腫瘤細胞3D無支架培養技術研究進展及其在藥效評價中應用

陳艷閣 汪海峰

摘 要 作為三維（3D）細胞培養技術之一的3D無支架培養技術，其廣泛應用于腫瘤3D細胞模型的構建之中。了解當前腫瘤細胞3D無支架培養技術的應用情況，以及腫瘤3D細胞模型的構建成果對于抗癌藥物的研發與評價很重要。本文介紹了構建腫瘤3D細胞模型的超低吸附著板培養法、懸滴培養法、磁懸浮培養法和旋轉式細胞培養系統以及它們的局限性，并簡述了腫瘤3D細胞模型用于藥效評價的新進展，以期為腫瘤3D細胞模型的構建及抗癌藥的藥效評價提供參考。

關鍵詞 3D腫瘤細胞模型 無支架細胞培養技術 藥效評價

中圖分類號：R965 文獻標志碼：A 文章編號：1006-1533（2024）01-0075-05

引用本文 陳艷閣， 汪海峰. 腫瘤細胞3D無支架培養技術研究進展及其在藥效評價中應用[J]. 上海醫藥， 2024， 45（1）： 75-79.

基金項目：遼寧省教育廳科學研究經費項目青年科技人才“育苗”項目（LQ2020021）

Research progress in 3D scaffold-free culture of tumor cell and its application in pharmacodynamic evaluation

CHEN Yange， WANG Haifeng

（College of Chemical Engineering， Shenyang University of Chemical Technology， Shenyang 110142， China）

ABSTRACT As one of the three-dimensional （3D） cell culture technologies， the 3D scaffold-free culture technology is widely used in the construction of tumor 3D cell models. It is important to understand the current application of tumor cell 3D scaffold-free culture techniques and the results of tumor 3D cell model construction for the development and evaluation of antitumor drugs. This article introduces the ultra-low attachment plates culture， hanging drop technique， magnetic levitation culture and rotary cell culture system for constructing a 3D cell model of tumors and their limitations， and outlines some new progress of the application of 3D cell models in the pharmacodynamic evaluation so as to provide reference for the construction of 3D cell models of tumors and the efficacy evaluation of anticancer drugs.

KEY WORDS 3D tumor cell model； scaffold-free cell culture techniques； pharmacodynamic evaluation

在抗腫瘤藥物的研發中，離不開模型的選擇與建立，相關的模型有傳統的二維細胞模型、動物模型以及新興起的三維（3D）細胞模型。3D細胞模型因為能更好地模擬體內細胞微環境、更接近于人體內真實情況、且遵循3R原則而被越來越多研究人員所選擇[1]。構建腫瘤的3D細胞模型可以更加有利于研究腫瘤的發生發展、腫瘤藥物的研發與評價。但是腫瘤3D細胞培養技術還處于初級探索階段，對于細胞適合的培養方法、培養條件、細胞球維持時間上、細胞球保存方法[2]、細胞球觀察[3]還有待研究。腫瘤3D細胞模型的構建可以分為有支架細胞培養技術和無支架細胞培養技術，基于無支架細胞培養技術的腫瘤3D細胞模型研究成本低、操作簡單可以批量生產。本文綜述了腫瘤3D細胞模型無支架細胞培養技術的4種類型，即超低吸附法培養、懸滴培養法、磁懸浮培養法及旋轉式細胞培養系統，探討基于無支架細胞培養技術的腫瘤3D細胞模型的構建條件，以及這類腫瘤3D細胞模型在抗腫瘤藥物的藥效評價方面應用。

1 無支架細胞培養技術

簡單來說，無支架細胞培養技術就是讓腫瘤細胞自發聚集在一起，形成類似于球形的細胞團[4]。無支架細胞培養技術可以分為利用超低吸附減少細胞附著的超低附著板培養法、利用重力和液面表面張力的懸滴培養法、利用磁場使得磁化后的細胞自發成球的磁懸浮培養法、利用旋轉產生失重的旋轉式細胞培養系統等。

