BMAL1減輕H2O2誘導的心肌細胞損傷機制研究

易娜 肖雯 田源 袁李禮

摘要：目的 探討腦和肌肉組織芳香烴受體核轉運蛋白的類似蛋白1（BMAL1）通過核因子E2相關因子2（NRF2）調節活性氧（ROS）/NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NLRP3）炎癥小體通路對過氧化氫（H2O2）誘導的心肌細胞損傷的影響。方法 體外培養H9c2細胞和BMAL1穩定過表達的H9c2細胞，建立H2O2誘導的H9c2細胞損傷模型，并將細胞分為對照（Control）組、H2O2組、BMAL1過表達（BMAL1-OE）組、BMAL1過表達+H2O2（BMAL1-OE+H2O2）組、BMAL1過表達+NRF2抑制劑（BMAL1-OE+ML385）組、BMAL1過表達+NRF2抑制劑+H2O2（BMAL1-OE+ML385+H2O2）組。采用CCK-8法檢測細胞活力，熒光探針2'，7'-二氯熒光素二乙酸酯檢測ROS生成，Western blot檢測BMAL1、NRF2和NLRP3蛋白表達，酶聯免疫吸附試驗法檢測白細胞介素（IL）-1β釋放。結果 與Control組相比，H2O2組H9c2心肌細胞活力減弱，ROS生成增多，BMAL1和NRF2蛋白表達水平降低，NLRP3蛋白表達水平升高，IL-1β釋放增多（P＜0.05）；與H2O2組相比，BMAL1-OE+H2O2組H9c2心肌細胞活力升高，ROS生成減少，BMAL1和NRF2蛋白表達水平升高，NLRP3蛋白表達水平降低，IL-1β釋放減少（P＜0.05）。與BMAL1-OE+H2O2組相比，BMAL1-OE+ML385+H2O2組H9c2心肌細胞活力減弱，ROS生成增多，NLRP3蛋白表達水平升高，IL-1β釋放增多（P＜0.05）。結論 BMAL1可減輕H2O2誘導的H9c2心肌細胞損傷，其機制可能與NRF2調節ROS/NLRP3炎癥小體通路有關。

關鍵詞：ARNTL轉錄因子類；NF-E2相關因子2；活性氧；NLR家族，熱蛋白結構域包含蛋白3；腦和肌肉組織芳香烴受體核轉運蛋白的類似蛋白1；炎癥小體

中圖分類號：R542.2文獻標志碼：ADOI：10.11958/20231027

Mechanism of BMAL1 attenuating H2O2-induced cardiomyocyte injury

Abstract： Objective To investigate the effect of BMAL1 on H2O2-induced cardiomyocyte injury through NRF2-regulated ROS/NLRP3 inflammasome pathway. Methods H9c2 cells and H9c2 cells with stable over-expressed BMAL1 were cultured and divided into the control group， the H2O2 group， the BMAL1-OE group， the BMAL1-OE+H2O2 group， the BMAL1-OE+ML385 group and the BMAL1-OE+ML385+H2O2 group. All groups were pre-intervened with corresponding inhibitors， and then treated with 0.2 mmol/L H2O2， except for the control group and the BMAL1-OE group. After the intervention， CCK-8 assay was used to measure cell viability， fluorescent probe DCFH-DA was used to measure ROS generation and Western blot assay was used to detect BMAL1， NRF2 and NLRP3 protein expressions. ELISA was used to determine IL-1β release. Results Compared with the control group， the cell viability was decreased， ROS generation was increased， BMAL1 and NRF2 protein expressions were decreased， NLRP3 expression and IL-1β release were increased in the H2O2 group （P＜0.05）. Compared with the H2O2 group， the cell viability was increased， ROS generation was decreased， BMAL1-OE and NRF2 protein expressions were increased， NLRP3 expression and IL-1β release were decreased in the BMAL1-OE+H2O2 group （P＜0.05）. Compared with the BMAL1-OE+H2O2 group， the cell viability was decreased， ROS generation was increased， NLRP3 expression and IL-1β release were increased in the BMAL1-OE+ML385+H2O2 group （P＜0.05）. Conclusion BMAL1 attenuates H2O2-induced H9c2 cardiomyocyte injury， and its mechanism may be related to the regulation of ROS/NLRP3 inflammasome pathway through NRF2.

