過表達去飽和酶基因對大腸桿菌脂肪酸合成的影響

葉 景，許思遠，張 琴，錢 程，曹娟娟，趙 沛

（安徽工程大學生物與食品工程學院，安徽 蕪湖 241000）

脂肪酸去飽和酶代表一類氧依賴性酶，在脂肪酸不同位置引入雙鍵，將飽和脂肪酸降飽和為不飽和脂肪酸，催化脫飽和反應，從而產生單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸[1]。脂肪酸去飽和酶已被分類為氧化還原酶，通常利用NADP或NAD＋作為輔助因子，通過與分子氧（加氧酶）結合作用于單個供體，除了氧的存在（作為氫受體），反應還需要細胞色素b5（電子載體）和NADH依賴性細胞色素b5還原酶[2-3]。作為脂肪酸合成途徑中的關鍵酶參與脂肪酸的合成，對微生物脂肪酸雙鍵位置、結構、數量產生特異性影響[4]，不但可以增加脂肪酸的不飽和度，還有利于促進脂質積累，對維持生物膜正常結構和功能具有重要意義[5]。脂肪酸去飽和酶的分布十分普遍[6-9]，只有少數例外，如大腸桿菌（Escherichia coli），但其具有復制快、可在各種碳源上生長、遺傳背景清晰、易于進行基因改造等眾多優(yōu)點，使其成為最有吸引力的生產脂肪酸的宿主生物[10-11]。

目前，去飽和酶的研究主要集中在其結構表達與調控機制上，少數致力于探究過表達脂肪酸去飽和酶代謝途徑工程，改善細胞資源動態(tài)重新分配以及途徑表達對提高脂肪酸生產力和產量的影響。Garba等[12]克隆了來自Pseudomonassp.A3的Δ9-脂肪酸去飽和酶基因，并在E.coli中成功表達，使其不飽和脂肪酸含量顯著增加。Xue Zhixiong等[13]通過對產油酵母進行代謝工程改造，得到了1 株能產生15%干細胞質量花生五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）的菌株。工程酵母脂質中含有56.6%的EPA和5%以下的飽和脂肪酸，分別為已知EPA生產菌來源中最高和最低的比例。Yan Fengxin等[5]在解脂耶氏酵母中過表達Δ15去飽和酶，菌株積累的脂質含量達30.7%，而共表達Δ12和Δ15去飽和酶基因積累的脂質含量則可達42.6%。由此看來，不管是單表達還是共表達去飽和酶基因，都可在一定程度上提高微生物的油脂含量、改善其飽和、不飽和脂肪酸的組成比例。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）HB1310是1 株已報道的高產油核桃內生菌，飽和酶是該菌株脂肪酸合成途徑中的關鍵酶之一[14]，本研究將克隆其去飽和酶基因de1、de2，實現這兩種基因在E.coliBL21（DE3）中的單表達與共表達，探究去飽和酶基因過表達對E.coli油脂產量及其脂肪酸組分的影響，獲得高效的產油工程菌，以期為高產油工程菌的開發(fā)和應用提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質粒

本研究使用的菌株和質粒見表1。其中產油核桃內生菌（B.subtilisHB1310）用于克隆實驗所需目的基因，E.coliDH5α及pET-28a用于質粒構建，E.coliBL21（DE3）作為表達菌株用于構建脂肪酸生產菌株，pUCm-T購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

表1 實驗所用菌株和質粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、NaCl 10 g/L，pH 7.0～7.5，120 ℃，20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖2 g/L、酵母粉5 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 10 g/L、KH2PO40.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L，pH 7.0～7.5，110 ℃，30 min。

1.1.3 試劑

葡萄糖、氯化鈉、磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂、氫氧化鈉、瓊脂粉、瓊脂糖、蛋白胨、氨芐霉素、卡那霉素、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropylthio-β-Dgalactoside，IPTG）、細菌總蛋白提取試劑盒、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）變性丙烯酰胺凝膠快速制備試劑盒、細菌總蛋白提取試劑盒、Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒、SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒、SanPrep柱式PCR產物純化試劑盒、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、5×Tris-硼酸電泳緩沖液 生工生物工程（上海）股份有限公司；6×Loading Buffer、限制性內切酶、T4 DNA連接酶、2×PremixTaqTM北京寶日醫(yī)生物技術有限公司；甲醇、氯仿 上海國藥集團化學試劑有限公司；正己烷（色譜純）、紅四氮唑、磷酸鹽緩沖溶液粉劑 上海麥克林生化科技有限公司；十五烷酸甲酯、37 種脂肪酸標準品 廣州碩譜生物科技有限公司。

