黃芩苷調節cAMP/PKA/CREB信號通路對濕疹大鼠皮膚屏障功能的影響

王首帆 徐宜厚 徐愛琴 朱立宏

摘要：目的 探討黃芩苷（BA）調節環磷酸腺苷（cAMP）/蛋白激酶A（PKA）/cAMP反應元件結合蛋白（CREB）通路對濕疹大鼠皮膚屏障功能的影響。方法 將SD大鼠隨機分為對照組（NC組）、Model組、低劑量BA組（BA-L組，25 mg/kg）、中劑量BA組（BA-M組，50 mg/kg）、高劑量BA組（BA-H組，100 mg/kg）、潑尼松組（PNS組，25 mg/kg）、BA-H+cAMP抑制劑（SQ22536）組（100 mg/kg+2.13 mg/kg）、BA-H+PKA抑制劑（H-89）組（100 mg/kg+5 mg/kg），每組12只。除NC組外，其余組大鼠均構建濕疹大鼠模型。建模成功2 d后，分組進行給藥處理。檢測濕疹面積及嚴重度指數（EASI）評分、經皮膚水分流失量（TEWL）、角質層含水量（WCSC）變化；酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測大鼠血清中免疫球蛋白E（IgE）、干擾素-γ（IFN-γ）、白細胞介素-4（IL-4）水平及大鼠背部受試區皮損組織中cAMP蛋白表達；HE染色檢測大鼠背部受試區皮損組織病理變化；Western blot檢測大鼠背部受試區皮損組織中水通道蛋白3（AQP3）、cathelicidin相關抗菌肽（CRAMP）、p-PKA、p-CREB蛋白表達。結果 與NC組比較，Model組大鼠背部受試區皮損組織病理損傷嚴重，EASI評分、TEWL、IgE、IL-4水平升高，WCSC、IFN-γ水平、AQP3、CRAMP、cAMP、p-PKA、p-CREB蛋白水平降低（P＜0.05）。與Model組比較，BA-L組、BA-M組、BA-H組、PNS組大鼠背部受試區皮損組織病理損傷減輕，EASI評分、TEWL、IgE、IL-4水平降低，WCSC、IFN-γ水平、AQP3、CRAMP、cAMP、p-PKA、p-CREB蛋白水平升高（P＜0.05）；且BA-L組、BA-M組、BA-H組上述指標變化呈劑量依賴性。SQ22536或H-89減弱了高劑量BA對濕疹大鼠皮膚屏障功能的改善作用。結論 BA可能通過激活cAMP/PKA/CREB信號通路改善濕疹大鼠皮膚屏障功能。

關鍵詞：濕疹；黃芩苷；環磷酸腺苷/蛋白激酶A/cAMP反應元件結合蛋白通路；皮膚屏障功能

中圖分類號：R285.5文獻標志碼：ADOI：10.11958/20230416

Effect of baicalin regulating cAMP/PKA/CREB signaling pathway on skin barrier?function in eczema rats

Abstract： Objective To investigate the effect of baicalin （BA） regulating cyclic adenosine phosphate （cAMP）/protein kinase A（PKA）/cAMP response elemen-binding protein （CREB） pathway on skin barrier function in eczema rats. Methods SD rats were randomly divided into the control group （NC group）， the model group， the low-dose BA group （BA-L group， 25 mg/kg）， the medium-dose BA group （BA-M group， 50 mg/kg）， the high-dose BA group （BA-H group， 100 mg/kg）， the prednisone group （PNS group， 25 mg/kg）， the BA-H+cAMP inhibitor （SQ22536） group （100 mg/kg+2.13 mg/kg） and the BA-H+PKA inhibitor （H-89） group （100 mg/kg+5 mg/kg）， 12 animals in each group. Except for the NC group， eczema rat model was constructed in the other groups. Two days after successful modeling， drug administration was performed in groups. Changes of eczema area and severity index （EASI） score， transcutaneous water loss （TEWL） and cuticle water content （WCSC） were detected. Enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） was used to detect levels of immunoglobulin E （IgE）， interferon-γ （IFN-γ） and interleukin-4 （IL-4） in rat serum and the expression of cAMP protein in rat back lesions. HE staining was used to detect pathological changes of skin lesions on the back of rats. Western blot assay was used to detect aquaporin 3 （AQP3）， cathelicidin related antimicrobial peptide （CRAMP）， p-PKA， p-CREB protein expression in rat back lesions. Results Compared with the NC group， rats had serious pathological lesions on the back of the tested area， increased EASI score， TEWL， IgE and IL-4 levels， and decreased WCSC， IFN-γ， AQP3， CRAMP， cAMP， p-PKA and p-CREB protein levels in the model group （P < 0.05）. Compared with the model group， pathological lesion of the tested area in the back of rats was relieved， and EASI score， TEWL， IgE and IL-4 levels were decreased， WCSC， IFN-γ levels， AQP3， CRAMP， cAMP， p-PKA and p-CREB protein were increased in the BA-L group， the BA-M group， the BA-H group and the PNS group （P＜0.05）. Changes of above indexes in the BA-L group， the BA-M group， the BA-H group were dose-dependent. SQ22536 or H-89 attenuated the improvement effect of high dose BA on skin barrier function in eczema rats. Conclusion BA may improve skin barrier function in eczema rats by activating cAMP/PKA/CREB signaling pathway.