1.1 超低吸附著板培養法

384孔板比96孔板更有利于乳腺癌細胞成球，并且基質凝膠與生長因子配比對于細胞成球效果有影響[5]。不同細胞系形成的細胞球形態不同，Malh？o等[6]利用超低吸附孔板培養MCF7、MDA-MB-231和SKBR3腫瘤細胞和MCF12A非腫瘤細胞，發現 MCF7和MDAMB-231的細胞球較為致密，而SKBR3和MCF12A形成的細胞球較為松散，對細胞球內的細胞進行觀察，發現MCF7在第3天已經出現腺泡結構的特征。

張靜等[7]研究發現細胞球大小與接種濃度成線性關系，并且噻唑藍法比酸性磷酸酶法更適合3D活力測定。馮珊珊等[8]將人肝癌細胞和人肝星形細胞接種到超低吸附孔板中共培養，并對細胞球石蠟切片方法進行優化，縮短了制片時長和簡化了操作流程。杜鳴等[9]在96孔板中培養食管鱗癌細胞球，并且發現臍帶間充質干細胞上層清夜可以促進細胞球的生長和形態的維持。

1.2 懸滴培養法

進行懸滴培養法時培養基容易蒸發，Jeong等[10]評估了培養基蒸發率，并利用人類結直腸癌細胞（HCT116）首次培養出直徑超過1.5 mm的大型腫瘤3D細胞模型。光動力療法是治療癌癥的方法之一[11]。有研究者利用懸滴法構建多個黑色素瘤，發現黑色素瘤能夠在人工真皮中侵襲并且增殖，經光動力療法后腫瘤細胞增殖能被有效抑制，為光動力療法的有效性提供了實驗依據[12]。Badea等[13]利用懸滴培養法培養乳腺癌細胞MDA-MB-231，觀察發現接種量為8 000細胞/滴時可獲得致密型細胞球，接種量為2 500、5 000細胞/滴時可獲得疏松型細胞球，而且NRF2和Hsp70蛋白可作為MDA-MB-231 3D細胞模型形成的分子標志物，為設計抗腫瘤藥物提供新靶點。

將結腸癌HT-29細胞懸液滴在聚四氟乙烯粉末上的懸滴培養法，和PDMS鋪在在普通96孔板底部的超低吸附培養法，在激光共聚焦顯微鏡下觀察，發現兩種方法與2D細胞模型形態不同，表明兩種方法均能成功構建出結腸癌HT-29的3D細胞模型[14]。

超低吸附著板培養法和懸滴培養法應用于3D細胞模型的構建比較廣泛[15]，但在利用超低吸附著板培養法和懸滴培養法兩種方法培養腎上腺皮質癌、垂體神經內分泌瘤和嗜鉻細胞瘤3D模型時，發現兩種培養模式下的腫瘤3D細胞模型效果不佳，其中垂體神經內分泌瘤更適合用有支架細胞培養技術來培養[16]。

1.3 磁懸浮培養法

磁懸浮培養法就是通過磁力將被磁化的細胞聚集一起的細胞培養方法[17]，其克服了細胞球容易解體及維持時間短的缺點[18]。Onbas等[19]證明在磁懸浮裝置中改變培養時間、磁性劑濃度對于3D細胞模型的大小有影響，并用磁懸浮培養法構建了人上皮乳腺腺癌MCF7和MDA-MB-231、人骨髓神經母細胞瘤SH-SY5Y、大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤PC-12和人上皮宮頸腺癌HeLa的3D細胞模型。Türker等[20]對懸浮裝置進行了改進，促進了NIH 3T3小鼠成纖維細胞與HCC 827非小細胞肺癌細胞間的相互作用，從而形成3D細胞模型。磁懸浮法作為新興起培養技術，不僅須考慮其磁性材料對細胞毒性大小的影響，還須考慮可操作空間是否滿足操作要求[21]。

1.4 旋轉式細胞培養系統

目前，對于生物反應器的改進是研究熱點之一[22]，其在多功能干細胞培養中應用較多，可以誘導多功能干細胞分化成心肌細胞[23-24]及用于CAR-T 細胞的大規模培養[25]。