1.1.4 引物

引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，具體序列見表2。

表2 實驗所用引物Table 2 Primer sequences used in this study

1.2 儀器與設備

聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀、電泳儀、凝膠成像儀 上海伯樂生命醫(yī)學產品有限公司；冷凍離心機 大龍興創(chuàng)實驗儀器（北京）股份公司；紫外-可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；GC 8860氣相色譜儀 美國安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 基因de1、de2及de的克隆

采用Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒提取B.subtilisHB1310的基因組DNA并作為模板，采用引物對DEF1/DER1、DEF2/DER2分別擴增de1、de2基因，并分別采用引物對DEF11/DER11、DEF21/DER21為de1基因引入酶切位點EcoR I、XhoI，為de2基因引入酶切位點BamH I、XhoI。

采用融合PCR將de1、de2基因整合，并命名為de。以B.subtilisHB1310的基因組DNA為模板，采用引物對DE1/DE2擴增得到基因de1，上游引入酶切位點BamH I，采用引物對DE3/DE4擴增得到基因de2，下游引入酶切位點XhoI。將擴增產物以物質的量比1∶1混合進行自我延伸，PCR條件：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，61 ℃退火30 s，8 個循環(huán)；72 ℃延伸2 min。反應結束以其為模板DNA進行擴增，PCR體系（10 μL）：上下游引物各0.4 μL，模板DNA 0.4 μL，2×PremixTaqTM5 μL，加水補充至10 μL。PCR條件：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，25 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.3.2 重組質粒及工程菌株的構建

純化回收PCR擴增產物，與pUCm-T載體連接，轉化至E.coliDH5α感受態(tài)細胞，氨芐霉素抗性篩選，PCR檢測及雙酶切和測序驗證篩選轉化子，驗證正確的陽性轉化子即為成功構建的克隆質粒T-de1、T-de2、T-de。構建好的克隆質粒，采用限制性內切酶進行雙酶切，與同樣雙酶切的pET-28a載體連接，轉化E.coliDH5α感受態(tài)細胞，抗性（含質量濃度為10 μg/mL的卡那霉素）篩選，進行PCR檢測及雙酶切和測序驗證，驗證正確的質粒即為構建成功的原核表達質粒pET-28a-de1、pET-28ade2、pET-28a-de。提取并純化各重組質粒，并轉化至E.coliBL21（DE3）感受態(tài)細胞，抗性（10 μg/mL卡那霉素）篩選，獲得轉化子，并抽提質粒，再進行雙酶切和測序驗證，驗證正確的菌株即為構建的工程菌株BL21（DE3）/pET-28a-de1（DE1）、BL21（DE3）/pET-28ade2（DE2）、BL21（DE3）/pET-28a-de（DE）。

1.3.3 目的蛋白誘導表達和SDS-PAGE檢測

參考許思遠等[15]的方法，活化的工程菌株DE1、DE2、DE分別接種于含10 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、200 r/min過夜培養(yǎng)，取培養(yǎng)的菌液按照0.5%接種量接種于含10 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，至OD600nm達0.4～0.6，加入已滅菌的IPTG（終濃度1 mmol/L）繼續(xù)誘導6 h，將獲得的菌液離心收集菌體，采用細菌總蛋白提取試劑盒提取各菌株蛋白，再用SDS-PAGE變性丙烯酰胺凝膠快速制備試劑盒對菌株蛋白進行電泳檢測。

1.3.4 各工程菌株生長和酶活性的測定

活化好的野生菌株和工程菌株DE1、DE2、DE分別接種于LB液體培養(yǎng)基中（工程菌的培養(yǎng)基中加10 μg/mL卡那霉素）培養(yǎng)60 h，每12 h取培養(yǎng)液檢測OD600nm。工程菌株DE1、DE2、DE采用1.3.3節(jié)方法誘導產酶，再轉入發(fā)酵培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，同時補充IPTG和卡那霉素，相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)至60 h，每12 h取樣檢測去飽和酶活性，野生菌株E.coliBL21（DE3）則在不含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，同樣監(jiān)測60 h內的去飽和酶活性。

