西紅花提取物調控免疫細胞，提高程序性死亡受體-1抑制劑治療肺腺癌效果的實驗研究

李詩穎 李存雅 張雪 鐘薏

摘 要 目的：多項研究提示，西紅花提取物能影響腫瘤的發展進程。本實驗探究西紅花提取物在肺腺癌小鼠模型中對腫瘤免疫微環境和免疫治療的影響，為西紅花提取物抗腫瘤研究提供更多基礎性數據。方法：構建Lewis肺癌細胞和螢光素酶穩定結合的小鼠皮下瘤模型，觀察西紅花提取物對小鼠皮下瘤和腫瘤免疫微環境的影響：運用活體成像技術跟蹤腫瘤生長情況；運用流式細胞技術檢測小鼠CD4+、CD8+ T細胞的數量及占比；運用反轉錄-聚合酶鏈式反應技術檢測程序性死亡受體配體1、含有T細胞免疫球蛋白和黏蛋白結構域的蛋白3（T cell immunoglobulin and mucin domaincontaining protein 3， TIM3）、淋巴細胞活化基因-3（lymphocyte-activation gene-3， LAG3）、具有免疫球蛋白和ITIM結構域的T細胞免疫受體（T cell immunoreceptor with immunoglobulin and ITIM domain， TIGIT）、胸腺細胞選擇相關的高遷移率族蛋白（thymocyte selection-associated high mobility group box， TOX）1、TOX2、TOX3基因的mRNA表達情況。結果：與對照組相比，給予西紅花提取物能一定程度地抑制小鼠皮下瘤的生長（P<0.05），且小鼠CD4+、CD8+ T細胞的數量及占比均增加（P<0.05），TIM3、LAG3、TIGIT、TOX1、TOX2、TOX3的基因表達均上調（P<0.05）。結論：西紅花提取物能提高肺腺癌免疫微環境中的CD4+、CD8+ T細胞的占比，增強免疫治療的抗腫瘤作用，進而提高肺癌免疫治療效果，抑制肺癌發展。

關鍵詞 西紅花 免疫微環境 肺腺癌 免疫治療

中圖分類號：R965； R282.71 文獻標志碼：A 文章編號：1006-1533（2024）01-0003-09

引用本文 李詩穎， 李存雅， 張雪， 等. 西紅花提取物調控免疫細胞，提高程序性死亡受體-1抑制劑治療肺腺癌效果的實驗研究[J]. 上海醫藥， 2024， 45（1）： 3-11； 28.

基金項目：上海市2022年度“科技創新行動計劃”醫學創新研究專項項目（22Y31920104）；上海市虹口區第二輪“國醫強優”三年行動計劃（2022—2024年）中西醫結合重點專科、薄弱專科建設項目（HKGYQYXM-2022-10）；上海市2021年度“科技創新行動計劃”揚帆計劃項目（21YF444400）；上海市2022年度“科技創新行動計劃”啟明星培育（揚帆專項）項目（22YF1444900）；山東省鄉村振興基金會張秀蘭慈善基金項目

Experimental study of saffron extracts to modulate immune cells to improve the efficacy of a programmed death-1 inhibitor in the treatment of lung adenocarcinoma

LI Shiying1， LI Cunya1， ZHANG Xue2， ZHONG Yi1

（1. Department of Oncology， Shanghai TCM-Integrated Hospital， Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 200082， China； 2. Shanghai Traditional Chinese Medicine Co.， Ltd.， Shanghai 200082， China）

ABSTRACT Objective： A number of studies have shown that saffron extracts can affect the development of tumor. This study explored the effect of saffron extract on tumor immune microenvironment and immunotherapy in a mouse model of lung adenocarcinoma so as to provide more basic data for the anti-tumor research of saffron extracts. Methods： The transplanted tumor model of Lewis lung carcinoma-luciferase in mice was established to detect the effect of saffron extracts on the transplanted tumor in vivo. At the same time， the tumor growth was tracked by in vivo imaging technique. The number and proportion of CD4+ and CD8+ T cells were determined by flow cytometry. The mRNA levels of programmed death-ligand 1， T cell immunoglobulin and mucin domain-containing protein 3 （TIM3）， lymphocyte-activation gene-3 （LAG3）， T cell immunoreceptor with immunoglobulin and ITIM domain （TIGIT）， thymocyte selection-associated high mobility group box （TOX） 1， TOX2 and TOX3 were detected by reverse transcription-polymerase chain reaction （RT-PCR） and immunohistochemical techniques to verify the effect of saffron extracts on the regulation of tumor immune microenvironment. Results： Compared with the control group， the administration of saffron extracts could inhibit the growth of subcutaneous tumor in mice to a certain extent， and the number and proportion of CD4+ and CD8+ T cells were increased （P<0.05）， and the expression of genes encoding TIM3， LAG3， TIGIT， TOX1， TOX2 and TOX3 was up-regulated （P<0.05）. Conclusion： The saffron extracts can increase the proportion of CD4+ and CD8+ T cells in tumor microenvironment， enhance the anti-tumor effect of immunotherapy， thereby improving the effect of lung cancer immunotherapy and inhibiting the development of lung cancer.