Key words： eczema; baicalin; cyclic adenosine monophosphate/protein kinase A/cyclic-AMP response binding protein pathway; skin barrier function

濕疹是一種具有滲出傾向的慢性炎癥性皮膚病，臨床表現為紅斑、水皰、糜爛、瘙癢等［1］。盡管抗組胺藥和糖皮質激素可用于臨床治療，但這些藥物往往會導致不良反應，而且費用較高［2-3］。皮膚屏障缺陷是濕疹發病的重要原因之一［4］。因此，開發新的藥物改善濕疹過程中的皮膚屏障功能具有重要意義。黃芩苷（Baicalin，BA）是一種從中草藥黃芩的根中分離出來的植物性黃酮類化合物，其具有抗炎和抗氧化特性［5］。據報道，BA通過改善皮膚屏障功能減輕特應性皮炎小鼠皮膚損傷［6］，但具體作用機制尚未完全明確。有研究顯示，環磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）/蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）/cAMP反應元件結合蛋白（cyclic-AMP response binding protein，CREB）通路中cAMP/PKA的激活可以減輕小鼠銀屑病樣皮炎［7］。但BA能否通過調控cAMP/PKA/CREB信號通路改善濕疹大鼠皮膚屏障功能鮮見報道。本研究旨在探究BA對濕疹大鼠皮膚屏障功能的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6周齡SPF級雄性SD大鼠96只，體質量200～210 g，購自廣東萊迪生物醫藥研究院有限公司，生產許可證號：SCXK（粵）2022-0064。所有大鼠被飼養在溫度（23±2）°C，濕度50%±10%，12 h/12 h黑暗和光照循環的環境中，并提供標準水和食物。動物實驗經我院動物倫理委員會批準（批準號：2021-SPF/SQ-62）。

1.2 主要試劑與儀器 BA購自滁州仕諾達生物科技有限公司；cAMP抑制劑SQ22536購自武漢博歐特生物科技有限公司；PKA抑制劑H-89購自上海信裕生物科技有限公司；2，4-二硝基氯苯（2，4-dinitrochlorobenzene，DNCB）購自上海信裕生物科技有限公司；潑尼松（prednisone，PNS）購自上海晶風生物科技有限公司；大鼠免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）、干擾素-γ（interferon γ，IFN-γ）、白細胞介素-4（interleukin-4，IL-4）、cAMP酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒購自上海遠慕生物科技有限公司；兔源一抗水通道蛋白3（aquaporin3，AQP3）、cathelicidin相關抗菌肽（cathelicidin-related antimicrobial peptide，CRAMP）、PKA、p-PKA、CREB、p-CREB、β-actin及辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔二抗均購自英國Abcam公司。TM300型皮膚測試儀購自德國CK公司；DG5031型酶標儀購自杭州綠博儀器有限公司；CX53型光學顯微鏡購自日本奧林巴斯公司；DYCZ24DN型蛋白電泳儀購自北京六一儀器廠；GelDoc XR+型凝膠成像系統分析儀購自美國伯樂公司。