去飽和酶活性檢測參考姚笛等[16]的方法：取新鮮菌液20 mL，離心收集菌體，采用細菌總蛋白提取試劑盒提取細菌蛋白。取等量蛋白提取液依次加入Tris-HCl緩沖液（pH 8.0）、質量分數0.4%紅四氮唑溶液各2 mL，25 ℃培養(yǎng)2 h，甲苯萃取，取有機層測量OD485nm，依據紅四氮唑標準曲線計算甲攢含量，將該條件下甲攢含量每增加1 μg定義為1 個酶活性單位。

1.3.5 野生菌株和工程菌株DE1、DE2、DE發(fā)酵產油

采用250 mL的錐形瓶作為發(fā)酵瓶，100 mL裝液量。挑取單菌落接種于含有卡那霉素的3 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min過夜培養(yǎng)，將上述3 mL菌液接種于30 mL LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600nm為0.4～0.6，加入1 mol/L IPTG，使IPTG終濃度為1 mmol/L，37 ℃、180 r/min誘導6 h，以10%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，同時補充IPTG和卡那霉素（野生菌株發(fā)酵過程中不添加IPTG和卡那霉素），相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24 h，各實驗重復6 次，取樣、離心收集菌體，將3 次重復收集的菌體烘干至質量恒定用于檢測菌體干質量，并用于細菌油脂的提取及其后續(xù)油脂含量換算和組分分析。

1.3.6 細菌油脂的提取及換算

參考張琴[17]的方法，采用酸熱法提取細菌油脂，測得的油脂質量換算為每升的量即為油脂產量，油脂質量分數采用式（1）計算：

1.3.7 油脂組分分析

甲酯化：提取的細菌油脂加入5%硫酸-甲醇溶液2 mL混勻，90 ℃水浴2 h，冷卻后添加2 mL正己烷振蕩混勻，離心收集上清液，添加適量無水硫酸鈉，靜置5 min。吸取上清液1 mL，過0.22 μm濾膜，添加2 μL 100 mg/mL內標（十五烷酸甲酯）溶液，用于氣相色譜上樣。

氣相色譜條件：HP-5色譜柱（30 m×0.32 nm，0.5 μm）；升溫程序：40 ℃保持10 min，以5 ℃/min升溫至120 ℃，4 ℃/min升溫至190 ℃，3 ℃/min升溫至240 ℃，保持20 min；載氣（N2）流速1.2 mL/min，壓強2.4 kPa，進樣量1 μL，分流比15∶1。

脂肪酸質量分數及不飽和脂肪酸提高量計算方法如式（2）～（4）所示：

式中：I為脂肪酸質量分數/%；Ai為脂肪酸的峰面積；∑A為除溶劑峰和雜質峰外所有峰面積之和；AEi為十五烷酸甲酯峰面積。

1.4 數據處理與分析

2 結果與分析

2.1 去飽和酶基因的克隆

采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳對de1、de2、de基因的PCR擴增產物進行檢測，結果如圖1所示。從電泳圖可看出，3 個基因的PCR擴增產物堿基長度約1 036、822、1 856 bp，與預期目標條帶大小相符，表明這些基因片段擴增成功。

圖1 de1、de2、de基因PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳結果Fig.1 Agarose gel electrophoretograms of PCR products of the de1,de2 and de genes

2.2 重組表達質粒與工程菌的構建

重組表達質粒pET-28a-de1、pET-28a-de2、pET-28a-de抽提純化，分別采用限制性內切酶EcoR I/XhoI、BamH I/XhoI、BamH I/XhoI雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，各重組表達質粒酶切后均產生兩條帶（圖2），其中大片段均與質粒pET-28a單酶切片段長度一致，小片段分別與de1、de2、de基因的目的片段長度一致，進一步測序結果證實3 個基因的重組表達質粒均構建成功。

圖2 重組表達質粒pET-28a-de1、pET-28a-de2、pET-28a-de雙酶切產物瓊脂糖凝膠電泳檢測結果Fig.2 Agarose gel electrophoretograms of double enzyme digestion products of recombinant plasmids pET-28a-de1,pET-28a-de2,and pET-28a-de

將重組質粒轉化至BL21（DE3）得到工程菌株BL21（DE3）/pET-de1（DE1），BL21（DE3）/pET-de2（DE2）及共表達菌株BL21（DE3）/pET-de（DE），對工程菌株進行PCR檢測、質粒及酶切驗證，序列比對結果顯示工程菌構建成功。

