformation; Gentianopsis paludosa xanthone; probiotics; TGF-β1/Smads pathway

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）是一種炎癥性腸病，主要伴腹痛、腹瀉、便血等癥狀［1］。炎癥是一種正常的生理反應(yīng)，在組織損傷愈合過程中發(fā)揮重要作用。然而對于炎癥性腸病而言，炎癥反應(yīng)會導(dǎo)致正常細(xì)胞突變和表觀遺傳變化，結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)腸癌（CAC）的發(fā)病風(fēng)險升高［2］。目前，關(guān)于結(jié)腸炎癌轉(zhuǎn)化發(fā)生的確切分子機(jī)制尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β1/Smads信號通路、白細(xì)胞介素（IL）-6和腫瘤壞死因子（TNF）-α在結(jié)腸炎癌轉(zhuǎn)化中扮演重要角色，TGF-β1與Smad4的條件性缺失可刺激細(xì)胞因子分泌，加劇炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致炎癥驅(qū)動的癌癥發(fā)生［3-4］；IL-6和TNF-α能夠通過抑制免疫反應(yīng)、聚集炎癥細(xì)胞，加重炎癥反應(yīng)，在慢性炎癥介導(dǎo)的結(jié)腸癌發(fā)生中起關(guān)鍵作用［5］。濕生扁蕾呫噸酮（Gentianopsis paludosa xanthone，GPX）是從龍膽科植物濕生扁蕾中分離得到的活性成分。濕生扁蕾提取物可抑制UC纖維化，抑制人結(jié)腸腺癌細(xì)胞SW480增殖，改善腫瘤微環(huán)境［6-7］。目前，關(guān)于GPX對結(jié)腸炎癌轉(zhuǎn)化的作用研究較少。本研究通過建立大鼠結(jié)腸炎癌轉(zhuǎn)化模型，探究GPX聯(lián)合益生菌抑制結(jié)腸炎癌轉(zhuǎn)化的作用及與TGF-β1/Smads信號通路和炎性因子IL-6、TNF-α的關(guān)聯(lián)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 90只SPF級Wistar雄性大鼠，體質(zhì)量（180±5）g，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司［SCXK（京）2019-0010］，飼養(yǎng)于河北北方學(xué)院生命科學(xué)中心［SYXK（冀）2019-004］，普通維持飼料（0205SH0305A，斯貝福生物技術(shù)有限公司），自然光照、溫度10～26 ℃、濕度18%～50%。實(shí)驗(yàn)經(jīng)河北北方學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物福利倫理審查委員會審批（2020-2-013-S）。

1.1.2 試劑與儀器 右旋糖酐硫酸鈉（DSS，分子質(zhì)量35～50 ku）、二甲基肼（DMH）均購自湖北萬得化工有限公司；RIPA裂解液、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、ECL Plus超敏發(fā)光液、蛋白上樣緩沖液、兔抗鼠Smad7抗體，TNF-α、IL-6酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測試劑盒均購自北京索萊寶生物科技有限公司；兔抗鼠TGF-β1抗體、Smad4抗體、羊抗兔二抗均購自博士德生物工程有限公司；Marker購自碧云天生物技術(shù)有限公司；益生菌（每克含1 012.5億活菌，VSL#3）購自Alfasigma公司；沙利度胺購自常州制藥廠有限公司；ChampChemi 610蛋白凝膠成像系統(tǒng)購自北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司；電泳儀購自美國Bio-rad公司；HMR-1手持組織研磨儀購自上海滬析實(shí)業(yè)有限公司；KD-BM生物組織包埋機(jī)、KD-BL冷凍臺、KD-T組織攤烤片機(jī)、KD2258切片機(jī)均購自科迪儀器設(shè)備有限公司；ECLIPSE顯微鏡購自日本Nikon公司；JC-MB68酶標(biāo)儀購自華業(yè)分析儀器有限公司。