KEY WORDS saffron； immune microenvironment； lung adenocarcinoma； immunotherapy

腫瘤是一類惡性疾病，2018年全球腫瘤死亡病例數達約960萬人，較2008年增加26.3%，其中男性腫瘤死亡病例數增加最多的是肺癌，增加了23.4萬人[1-2]。肺癌是腫瘤防治工作的重點之一。腫瘤免疫治療是一種基于腫瘤生長受到免疫系統監視的理論而產生并不斷發展的腫瘤治療方法，其中免疫檢查點抑制劑如程序性死亡受體-1（programmed death-1， PD-1）/程序性死亡受體配體1（programmed death-ligand 1， PD-L1）抑制劑、細胞毒T淋巴細胞相關抗原-4抑制劑等，已廣泛用于多種腫瘤治療，包括非小細胞肺癌治療[3]，但免疫治療仍存在耐藥性和毒副反應問題。

西紅花（saffron）為我國傳統中藥，其是鳶尾科番紅花屬多年生球莖草本植物番紅花（Crocus sativus L.）的干燥柱頭。目前，西紅花的多種活性成分已被分離出來，主要包括西紅花酸、西紅花醛、西紅花苷和西紅花素等[4]。有研究顯示，西紅花提取物能影響腫瘤的發展進程，如西紅花醛可通過下調核因子κB-κB抑制因子激酶和蛋白激酶B信號通路，抑制人前列腺癌細胞PC-3裸鼠皮下移植瘤的生長[5]。另有研究顯示，西紅花苷具有通過提高B淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2， Bcl-2）蛋白相關X蛋白與Bcl-2蛋白的比值而抑制結直腸癌細胞生長和靶向p53蛋白而誘導胃癌細胞凋亡的作用[6-7]。

聯合中醫藥或中藥有效單體進行抗腫瘤治療，提高腫瘤免疫治療效果、降低毒副反應風險，這是當下中西醫結合防治腫瘤領域的主要研究方向之一。本實驗基于腫瘤微環境學說，探究西紅花提取物在肺腺癌小鼠模型中對腫瘤免疫微環境和免疫治療效果的影響，為西紅花提取物抗腫瘤研究提供更多基礎性數據。

1 材料與方法

1.1 細胞系及細胞培養

Lewis肺癌（Lewis lung carcinoma， LLC）細胞來源于中國科學院生物化學與細胞生物學研究所，所有LLC細胞系傳代不超過6個月。

取LLC細胞構建LLC-螢光素酶（luciferase）細胞。

將LLC- luciferase細胞置于含有10%胎牛血清和0.1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養基中，放入37 ℃、5%二氧化碳培養箱培養，連續傳代至細胞到達對數生長期后待用。

1.2 主要試劑與儀器

胎牛血清、DMEM培養基、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline， PBS）購自美國GIBCO公司；D-熒光素鉀鹽（XenoLight D-luciferin potassium salt）購自美國Perkin Elmer公司；異硫氰酸熒光素標記的抗小鼠CD3單克隆抗體、藻紅蛋白標記的抗小鼠CD4單克隆抗體、別藻青蛋白標記的抗小鼠CD8單克隆抗體購自美國BioLegend公司；Trizol試劑購自美國Thermo Science公司；反轉錄試劑盒、SYBR Green聚合酶鏈式反應試劑盒購自大連的Takara公司；反轉錄-聚合酶鏈式反應（reverse transcription-polymerase chain reaction， RT-PCR）引物由上海的Sangon Biotech公司設計并提供。

Lumina XR活體成像系統（軟件：Lumina Ⅱ Living Image 4.3）購自美國Perkin Elmer公司；實時熒光定量聚合酶鏈式反應儀（型號：7500 Fast）購自美國ABI公司。