2.3 工程菌株DE1、DE2、DE去飽和酶基因誘導表達產物的SDS-PAGE分析

對工程菌株DE1、DE2、DE去飽和酶基因誘導表達的酶蛋白進行SDS-PAGE檢測，結果見圖3。與E.coliBL21（DE3）的蛋白SDS-PAGE結果進行對比分析，發(fā)現工程菌株DE1、DE2的重組酶在分子質量約40、32 kDa左右的條帶分別較E.coliBL21（DE3）明顯加深，與理論分子質量較接近（DE1的為39.8 kDa，DE2的為31.8 kDa）。結果表明，去飽和酶基因de1、de2在E.coliBL21（DE3）中實現了高效單表達和共表達。

圖3 工程菌株DE1、DE2、DE去飽和酶蛋白的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of desaturase proteins from engineered strains DE1,DE2 and DE

2.4 去飽和酶基因de1、de2單表達和共表達對菌株生長的影響

對工程菌株DE1、DE2、DE培養(yǎng)60 h內的OD600nm進行監(jiān)測，其生長曲線如圖4所示。發(fā)現3 株工程菌均能在24 h內快速生長，并在24 h左右達生長峰值，其后生長趨于穩(wěn)定。從培養(yǎng)過程的生長曲線看，3 株菌株呈現與野生菌株類似的生長曲線，說明外源的去飽和酶基因de1、de2單表達和共表達過程中，工程菌株仍能維持有效的生長。然而，24～60 h，工程菌株的生長均略低于野生菌株，可能由于外源基因表達過程中，插入新的酶會造成合成代謝干擾內源性代謝，合成代謝和內源性代謝之間的競爭導致代謝負擔，從而導致宿主的應激反應和生理變化，引起工程菌株生長量的降低[18-20]。

圖4 工程菌株和野生菌株的生長曲線Fig.4 Growth curves of engineered strains and wild-type strain

2.5 工程菌株和野生菌株的去飽和酶活性變化

紅四氮唑作為一種氧化劑，可以從去飽和酶接受電子，后自身從無色被還原為紅色的甲攢，從而可以表征細胞內去飽和酶活性[16]。工程菌株和野生菌株60 h內的酶活性變化曲線如圖5所示，工程菌株DE1、DE2、DE的去飽和酶活性在60 h誘導過程中均高于野生菌株，尤以24 h的酶活性最高，分別為同時刻野生菌株的1.38、1.48 倍和1.75 倍，表明去飽和酶基因de1、de2在24 h內即實現了高水平的表達；24 h后工程菌株酶活性呈下降趨勢，可能是由于外源基因的過表達導致E.coli中形成大量的包涵體[21]。而發(fā)酵后期隨著營養(yǎng)物質消耗以及細菌生長進入衰退期，去飽和酶活性趨于平穩(wěn)，但仍略高于或與野生菌株的酶活性接近。

圖5 工程菌株和野生菌株的去飽和酶活性變化曲線Fig.5 Changes in desaturase activity of engineered strains and wild-type strain

2.6 去飽和酶基因de1、de2單表達和共表達對油脂產量及脂肪酸組分的影響

為最大程度排除可能由于包涵體的形成導致部分菌株去飽和酶活性下降，而造成后續(xù)實驗對細菌脂肪酸產量及脂肪酸組成成分的實驗偏差，本研究僅收集了工程菌株和野生菌株發(fā)酵24 h的菌體樣品進行細菌油脂的提取及其脂肪酸組分分析。

如圖6所示，去飽和酶基因的表達有效增強了細菌脂質的積累，與野生菌株相比，工程菌株的油脂產量和質量分數均顯著提高。DE1、DE2、DE的油脂產量分別可達0.57、0.58、0.72 g/L，均較野生菌株提高83%以上，而油脂質量分數從野生菌的9.45%提高至18.44%以上，分別較野生菌株提高97.78%、95.17%、135.09%。總的來看，去飽和酶基因de1與de2共表達對油脂產量和含量提高的促進作用顯著優(yōu)于這兩個基因單表達的，這與Yan Fengxin等[5]在解脂耶氏酵母中共表達Δ12和Δ15去飽和酶基因促進脂質積累效果更顯著的結論一致。

圖6 工程菌株和野生菌株發(fā)酵24 h的油脂產量和含量Fig.6 Oil yields and contents of engineered strains and wild-type strain after 24 h fermentation