1.3 濕疹大鼠模型的構建 參照文獻［8］構建濕疹大鼠模型。使用電動剃須刀去除大鼠背部（3 cm×3 cm）的毛發，用移液槍在背部去毛的皮膚上涂抹50 μL 5%DNCB進行第1次致敏，第2周再向相同部位涂抹100 μL 1%DNCB進行激發致敏，每周致敏1次，連續4周。若大鼠背部皮損區域出現紅斑、水腫、丘疹、結痂、滲出，則表明模型建立成功。

1.4 動物分組 按照隨機數字表法將大鼠分為對照組（NC組）、Model組、低劑量BA組（BA-L組）、中劑量BA組（BA-M組）、高劑量BA組（BA-H組）、PNS組、BA-H+SQ22536組、BA-H+H-89組，每組12只。除NC組外，其余組大鼠均需按照1.3所述方法構建濕疹大鼠模型。建模成功2 d后，進行給藥處理，BA-L組、BA-M組、BA-H組［9］、PNS組［10］大鼠分別灌胃25 mg/kg BA、50 mg/kg BA、100 mg/kg BA、25 mg/kg PNS，且均腹腔注射等量的生理鹽水；BA-H+SQ22536組［11］大鼠灌胃100 mg/kg BA且腹腔注射2.13 mg/kg SQ22536；BA-H+H-89組［12］大鼠灌胃100 mg/kg BA且腹腔注射5 mg/kg H-89；NC組和Model組大鼠均需灌胃等體積的生理鹽水且腹腔注射等體積的生理鹽水。給藥1次/d，持續14 d。

1.5 標本收集 末次處理24 h后，進行濕疹面積和嚴重度指數（eczema area and severity index，EASI）評分，并測量經皮膚水分流失量（trans-epidermal water loss，TEWL）、角質層含水量（water content of stratum corneum，WCSC）。上述指標檢測結束后，用1%戊巴比妥鈉輕度麻醉大鼠，從腹主動脈采集血液并置于離心管中，在4 ℃以3 000 r/min離心30 min，然后將血清儲存在-20 ℃用于ELISA。收集血液后，麻醉并處死大鼠，收集大鼠背部受試區皮損組織，分為兩部分，每部分包含6只大鼠的皮損組織，一部分浸入4%多聚甲醛中用于HE染色，另一部分儲存在液氮中用于ELISA和Western blot實驗。

1.6 EASI評分 根據水腫、紅斑和抓痕情況進行EASI評分。水腫：無， 0分；輕度， 1分；中度，2分；重度，3分。紅斑：無， 0分；輕微， 1分；明顯且無痂皮，2分；中度且有輕度痂皮， 3分；重度且有重度痂皮， 4分。抓痕：無，0分；有， 1分。以上3項評分之和即為EASI評分。

1.7 TEWL和WCSC的檢測 利用皮膚測試儀水分散失測試探頭垂直輕壓于被測皮膚表面24 s，記錄到的水分流失量即為TEWL；利用皮膚測試儀水分散失測試探頭垂直輕壓于被測皮膚表面3 s，記錄到的含水量即為WCSC。

1.8 ELISA檢測大鼠血清IgE、IFN-γ、IL-4水平及大鼠背部受試區皮損組織cAMP蛋白水平 按照ELISA試劑盒說明書步驟測定大鼠血清IgE、IFN-γ、IL-4水平及大鼠背部受試區皮損組織cAMP蛋白水平。

1.9 HE染色檢測大鼠背部受試區皮損組織病理變化 將大鼠背部受試區皮損組織從4%多聚甲醛中取出，脫水、滲透、石蠟浸漬、包埋、切片、染色、密封。用顯微鏡（×200）進行組織形態學觀察，并拍攝照片。

1.10 Western blot檢測大鼠背部受試區皮損組織中AQP3、CRAMP、p-PKA、p-CREB蛋白表達 用RIPA裂解緩沖液提取大鼠背部受試區皮損組織中的蛋白質，利用BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度，將40 μg蛋白在100 V恒壓下經12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后將蛋白凝膠在0.6 mA/cm2的恒流電流作用下轉移2 h，將蛋白轉移至PVDF膜上，再將PVDF膜在5%脫脂奶粉中封閉2 h后，將膜與兔抗鼠AQP3（1∶3 000）、CRAMP（1∶2 000）、p-PKA（1∶2 000）、p-CREB（1∶2 000）、PKA（1∶2 000）、CREB（1∶3 000）、β-actin（1∶2 000）一抗在4 ℃下孵育過夜，再與羊抗兔二抗（1∶3 000）孵育2 h。使用ECL試劑對蛋白質條帶進行可視化。GelDoc XR+型凝膠成像系統分析儀用于評估蛋白灰度值。