1.3 藥物制備

西紅花醇提物由上海市藥材有限公司提供。該醇提物的提取率為45%，根據西紅花飲片用量推算，小鼠用量為175.5 mg/kg，用生理鹽水配制成濃度為21.9 mg/mL的溶液，保存于4 ℃冰箱中待用。

西紅花醛由上海市藥材有限公司提供。根據大鼠常規用量0.4 mg/kg和大、小鼠體表面積換算，小鼠常規用量為0.58 mg/kg，用生理鹽水配制成濃度為0.145 mg/mL的溶液，保存于4 ℃冰箱中待用。

PD-1抑制劑卡瑞利珠單抗購自蘇州盛迪亞生物醫藥有限公司。該藥的常規用量為8 mg/kg，用生理鹽水配制成濃度為2 mg/mL的溶液，保存于4 ℃冰箱中待用。

1.4 小鼠皮下瘤模型建立

54只C57BL/6J小鼠（雄性，4～6周齡，20～25 g），購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司[許可證號：SCXK（滬）2013-0016]，飼養于上海中醫藥大學實驗動物中心[實驗單位使用許可證號：SYXK（滬）2014-0008]，“無特定病原體”環境，溫度（22±2）℃，相對濕度（55±5）%，光照/黑暗周期12/12 h。本實驗通過上海中醫藥大學實驗動物倫理委員會審查（倫理審查編號：PZSHUTCM210402011）。

為建立荷瘤小鼠模型，先將對數生長期的LLCluciferase細胞用0.25%胰蛋白酶消化，然后細胞計數，1 000 r/min離心處理5 min，棄上清液，再用PBS稀釋至5×10⁶個細胞/mL濃度，取0.1 mL細胞懸液接種于小鼠右側腋下。若接種后第5天，小鼠右側腋下可觸及大小均一的腫塊，即造模成功。

根據實驗目的，將荷瘤小鼠按體質量隨機分組，共分為空白對照組、模型對照組、免疫治療組、西紅花醇提物組、西紅花醇提物聯合免疫治療組、西紅花醛組、西紅花醛聯合免疫治療組7組，每組6只。對每組小鼠分別給予相應治療共28 d。其中，對空白對照組和模型對照組，分別給予生理鹽水灌胃[0.2 mL/（次？d）]和腹腔注射[0.1 mL/（次？3 d）]；對免疫治療組，給予卡瑞利珠單抗腹腔注射[0.1 mL/（次？3 d）]；對西紅花醇提物組，灌胃給藥[0.2 mL/（次？d）]；對西紅花醛組，腹腔給藥[0.1 mL/（次？d）]；對西紅花醇提物聯合免疫治療組，灌胃給予西紅花醇提物[0.2 mL/（次？d）]和腹腔注射卡瑞利珠單抗[0.1 mL/（次？3 d）]；對西紅花醛聯合免疫治療組，腹腔注射西紅花醛[0.1 mL/（次？d）]和卡瑞利珠單抗[0.1 mL/（次？3 d）]。每天測量小鼠皮下瘤的長度和寬度，并稱重。實驗結束后，采用頸椎脫臼法處死小鼠，分離出移植瘤并稱重。

1.5 活體成像檢查

運用Lumina XR活體成像系統對荷瘤小鼠進行活體成像檢查。檢查前給小鼠腹腔或尾靜脈注射螢光素酶10μL/g。注射后將小鼠置于麻醉機內，用2%異氟烷進行預麻醉，然后將小鼠放入活體成像設備內，用1%異氟烷維持麻醉狀態，在距注射螢光素酶后約10 min小鼠熒光信號達到最強穩定平臺期時，進行活體成像檢查。

1.6 流式細胞檢測

研磨制備各組小鼠脾臟組織的單細胞懸液，加入紅細胞裂解液裂解紅細胞，清洗、離心處理并用PBS洗滌多次后，分別加入異硫氰酸熒光素標記的抗小鼠CD3單克隆抗體、藻紅蛋白標記的抗小鼠CD4單克隆抗體、別藻青蛋白標記的抗小鼠CD8單克隆抗體，4 ℃下孵育1 h，細胞再用PBS洗滌3次，加入PBS混勻，運用流式細胞儀（型號：BD FACSCantoⅡ）進行檢測。