1.1.3 GPX制備 濕生扁蕾全草采集于張家口市崇禮區(qū)，經(jīng)河北北方學(xué)院中藥方劑教研室鑒定為Gentianopsis paludosa（Hook.f.）Ma.，經(jīng)自然陰干，按照既往提取和分離GPX工藝［6，8］，稱取濕生扁蕾全草500 g，加4 L 95%乙醇，加熱回流提取2次，每次1.5 h，減壓回收乙醇，得到的流浸膏加適量雙蒸水混懸，DM130型大孔吸附樹脂純化后干燥，得到含量為51.0%的GPX粉末，4 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 分組與模型建立 將90只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為9組，每組10只。包括1個正常組、4個模型組和4個給藥組。4個模型組包括炎癥期組（飲用DSS 3 d）、炎癌前期組（飲用DSS 3 d+注射DMH 4周）、炎癌中期組（飲用DSS 3 d+注射DMH 13周）、炎癌末期組（飲用DSS 3 d+注射DMH 21周）。4個給藥組是在炎癌末期組的基礎(chǔ)上邊建模邊給藥，即在飲用DSS第1天開始灌胃藥物，每日1次，持續(xù)8周；劑量分別為GPX 69.3 mg/kg（GPX組）、益生菌400 mg/kg（益生菌組）、GPX 69.3 mg/kg+益生菌400 mg/kg（聯(lián)合組）、沙利度胺13.5 mg/kg（沙利度胺組）；以上各組別藥物均參考成人劑量，采用體表面積換算。DSS質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%，大鼠每日飲用30 mL，DMH采用頸部皮下注射，25 mg/kg，1次/周。建模結(jié)束時，各給藥組禁食不禁水1 d，采用戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉后，結(jié)腸取材進(jìn)行觀察和檢測。正常組和各模型組同期給予同體積的生理鹽水自由飲用和頸部皮下注射。此外，各組大鼠每日均給予15 g普通飼料喂養(yǎng)和自由飲水。

1.2.2 大鼠基礎(chǔ)指標(biāo)觀察 參照文獻(xiàn)［9］，通過觀察大鼠體質(zhì)量、大便性狀及便血情況，對各組大鼠進(jìn)行疾病活動指數(shù)（DAI）評分，評估大鼠結(jié)腸炎癌轉(zhuǎn)化中疾病活動情況；剪取大鼠全結(jié)腸，測量結(jié)腸長度；每只剪取近端、中端和遠(yuǎn)端結(jié)腸3個非瘤部位，石蠟包埋切片后采用光學(xué)顯微鏡比例尺量取結(jié)腸黏膜上皮至漿膜層厚度，計算平均值為結(jié)腸壁厚；沿腸系膜剪開結(jié)腸，除去內(nèi)容物后稱取全結(jié)腸質(zhì)量，結(jié)腸濕質(zhì)量指數(shù)（mg/mm）=全結(jié)腸濕質(zhì)量（mg）/結(jié)腸全長（mm）；觀察大鼠結(jié)腸瘤體特征，比較各組瘤體大小（最大瘤體直徑）和數(shù)量。

1.2.3 結(jié)腸組織HE染色 采集各組大鼠結(jié)腸組織（除正常組外，其余各組選取結(jié)腸瘤體明顯處）。4%多聚甲醛固定，乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋切片4 μm，二甲苯和梯度乙醇脫蠟，蒸餾水漂洗，自制Weigert氏鐵蘇木素染液染色，1%鹽酸乙醇分化，0.5%氨水返藍(lán)，伊紅染色，脫水后，中性樹膠固定封片，觀察各組結(jié)腸組織病理形態(tài)。

1.2.4 Western blot檢測TGF-β1、Smad4和Smad7蛋白表達(dá) 取各組大鼠結(jié)腸組織，生理鹽水漂凈污物，正常組取中段結(jié)腸，炎癥期組大鼠取潰瘍充血明顯處，荷瘤大鼠結(jié)腸取瘤體，研磨儀粉碎組織，經(jīng)RIPA試劑裂解，12 000 r/min離心5 min，取上清液置于EP管，100 ℃水浴加熱，加入上樣緩沖液得到蛋白上樣液。每孔加樣15 μL，采用SDS-PAGE制備凝膠和電泳。電泳條件：150 V 2 h，轉(zhuǎn)膜條件：100 V 1 h，5%脫脂奶粉室溫封閉2.5 h，兔抗鼠TGF-β1抗體（1∶1 500）、Smad4抗體（1∶2 000）和Smad7抗體（1∶1 000）室溫各孵育2 h，TBST洗膜，羊抗兔二抗（1∶10 000）室溫孵育2 h，ECL化學(xué)發(fā)光顯影，Image J對各組條帶灰度值進(jìn)行定量分析。