1.11 統計學方法 采用SPSS 23.0軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差（[[x] ±s

]）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠EASI評分及背部受試區皮損區域TEWL、WCSC比較 與NC組比較，Model組大鼠EASI評分、TEWL升高，WCSC降低（P＜0.05）。與Model組比較，BA-L組、BA-M組、BA-H組、PNS組大鼠EASI評分、TEWL降低，WCSC升高（P＜0.05）；且BA-L組、BA-M組、BA-H組大鼠EASI評分、TEWL依次降低，WCSC依次升高（P＜0.05）。與BA-H組比較，BA-H+SQ22536組、BA-H+H-89組大鼠EASI評分、TEWL升高，WCSC降低（P＜0.05）；PNS組與BA-H組差異無統計學意義，見表1。

2.2 各組大鼠血清IgE、IFN-γ、IL-4水平比較 與NC組比較，Model組大鼠血清IgE、IL-4水平升高，IFN-γ水平降低（P＜0.05）。與Model組比較，BA-L組、BA-M組、BA-H組、PNS組大鼠血清IgE、IL-4水平降低，IFN-γ水平升高（P＜0.05）；且BA-L組、BA-M組、BA-H組大鼠血清IgE、IL-4水平依次降低，IFN-γ水平依次升高（P＜0.05）。與BA-H組比較，BA-H+SQ22536組、BA-H+H-89組大鼠血清IgE、IL-4水平升高，IFN-γ水平降低（P＜0.05）；PNS組與BA-H組差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。

2.3 各組大鼠背部受試區皮損組織病理變化 NC組大鼠角質層、表皮、真皮結構正常。Model組大鼠背部受試區皮損組織結構異常，表現為角化過度，表皮、真皮層存在大量炎性細胞浸潤。與Model組比較，BA-L組、BA-M組、BA-H組、PNS組大鼠背部受試區皮損組織病理損傷減輕；與BA-H組比較，BA-H+SQ22536組、BA-H+H-89組大鼠背部受試區皮損組織病理損傷加劇，見圖1。

2.4 各組大鼠背部受試區皮損組織中AQP3、CRAMP蛋白及cAMP/PKA/CREB通路相關蛋白表達變化 與NC組比較，Model組大鼠背部受試區皮損組織中AQP3、CRAMP、cAMP、p-PKA、p-CREB蛋白水平降低（P＜0.05）。與Model組比較，BA-L組、BA-M組、BA-H組、PNS組大鼠背部受試區皮損組織中AQP3、CRAMP、cAMP、p-PKA、p-CREB蛋白水平升高（P＜0.05）；且BA-L組、BA-M組、BA-H組大鼠背部受試區皮損組織中AQP3、CRAMP、cAMP、p-PKA、p-CREB蛋白水平依次升高（P＜0.05）。與BA-H組比較，BA-H+SQ22536組大鼠背部受試區皮損組織中AQP3、CRAMP、cAMP、p-PKA、p-CREB蛋白水平降低（P＜0.05）；BA-H+H-89組大鼠背部受試區皮損組織中AQP3、CRAMP、p-PKA、p-CREB蛋白水平降低（P＜0.05），cAMP蛋白差異無統計學意義（P＞0.05）；PNS組與BA-H組差異無統計學意義（P＞0.05），見圖2、表3。