Key words： ARNTL transcription factors; NF-E2-related factor 2; reactive oxygen species; NLR family， pyrin domain-containing 3 protein; BMAL1; inflammasome

心血管疾病的發病率和死亡率較高，為我國重要的公共衛生問題［1］。炎癥免疫因素在心血管疾病中發揮重要作用［2］，NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NLRP3）炎癥小體在心血管疾病中的作用受到廣泛關注［3］。多種心血管疾病的危險因素均能激活NLRP3炎癥小體［4］。因此，探討NLRP3炎癥小體通路對心血管疾病的調控有助于尋找新的心肌細胞保護策略和靶點。心血管疾病的發作有晝夜變化的特點。生物鐘相關基因參與心血管疾病的病理生理學過程［5］。本課題組前期研究證實，作為生物鐘晝夜節律調控重要元件之一的腦和肌肉組織芳香烴受體核轉運蛋白的類似蛋白1（BMAL1）可通過核因子E2相關因子2（NRF2）減輕過氧化氫（H2O2）誘導的大鼠心肌細胞氧化應激損傷［6］，但具體機制尚未明確。BMAL1是否通過調控NLRP3炎癥小體通路而減輕心血管疾病時的細胞損傷尚不清楚。本文在前期研究基礎上，選用H2O2誘導的H9c2心肌細胞氧化應激損傷模型，探討BMAL1通過NRF2調節活性氧（ROS）/NLRP3炎癥小體的分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 H9c2心肌細胞和BMAL1穩定過表達的H9c2心肌細胞為本室保存；DMEM培養液、胎牛血清、磷酸鹽緩沖液（PBS）、胰蛋白酶、100×青霉素/鏈霉素購自美國Gibco公司；H2O2購自Sigma公司；細胞計數試劑-8（CCK-8）購自東仁化學公司；ROS檢測試劑盒購自碧云天生物技術有限公司；白細胞介素（IL）-1β酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測試劑盒購自美國Thermo Scientific公司；兔抗大鼠BMAL1、NRF2、NLRP3和GAPDH抗體以及辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗購自Abcam公司；NRF2特異性抑制劑ML385購自MCE公司；全波長多功能酶標儀購自Biotek公司，蛋白電泳分離、轉膜和化學發光成像系統購自Bio-rad公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和模型構建 采用含10%胎牛血清的DMEM培養基培養H9c2細胞。BMAL1穩定過表達的H9c2心肌細胞培養時另添加1 mg/L的嘌呤霉素。采用終濃度為0.2 mmol/L的H2O2誘導H9c2細胞損傷模型，處理24 h后用于后續實驗。

1.2.2 實驗分組 細胞分為對照（H9c2心肌細胞，Control）組、H2O2（0.2 mmol/L H2O2處理H9c2心肌細胞24 h）組、BMAL1過表達（BMAL1穩定過表達的H9c2心肌細胞，BMAL1-OE）組、BMAL1過表達+H2O2（0.2 mmol/L H2O2處理BMAL1穩定過表達的H9c2心肌細胞24 h，BMAL1-OE+H2O2）組、BMAL1過表達+NRF2抑制劑（2 μmol/L ML385預處理BMAL1穩定過表達的H9c2心肌細胞12 h，BMAL1-OE+ML385）組、BMAL1過表達+NRF2抑制劑+H2O2（2 μmol/L ML385預處理BMAL1穩定過表達的H9c2心肌細胞12 h后再予以0.2 mmol/L H2O2繼續處理24 h，BMAL1-OE+ML385+H2O2）組。

實驗分為2個部分：實驗1分組設置為Control組、H2O2組、BMAL1-OE組、BMAL1-OE+H2O2組，研究BMAL1對心肌細胞氧化應激損傷的影響；實驗2分組設置為BMAL1-OE組、BMAL1-OE+H2O2組、BMAL1-OE+ML385組、BMAL1-OE+ML385+H2O2組，研究NRF2在BMAL1參與心肌細胞氧化應激損傷過程中的作用。