1.2.5 ELISA檢測血清TNF-α和IL-6水平 取腹主動脈血1.5 mL，室溫自然凝固30 min，4 ℃、1 000 r/min離心15 min，吸取血清，置于EP管，-20 ℃保存。根據(jù)ELISA試劑盒說明檢測TNF-α和IL-6水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 25.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以[[x] ±s

]表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠基礎(chǔ)指標(biāo)比較 與正常組比較，炎癥期組的結(jié)腸濕質(zhì)量指數(shù)和DAI評分升高，炎癌前期組、炎癌中期和炎癌末期組的結(jié)腸長度縮短，壁厚增加，結(jié)腸濕質(zhì)量指數(shù)和DAI評分升高（P＜0.05）；與炎癌末期組比較，各給藥組結(jié)腸長度增加、結(jié)腸壁厚與濕質(zhì)量指數(shù)降低，且GPX組與聯(lián)合組DAI得分降低（P＜0.05）；與益生菌組和GPX組比較，聯(lián)合組結(jié)腸壁變薄，結(jié)腸濕質(zhì)量指數(shù)降低（P＜0.05）；與GPX組比較，聯(lián)合組結(jié)腸長度和DAI評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

2.2 各組大鼠結(jié)腸瘤體比較 見圖1，表2。炎癥期組結(jié)腸組織透明柔軟，為炎性水腫，結(jié)腸潰瘍面出血顯著；炎癌前期組結(jié)腸局部增厚，呈硬斑狀，未見瘤體；炎癌中期組可見結(jié)腸瘤體，提示結(jié)腸炎癌轉(zhuǎn)化建模成功；炎癌末期組結(jié)腸瘤體緊貼腸壁，泛白，呈不規(guī)則菜花狀，局部密集，彼此嵌套生長，觸感較硬；GPX組、益生菌組和聯(lián)合組結(jié)腸瘤體呈肉芽狀，分布稀疏，觸感軟、有彈性。與正常組比較，炎癌中、末期組瘤體最大直徑與數(shù)量升高（P＜0.05）；與炎癌末期組比較，各給藥組瘤體最大直徑均降低（P＜0.05）；與益生菌組和GPX組比較，聯(lián)合組瘤體數(shù)量減少（P＜0.05）；聯(lián)合組與GPX組，沙利度胺與益生菌組分別比較，瘤體最大直徑差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3 各組結(jié)腸炎癌轉(zhuǎn)化病理學(xué)變化 正常組結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)形態(tài)清晰，無炎性浸潤；炎癥期結(jié)腸黏膜破潰明顯，大量炎性細(xì)胞充斥于黏膜層且向下侵入黏膜下層，局部穿過固有肌層，柱狀細(xì)胞和腸腺消失；炎癌前期、炎癌中期和沙利度胺組腸黏膜固有層空泡化明顯，且伴炎性細(xì)胞浸潤；炎癌末期組瘤體形態(tài)顯著，可見強(qiáng)異型腺管增生，隱窩分支扭曲，表現(xiàn)為管狀中高度分化腺瘤。與炎癌末期組比較，GPX組、益生菌組和聯(lián)合組的腸黏膜層結(jié)構(gòu)和形態(tài)顯著改善，結(jié)腸隱窩結(jié)構(gòu)與杯狀細(xì)胞數(shù)量增加，腸腺、單層柱狀上皮細(xì)胞恢復(fù)，隱窩異型分支減少，見圖2。

2.4 各組結(jié)腸組織TGF-β1、Smad4和Smad7蛋白水平 與正常組比較，TGF-β1和Smad4蛋白表達(dá)在炎癌前期、炎癌中期、炎癌末期組逐漸降低（P＜0.05），而Smad7蛋白表達(dá)逐漸升高（P＜0.05）；與炎癌末期組比較，各給藥組TGF-β1和Smad4蛋白表達(dá)升高，Smad7蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）；與益生菌組和GPX組比較，聯(lián)合組TGF-β1和Smad4蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），見表3、圖3。