旋轉式細胞培養系統是生物反應器的一種，其可以提供失重環境，有利于生物標志物的發現。在旋轉式細胞培養系統培養72 h后，膠質母細胞瘤細胞系U87MG 3D細胞模型形態學變化，細胞球的形態學的變化使得細胞的生長特征也發生改變。用免疫印跡法檢測發現U87MG細胞中蛋白表達也發生變化，U87MG細胞中的PCNA蛋白和Bcl-2蛋白可成為膠質母細胞瘤的生物標志物[26]。

旋轉式細胞培養系統雖然可以用來研究失重對于細胞的影響，但是利用旋轉式細胞培養系統還須考慮設備的成本和滅菌工作[27]。

2 基于腫瘤3D細胞模型的藥效評價

對于腫瘤藥物的藥效評價，現在很多研究證實3D細胞模型與2D細胞模型有著顯著差異[28-29]。所以可以用腫瘤3D細胞模型來評價抗腫瘤藥物的藥效，以便獲得更加精確的數據。

張弛等[30]在超低吸附圓底96孔板中構建出HepaRG細胞的3D細胞模型，在不同濃度的曲格列酮藥物作用后，發現線粒體中活性氧自由基水平隨著曲格列酮藥物濃度的增加而增加，曲格列酮可能通過影響線粒體而發揮藥效。趙富周等[31]在超低吸附孔板培養了A549及H1650細胞的3D細胞模型，用于對異牡荊素的影響和作用機制進行探究，發現異牡荊素可以有效地降低細胞球成球率及細胞活性。

用96孔懸滴板、24低附著孔板和96超低吸附孔板來培養BON1細胞，并對不同濃度的舒尼替尼進行藥效評價，藥物對于懸滴培養法培養的細胞球周長沒有顯著差別，但在24和96孔板中，細胞球體周長均減少，然而24孔板培養的細胞球比96孔板培養的細胞球在數據收集方面操作困難，所以96超低吸附孔板更適合BON1細胞球的構建及舒尼替尼藥效評價[32]。

對氟尿嘧啶和伊立替康兩種藥物進行藥效評價，發現氟尿嘧啶主要抑制胞球外層細胞生長，而伊立替康比氟尿嘧啶更有效地滲透到細胞球內部，從而影響整個細胞球的生長，最終使致密結構的細胞球崩解[14]。

有文獻提出可將患者的細胞體外培養來評價腫瘤細胞對于藥物的耐藥性，做到精準治療，由患者來源的膠質母細胞瘤細胞來構建3D細胞模型，將細胞接種到專用于懸浮培養的細胞培養瓶中培養，發現細胞球對于替莫唑胺表現出更強的耐藥性[33]。

腫瘤3D細胞模型還可以對于候選藥物的藥效進行評估，Jouberton等[34]建立了一個操作簡單、重復性高的前列腺癌3D細胞模型，并對多西紫杉醇和前藥TH-302進行評價，隨著3D細胞模型體積的增加多西紫杉醇的耐藥性增強，而低氧區域的增加則增強了TH-302的活性。此外，用構建的3D細胞模型來檢測藥物與免疫療法的結合也為新藥研發提供了參考，在研究BH3模擬物（BH3 mimetics）與自然殺傷（NK）細胞免疫療法結合使用時，發現BH3模擬物和免疫細胞聯合使用比單獨使用藥物或者添加免疫細胞更能引起腫瘤細胞發生凋亡，聯合使用也降低了BH3模擬物的細胞毒性[35]。

3 展望

盡管腫瘤3D細胞模型的構建受到了廣泛的關注，但是無支架細胞培養技術在構建腫瘤3D細胞模型中仍然有缺點，包括形成的球形不規則、細胞球的大小受到限制、維持時間短等。隨著精準醫療的發展，對于細胞模型的可重復性及監測性要求更為嚴格[36]。細胞球之間融合方式和融合時信息交流及不同細胞系間融合速率快慢的探究，更加有助于了解腫瘤發生發展過程。所以，作為新興起的3D細胞模型仍然需要大量的實驗研究來探索每類腫瘤細胞最適合的3D細胞培養方法。并且選擇適合的培養方法來構建3D細胞模型，除了可縮短實驗研究到臨床應用所需時間以外，還使得研究結果更加精確，更有利于醫藥行業的發展。

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