1.2.3 CCK-8法檢測細胞活力 細胞按1×104個/孔接種于96孔板，分組干預后，每孔更換為含10 μL CCK-8試劑的PBS溶液，37 ℃培養1 h后，采用酶標儀測定450 nm波長處吸光度（A450）值。

1.2.4 熒光探針2'，7'-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）檢測細胞ROS 細胞按1×104個/孔接種于96孔板，分組干預后，每孔更換含終濃度為10 μmol/L DCFH-DA的無血清DMEM培養基，37 ℃培養20 min，采用無血清DMEM培養基清洗細胞3次以去除未進入細胞的DCFH-DA，通過全波長多功能酶標儀488 nm波長激發，測定525 nm發射波長的吸光度值（A525），并計算各組的相對ROS比率（各實驗組A525/對照組A525×100%）。

1.2.5 Western blot檢測細胞BMAL1、NRF2和NLRP3蛋白表達 細胞按1×106個/孔接種于6孔板，分組干預后收集細胞，RIPA裂解液提取總蛋白，BCA定量蛋白后變性。通過10% SDS-PAGE對蛋白進行電泳分離后轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h，加入BMAL1（1∶1 000）、NRF2（1∶1 000）、NLRP3（1∶1 000）和GAPDH抗體（1∶2 000），4 ℃孵育12 h，TBST清洗后用辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗（1∶2 000）室溫孵育1 h，TBST清洗后加入ECL液后化學發光，應用成像系統采集，Image Lab分析灰度值，以GAPDH為內參，計算各目的蛋白的相對表達量。實驗重復3次。

1.2.6 ELISA法檢測細胞IL-1β釋放 細胞按1×104個/孔接種于96孔板，分組干預后收集細胞上清液，1 000 r/min離心5 min，去除細胞殘留，采用ELISA法檢測IL-1β含量，按照試劑盒說明書進行操作。

1.3 統計學方法 采用GraphPad Prism 8軟件進行數據分析。計量資料以[[x] ±s

]表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BMAL1對H2O2誘導H9c2心肌細胞損傷和ROS生成的影響 與Control組相比，H2O2組H9c2心肌細胞活力減弱，ROS水平增高（P＜0.05），BMAL1-OE組H9c2心肌細胞活力和ROS水平無明顯變化（P＞0.05）；與H2O2組相比，BMAL1-OE+H2O2組H9c2心肌細胞活力升高，ROS水平降低（P＜0.05），見表1。

2.2 BMAL1對H2O2誘導心肌細胞NRF2和NLRP3蛋白表達的影響 與Control組相比，H2O2組H9c2心肌細胞BMAL1和NRF2蛋白表達水平降低，NLRP3蛋白表達水平升高（P＜0.05），BMAL1-OE組H9c2心肌細胞BMAL1和NRF2蛋白表達水平升高（P＜0.05），NLRP3蛋白表達水平無明顯變化（P＞0.05）；與H2O2組相比，BMAL1-OE+H2O2組H9c2心肌細胞BMAL1和NRF2蛋白表達水平升高，NLRP3蛋白表達水平降低（P＜0.05），見圖1。

2.3 BMAL1對H2O2誘導心肌細胞IL-1β釋放的影響 與Control組相比，H2O2組H9c2心肌細胞IL-1β釋放增多（P＜0.05），BMAL1-OE組H9c2心肌細胞IL-1β釋放無明顯變化（P＞0.05）；與H2O2組相比，BMAL1-OE+H2O2組H9c2心肌細胞IL-1β釋放減少（P＜0.05），見圖2。

2.4 BMAL1通過NRF2影響H2O2誘導H9c2心肌細胞損傷和ROS生成 與BMAL1-OE組相比，BMAL1-OE+ML385組H9c2心肌細胞活力和ROS水平無明顯變化（P＞0.05）；與BMAL1-OE+H2O2組相比，BMAL1-OE+ML385+H2O2組H9c2心肌細胞活力減弱，ROS水平增高（P＜0.05），見表2。