1.7 RT-PCR檢測

使用Trizol試劑從荷瘤小鼠的腫瘤組織中提取總RNA，然后進行濃度和純度檢測。使用反轉錄試劑盒將1 μg總核糖核酸反轉錄成cDNA。使用SYBR Green聚合酶鏈式反應試劑盒20 μL反應體系進行實時熒光定量聚合酶鏈式反應。使用表1所示引物，對目的基因進行擴增，按以下步驟得到目的基因的擴增曲線和熔融曲線：95 ℃預變性10 min后，進入變性-退火-延伸循環。其中，95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共進行40個循環。檢測并記錄各基因的Ct值。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase， GAPDH）基因表達水平作為內源性對照，采用2-ΔΔCt方法計算相對基因表達水平。

1.8 統計學方法

2 結果

2.1 西紅花提取物抑制荷瘤小鼠腫瘤發展

2.1.1 小鼠體質量

實驗結束時，與空白對照組相比，各組小鼠的體質量均減輕，表明腫瘤是消耗性疾病。此外，與模型對照組相比，免疫治療組小鼠的體質量增加，其余各治療組小鼠的體質量減輕，但差異均無統計學意義（表2，P>0.05），表明西紅花提取物的使用對荷瘤小鼠體質量沒有顯著影響，實驗劑量的西紅花提取物對小鼠安全。

2.1.2 瘤體質量

2.1.2.1 西紅花醇提物

實驗結束時，與模型對照組相比，免疫治療組、西紅花醇提物組、西紅花醇提物聯合免疫治療組小鼠的瘤體質量均減輕，但差異均無統計學意義（表3，P>0.05）。小鼠瘤體質量符合實驗動物福利倫理最新規定的要求[8]。

2.1.2.2 西紅花醛

實驗結束時，與模型對照組相比，西紅花醛聯合免疫治療組小鼠的瘤體質量顯著減輕，差異有統計學意義（表4，P<0.05），表明西紅花醛有一定的抑制腫瘤發展作用。小鼠瘤體質量符合實驗動物福利倫理最新規定的要求[8]。

2.2 西紅花提取物調節荷瘤小鼠免疫系統

2.2.1 西紅花醇提物

實驗結束時，與模型對照組相比，免疫治療組小鼠脾臟組織中CD4+ T細胞的數量和CD8+ T細胞的數量及占比均增加，差異均有統計學意義（P<0.05）；西紅花醇提物組和西紅花醇提物聯合免疫治療組小鼠脾臟組織中CD8+ T細胞的數量及占比均增加，差異均有統計學意義（P<0.05）。這些數據（圖1、2）表明，單獨使用西紅花醇提物、聯合使用西紅花醇提物和免疫治療均能有效改善荷瘤小鼠機體的免疫功能。

2.2.2 西紅花醛

實驗結束時，與模型對照組相比，免疫治療組小鼠脾臟組織中CD4+、CD8+ T細胞的數量均增加，差異均有統計學意義（P<0.05）；西紅花醛聯合免疫治療組小鼠脾臟組織中CD4+ T細胞數量減少，差異有統計學意義（P<0.05）。此外，與免疫治療組相比，西紅花醛組小鼠脾臟組織中CD4+、CD8+ T細胞的數量均減少，差異均有統計學意義（P<0.05）；西紅花醛聯合免疫治療組小鼠脾臟組織中CD8+ T細胞的數量及占比均減少，差異均有統計學意義（P<0.05）。這些數據（圖3、4）表明，西紅花醛調節荷瘤小鼠免疫功能的作用與西紅花醇提物不同，有待進一步的實驗研究。

2.3 西紅花提取物調節腫瘤相關免疫抑制受體基因mRNA表達水平

2.3.1 西紅花醇提物

實驗結束時，與模型對照組相比，免疫治療組小鼠TIGIT、TOX1、TOX2、TOX3的mRNA表達均上調，差異均有統計學意義（P<0.05）；西紅花醇提物組小鼠LAG3、TIGIT、TOX1、TOX2的mRNA表達均上調，差異均有統計學意義（P<0.05）；西紅花醇提物聯合免疫治療組小鼠LAG3、TIGIT、TOX1、TOX2、TOX3的mRNA表達均上調，差異均有統計學意義（P<0.05）。此外，與免疫治療組相比，西紅花醇提物組小鼠PD-L1 mRNA表達下調，但差異無統計學意義；LAG3 mRNA表達上調，差異有統計學意義（P<0.05）。詳情見圖5。