將提取的細菌油脂進行甲酯化后，利用氣相色譜對脂肪酸組分進行定性和定量分析。基于37 種脂肪酸甲酯混標對油脂樣品進行分離定性，對照標準品參考圖譜得出各組分的出峰時間，采用十五烷酸甲酯作為內標對脂肪酸甲酯進行定量分析[22]。菌株脂肪酸組分及其質量分數見表3。

表3 工程菌株和野生菌株的脂肪酸組分及其質量分數Table 3 Composition and content of fatty acids from engineered strains and wild-type strain

表3顯示，E.coliBL21（DE3）的油脂脂肪酸組分以棕櫚酸（C16:0）和硬脂酸（C18:0）為主，其次為豆蔻酸（C14:0）、亞油酸（C18:2）。3 株工程菌中油脂脂肪酸仍以上述4 個組分為主，但各組分的質量分數卻發(fā)生了明顯的變化。其中，C8:0、C15:1、C18:0脂肪酸質量分數均高于野生菌株，尤其是工程菌株DE1、DE中的不飽和脂肪酸組分C15:1、C18:2、C22:2質量分數均顯著高于野生菌株。為揭示去飽和酶基因de1、de2單表達及共表達對油脂脂肪酸組分的影響，統(tǒng)計了工程菌株DE1、DE2、DE相對于野生菌株中飽和與不飽和脂肪酸的提高量。如圖7所示，工程菌株中飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸含量均提高，飽和脂肪酸含量分別提高72.26%、66.93%、123.21%，不飽和脂肪酸含量分別提高112.18%、44.18%、134.30%，表明去飽和酶基因的表達有利于E.coli中脂肪酸組分的改善。

圖7 工程菌株DE1、DE2、DE相對于野生菌株的飽和與不飽和脂肪酸的提高量Fig.7 Improvements in saturated and unsaturated fatty acid contents from engineered strains DE1,DE2 and DE compared with wild-type strain

理論上，去飽和酶特異性地促進成熟脂肪酸中順式雙鍵的形成，將飽和狀態(tài)下的脂肪酸去飽和，關鍵結構域和關鍵位點構成去飽和酶的活性中心并影響其活性，且不同的催化底物對催化速率也產生一定的影響[23]。有研究表明，脂肪酸去飽和酶的類型、表達水平和活性決定了不飽和脂肪酸的定性和定量組成，特殊去飽和酶的過表達可以促進細胞內單不飽和脂肪酸的富集和脂質積累，從而達到改善脂肪酸組分的效果[23-25]。例如，Paulucci等[26]將去飽和酶基因PhFAD12在E.coliBL21（DE3）中高效表達，該基因在轉化菌株中的表達降低了棕櫚酸和硬脂酸的水平，將棕櫚酸和硬脂酸脫飽和為單不飽和脂肪酸，提高了棕櫚油酸的表達水平；Yin Dongmei等[27]實現了Δ12脂肪酸去飽和酶在E.coliBL21（DE3）中的高效表達，發(fā)現該酶能特異性地將油酸（C18:1）轉化為亞油酸等，本研究也通過對工程菌株相對于野生菌株中飽和與不飽和脂肪酸含量的提高量進行統(tǒng)計分析，證明了去飽和酶基因的表達有利于E.coli中脂肪酸組分的改善，尤其是不飽和脂肪酸含量的提高。表4總結了近年來酵母菌和E.coli中過表達去飽和酶基因引起菌株不飽和脂肪酸組分和含量變化的研究結果，可見去飽和酶對于脂肪酸組分的改善至關重要，過表達不同來源的去飽和酶基因對于高產油工程菌或特殊組分工程菌的構建具有重要應用價值和理論意義。

3 結論

在E.coliBL21（DE3）中表達了來自產油核桃內生菌B.subtilisHB1310的去飽和酶基因，構建了單基因表達菌株BL21（DE3）/pET-de1、BL21（DE3）/pET-de2及共表達菌株BL21（DE3）/pET-de，實現了去飽和酶基因的高表達，有效促進了E.coli去飽和酶活性的提高，使脂肪酸積累量得以增加，提高了菌株油脂產量和含量，改善了脂肪酸組分，尤其使不飽和脂肪酸含量顯著提高。本研究可為產油脂工程菌的開發(fā)和應用提供有價值的菌種來源，對高效產油工程菌的構建具有一定的應用價值。