2.5 各組大鼠血清中IL-6與TNF-α水平比較 與正常組比較，炎癥期組IL-6與TNF-α水平升高；與炎癥期組比較，炎癌前期組IL-6與TNF-α水平降低（P＜0.05）；與炎癌前期組比較，炎癌中期和炎癌末期組IL-6與TNF-α水平升高（P＜0.05）；與炎癌末期組比較，各給藥組IL-6、TNF-α水平降低（P＜0.05）；與益生菌組和GPX組比較，聯(lián)合組IL-6、TNF-α水平降低（P＜0.05），見表4。

3 討論

濕生扁蕾傳統(tǒng)上屬于藏藥，在藏語或藏醫(yī)藥本草著作中常被稱為“機(jī)合滴”“甲蒂”“松幾斗”等，民間常用于治療“赤巴”“小兒腹瀉”“時疫熱”等癥［10］。目前對該藥在抗UC腸纖維化和抑制結(jié)腸上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化方面開展了相應(yīng)探索［11-12］，但尚缺少對結(jié)腸炎癌轉(zhuǎn)化的研究。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)DSS聯(lián)合DMH建模后，結(jié)腸瘤體從炎癌中期即開始出現(xiàn)，表明結(jié)腸炎癌轉(zhuǎn)化建模成功；同時GPX與益生菌單獨(dú)和聯(lián)合用藥均可增加炎癌轉(zhuǎn)化末期結(jié)腸長度，降低結(jié)腸壁厚和結(jié)腸濕質(zhì)量指數(shù)。通過觀察各組結(jié)腸瘤體和結(jié)腸病理學(xué)變化，GPX與益生菌可有效抑制結(jié)腸炎癌轉(zhuǎn)化中瘤體的大小與數(shù)量，恢復(fù)結(jié)腸隱窩和增加杯狀細(xì)胞數(shù)量，減少結(jié)腸隱窩分支扭曲，尤其是聯(lián)合組干預(yù)結(jié)腸炎癌轉(zhuǎn)化作用顯著，可能是GPX與益生菌發(fā)揮了潛在的協(xié)同效應(yīng)有關(guān)。

TGF-β1是一種多效性細(xì)胞因子，幾乎靶向所有腸黏膜細(xì)胞。Means等［4］研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β受體傳導(dǎo)下游經(jīng)典信號依賴于Smad4，通常單個抑癌因子缺失很少導(dǎo)致癌癥發(fā)生，但僅Smad4的缺失足以促使炎癥驅(qū)動的結(jié)腸癌發(fā)生。Troncone等［13］研究發(fā)現(xiàn)，Smad7可負(fù)性調(diào)節(jié)TGF-β1/Smads通路而參與結(jié)腸癌的發(fā)生，藥物抑制Smad7可恢復(fù)TGF-β1功能，減輕UC患者和小鼠炎癥。本研究結(jié)果顯示，GPX與益生菌單一或聯(lián)合用藥可以升高TGF-β1與Smad4的表達(dá)，同時降低Smad7水平，表明GPX與益生菌可能作用于TGF-β1/Smads通路而干預(yù)結(jié)腸炎癌轉(zhuǎn)化。

IL-6和TNF-α為常見炎性因子，TGF-β1具有的抗炎效應(yīng)可以降低二者水平［14］。抑制炎癥性腸病患者IL-6和TNF-α水平不僅可減輕腸道炎癥，還可降低結(jié)腸癌的發(fā)生風(fēng)險［15-16］。本研究結(jié)果顯示，GPX與益生菌可抑制結(jié)腸炎癌轉(zhuǎn)化進(jìn)程中炎性因子IL-6、TNF-α的表達(dá)，表明GPX與益生菌可能通過抑制IL-6、TNF-α的釋放以延緩結(jié)腸炎癌轉(zhuǎn)化。

綜上所述，GPX與益生菌聯(lián)合可能通過調(diào)控TGF-β1/Smads通路和抑制IL-6、TNF-α炎性因子表達(dá)進(jìn)而抑制結(jié)腸炎癌轉(zhuǎn)化。但由于結(jié)腸炎癌轉(zhuǎn)化機(jī)制復(fù)雜，GPX與益生菌對結(jié)腸炎癌轉(zhuǎn)化的作用仍需進(jìn)一步探索。

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