2.5 BMAL1通過NRF2影響H2O2誘導H9c2心肌細胞NLRP3蛋白表達 與BMAL1-OE組相比，BMAL1-OE+ML385組H9c2心肌細胞NLRP3表達無明顯差異（P＞0.05）；與BMAL1-OE+H2O2組相比，BMAL1-OE+ML385+H2O2組H9c2心肌細胞NLRP3表達升高（P＜0.05），見圖3。

2.6 BMAL1通過NRF2影響H2O2誘導H9c2心肌細胞IL-1β釋放 與BMAL1-OE組相比，BMAL1-OE+ML385組H9c2心肌細胞IL-1β釋放無明顯變化（P＞0.05）；與BMAL1-OE+H2O2組相比，BMAL1-OE+ML385+H2O2組H9c2-心肌細胞IL-1β釋放增多（P＜0.05），見圖4。

3 討論

心血管疾病受到生物鐘節律因素的影響［7］。本課題組前期研究表明生物鐘節律調控的核心基因之一的BMAL1能減輕H2O2誘導H9c2心肌細胞損傷，并成功構建BMAL1穩定過表達H9c2細胞［6］。本研究采用經典的H2O2誘導H9c2心肌細胞氧化應激損傷模型［8］，結果顯示，H9c2細胞經H2O2誘導后，細胞活力降低、ROS生成增多，H9c2細胞發生損傷，模型建立成功。BMAL1穩定過表達能抑制H2O2誘導的細胞活力降低和ROS產生，提示BMAL1可減輕H2O2誘導的H9c2心肌細胞損傷，具有潛在的保護作用。

NLRP3炎癥小體與多種心血管疾病的發生發展密切相關，其在心肌細胞損傷中的作用也日益受到重視［9］。NLRP3炎癥小體的活化包含啟動和激活兩個方面，其中ROS的生成是NLRP3炎癥小體激活最主要的機制［10］，而ROS生成增多引起的氧化應激亦是心肌損傷的核心機制之一［11］。針對ROS/NLRP3炎癥小體激活的調控能影響細胞的病理生理進程［12-13］，但BMAL1的心肌細胞保護作用是否與NLRP3炎癥小體有關尚不明確。Hong等［14］研究表明BMAL1能調控巨噬細胞NLRP3介導的IL-1β釋放。本研究結果顯示，BMAL1穩定過表達能抑制H2O2誘導的H9c2細胞NLRP3蛋白高表達和IL-1β釋放，提示BMAL1能減輕心肌細胞ROS/NLRP3炎癥小體通路活化，這也可能是其減輕H2O2誘導的H9c2細胞損傷的機制之一。

生物體內有著復雜的抗氧化還原體系，用于控制ROS水平并防止其過量積累［15］，NRF2則是其中的一種重要的氧化還原敏感性轉錄因子，能激活下游一系列抗氧化基因，降低ROS水平，從而維持細胞穩態［16-17］。有研究報道BMAL1可通過調節NRF2來影響氧化還原穩態［18-19］。本研究結果亦顯示，BMAL1高表達能促進NRF2表達。為探究NRF2在其中的作用，采用抑制劑ML385處理H9c2細胞，結果顯示ML385減少BMAL1對H2O2誘導的H9c2心肌細胞活力和ROS生成的抑制作用，提示NRF2參與BMAL1對心肌細胞的保護作用。而Early等［20］研究發現巨噬細胞BMAL1通過NRF2調控IL-1β釋放。本研究結果顯示，ML385增加BMAL1對H2O2誘導的H9c2細胞NLRP3和IL-1β的蛋白表達釋放，提示BMAL1通過NRF2調節ROS/NLRP3炎癥小體通路及H2O2誘導的心肌細胞損傷。

綜上所述，BMAL1能減輕H2O2誘導的H9c2心肌細胞損傷，其機制可能與NRF2調節ROS/NLRP3炎癥小體通路有關。本研究為BMAL1在心血管疾病中發揮氧化和炎癥反應的負調節作用提供了理論基礎和實驗依據。但本研究僅通過體外細胞實驗證實了BMAL1對H2O2誘導的H9c2心肌細胞氧化應激損傷的影響機制，在體內的作用機制還需繼續探索。

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