3 討論

濕疹是一種以瘙癢性濕疹性病變為特征的慢性炎癥性皮膚病［13］。本研究采用DNCB誘導構建濕疹大鼠模型。當皮膚受到DNCB刺激后再次接觸同一抗原時，會發生Ⅳ型過敏反應，反復刺激可產生類似濕疹的表現。本研究結果顯示，Model組大鼠EASI評分、TEWL升高，WCSC降低，背部受試區皮損組織病理損傷嚴重，反映大鼠皮膚水分大量散失，表皮角質層含水量減少，進而引起皮損組織病理損傷，提示經DNCB反復誘導的大鼠皮膚屏障功能異常。AQP3是在皮膚中研究最多的一種蛋白，其在皮膚屏障恢復中可發揮重要作用，若AQP3缺失可能會導致皮膚彈性下降、皮膚屏障修復延遲，進而引起濕疹等皮膚病的發生［14-15］；CRAMP是皮膚抵御微生物入侵的第一道防線，上調皮損組織中CRAMP蛋白表達可改善特應性皮炎小鼠皮膚屏障功能［16］。本研究結果顯示，與NC組比較，Model組大鼠背部受試區皮損組織中AQP3、CRAMP蛋白水平降低，再次證實濕疹模型大鼠皮膚屏障功能異常。

BA是一種從黃芩根中分離的親脂性黃酮苷，其具有強大的生物活性，包括抗炎、抗氧化、抗癌和抗病毒等［17］。BA可對長波紫外線誘導的小鼠皮膚氧化損傷和炎癥發揮保護作用［18］；BA還可抑制痤瘡丙酸桿菌誘導的大鼠皮膚炎癥［9］及銀屑病小鼠皮膚炎癥［19］。以上研究結果表明BA對多種皮膚炎癥疾病具有較好的抑制作用。而關于BA對濕疹大鼠皮膚屏障功能的影響鮮有報道。本研究結果顯示，BA可呈劑量依賴性地降低EASI評分和TEWL，升高WCSC，改善背部受試區皮損組織病理損傷，而BA-H組與PNS組大鼠上述指標無明顯差異，表明BA可改善濕疹大鼠皮膚屏障功能。

免疫失衡在濕疹的發病機制中起重要作用，尤其是Th1/Th2失衡。IFN-γ主要由Th1細胞分泌，可抑制Th2細胞分泌IL-4，同時抑制B細胞產生IgE。IL-4主要由Th2細胞分泌，主要抑制Th1細胞功能，促進B細胞產生IgE，兩者相互抑制、拮抗，維持Th1/Th2平衡［20］。正常人體內IFN-γ和IL-4水平保持相對平衡狀態，而濕疹患者則失去了這種狀態。本研究結果顯示，與NC組比較，Model組大鼠血清IgE、IL-4水平升高，IFN-γ水平降低，提示Model組大鼠存在Th1/Th2失衡。而BA可呈劑量依賴性地降低大鼠血清IgE、IL-4水平，升高IFN-γ水平，提示BA可促進濕疹大鼠Th1/Th2平衡。BA可能成為臨床上治療濕疹的潛在有效藥物。

cAMP在細胞中廣泛表達，PKA是cAMP的主要靶標，當細胞中cAMP水平升高時，其結合PKA底物，使PKA磷酸化，進而會進一步磷酸化CREB；CREB磷酸化可啟動基因轉錄，從而調節細胞分化、增殖、凋亡和代謝［21］。還有研究顯示，激活PKA/CREB信號通路可改善皮膚炎癥性疾病相關色素沉著障礙［22］。而關于cAMP/PKA/CREB信號通路對濕疹大鼠皮膚屏障功能的影響尚鮮見報道。本研究結果顯示，BA可呈劑量依賴性地上調濕疹大鼠背部受試區皮損組織中cAMP、p-PKA、p-CREB蛋白表達，提示BA可能通過激活cAMP/PKA/CREB信號通路改善濕疹大鼠皮膚屏障功能。為驗證此猜想，本研究在高劑量BA作用的基礎上聯合cAMP抑制劑SQ22536或PKA抑制劑H-89來干預濕疹大鼠，結果顯示，SQ22536或H-89減弱了高劑量BA對濕疹大鼠皮膚屏障功能的改善作用。

綜上所述，BA可能通過激活cAMP/PKA/CREB信號通路改善濕疹大鼠皮膚屏障功能，其具體作用機制及是否涉及其他通路尚待進一步研究探討。

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