2.3.2 西紅花醛

實驗結束時，與模型對照組相比，西紅花醛組小鼠LAG3、TIGIT、TOX1、TOX2的mRNA表達均上調，差異均有統計學意義（P<0.05）；西紅花醛聯合免疫治療組小鼠LAG3、TIGIT、TOX1的mRNA表達均上調，差異均有統計學意義（P<0.05）。此外，與免疫治療組相比，西紅花醛組和西紅花醛聯合免疫治療組小鼠PD-L1 mRNA表達均下調，但差異均無統計學意義。詳情見圖6。

3 討論

肺癌的發病率和死亡率均很高，其是腫瘤防治工作的重點和難點。免疫治療對肺癌有較好的效果，但仍存在耐藥性和毒副反應問題。中醫藥作為中國傳統文化的瑰寶，如何發揮中醫藥的獨特優勢來達到輔助提高免疫治療效果、降低毒副反應的目的，是中西醫結合防治肺癌領域的重要研究方向之一。

西紅花在我國是珍稀藥材，臨床上用于多種疾病治療，包括抗腫瘤治療。西紅花苷作為西紅花的主要有效成分之一，已被證實可通過降低炎癥標志物環氧合酶-2、誘導型一氧化氮合酶、核因子κB、腫瘤壞死因子-α及其受體的活性而呈現抗肝細胞癌作用[9]。Samarghandian等[10-12]通過實驗發現，西紅花提取物對肺癌細胞有細胞毒活性，對正常細胞生長則無明顯抑制作用。Liu等[13]驗證了西紅花提取物對肺癌細胞株A549和H446的抗增殖作用，并通過裸鼠皮下移植瘤模型從細胞凋亡的角度發現其可能是通過調控caspase-8/9/3通路而誘導肺癌細胞凋亡的。

本實驗以肺腺癌為切入點，挖掘西紅花提取物抑制肺癌發展的可能途經和提高肺癌免疫治療效果的相關機制，以期為西紅花提取物抗腫瘤研究提供更多的基礎性數據。實驗結果顯示，與模型對照組相比，西紅花醛和西紅花醛聯合免疫治療均有一定的抑制肺癌模型小鼠瘤體生長的作用。此外，與模型 對照組相比，西紅花醛組小鼠的體質量無明顯改變，表明實驗劑量的西紅花醛對小鼠安全。

CD4+、CD8+ T細胞是參與機體T細胞免疫應答的細胞，是機體免疫微環境的主要組分之一，它們的占比能夠反映機體的免疫狀態，對機體的免疫功能起著重要作用。腫瘤患者的免疫功能與CD4+ T細胞與CD8+ T細胞的比值呈正相關關系[14-15]。有研究發現，西紅花醇提物可抑制7，12-二甲基苯并蒽誘導的小鼠皮膚腫瘤發展：小鼠在腫瘤化療的同時口服西紅花醇提物，其生存期延長，骨髓抑制減輕，免疫功能改善[16]。本實驗結果也顯示，西紅花提取物能提高肺癌模型小鼠的免疫功能，改善肺癌免疫微環境，從而抑制肺癌發展。

本實驗還進行了基因層面的實驗研究，結果顯示與免疫治療相比，西紅花提取物雖能下調PD-L1 mRNA表達，但差異沒有統計學意義，可能與本實驗采用PD-1抑制劑作為對照，致使西紅花提取物對腫瘤細胞PD-L1表達的影響不明顯有關。此外，與模型對照組相比，各治療組小鼠LAG3、TIGIT、TIM3的mRNA沒有下調趨勢，這可能與基因后續轉錄環節有關。有研究表明，LAG3的表達受轉錄水平調控[17]。另有研究發現，TIM3 mRNA表達與CD4+ T細胞的產生是同步的，TIM3 mRNA的表達可能會隨CD4+ T細胞數量及占比的增加而上調[18]。至于TOX1、TOX2、TOX3的mRNA水平呈現上調趨勢，可能與CD8+ T細胞占比增高有關[19]。

綜上所述，西紅花提取物能抑制肺癌發展，可能的作用機制是：提高腫瘤免疫微環境中的CD4+、CD8+ T細胞的數量及占比，增強免疫細胞的抗腫瘤效應，從而提高免疫治療效果，抑制肺癌發展。但本實驗未對西紅花提取物的作用靶點進行蛋白層面的驗證。后續除通過實驗驗證西紅花提取物作用靶點的蛋白表達外，還將繼續深入挖掘西紅花提取物抑制肺癌發展的具體信號通路及其基因表達調控機制，為西紅花提取物抗腫瘤研究提供更多基礎性數據。

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