ncRNA介導(dǎo)的EphB4上調(diào)與低級別膠質(zhì)瘤不良預(yù)后及腫瘤免疫浸潤的相關(guān)性

吳 錚 任志偉 高潤石 孫 軻 張國君

根據(jù)世界衛(wèi)生組織定義,Ⅱ級和Ⅲ級少突細(xì)胞瘤和星形細(xì)胞瘤定義為低級別膠質(zhì)瘤(lower-grade glioma,LGG)[1]。盡管目前在臨床上LGG的診斷和治療方面取得了一些成效,但部分患者仍不可避免地發(fā)展為高侵襲性膠質(zhì)瘤,導(dǎo)致治療效果降低和疾病預(yù)后不理想[2]。因此亟需深入研究LGG分子機(jī)制或?qū)ふ矣袧摿Φ念A(yù)后標(biāo)志物來尋找新的治療方案。

EphB4屬于最大的酪氨酸激酶受體家族Eph,包含A亞型EphA (A1～ A10)和B亞型EphB (B1～B6)[3]。EphB4在許多生物過程中起重要作用,如胚胎發(fā)育,包括軸突引導(dǎo)、組織邊界形成、骨骼發(fā)育、血管和淋巴發(fā)育[4]。研究發(fā)現(xiàn),EphB4受體在人體多種惡性腫瘤細(xì)胞中均高表達(dá),包括卵巢癌、胃癌、結(jié)腸癌細(xì)胞等[5～7]。隨著EphB4受體對腫瘤生成的影響日益突顯,其在腫瘤中表達(dá)、預(yù)后、機(jī)制等方面的研究就更值得深入探索。免疫治療是近些年腫瘤治療的新方法,是使用生物方法激活患者自身免疫系統(tǒng)加強(qiáng)抗腫瘤應(yīng)答,從而抑制腫瘤生長[8]。免疫細(xì)胞在腫瘤部位的浸潤是有效免疫治療的基礎(chǔ)。尋找評價(jià)免疫浸潤的指標(biāo)并研究其潛在機(jī)制將有助于免疫治療的進(jìn)展。目前EphB4對LGG的免疫浸潤的影響尚不明確,對于其表達(dá)機(jī)制仍然缺失。本研究以此為切入點(diǎn),通過生物信息學(xué)方法進(jìn)行研究,以期為其成為治療應(yīng)用的分子靶點(diǎn)提供理論支持。

材料與方法

1.數(shù)據(jù)下載、處理和分析:33種癌癥(ACC、BLCA、BRCA、CHOL、CESC、COAD、DLBC、ESCA、GBM、HNSC、KICH、KIRC、KIRP、LAML、LIHC、LGG、LUAD、LUSC、OV、MESO、PAAD、PCPG、PRAD, READ, SKCM、STAD、SARC、TGCT、THCA、THYM、UCEC、UCS和UVM)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)從癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)數(shù)據(jù)庫中下載。

2.基因表達(dá)譜交互分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA)數(shù)據(jù)庫預(yù)測:GEPIA數(shù)據(jù)庫是一個癌癥組織和正常組織基因表達(dá)譜的網(wǎng)絡(luò)工具[9]。GEPIA數(shù)據(jù)庫可以用來分析不同癌癥中EphB4和lncRNA的表達(dá)情況以及EphB4對不同癌癥生存期的影響,包括總生存期(overall survival, OS)和無病生存期(disease free survival, DFS)。本研究還利用GEPIA數(shù)據(jù)庫評估預(yù)測的ncRNA對LGG的預(yù)后影響,以及EphB4與LGG的免疫檢查點(diǎn)之間表達(dá)相關(guān)性。

3.潛力miRNA預(yù)測:通過PITA、RNA22、miRmap、microT、miRanda、PicTar和TargetScan等7個靶基因預(yù)測程序預(yù)測EphB4的上游結(jié)合miRNA,用于后續(xù)分析。這些預(yù)測的miRNA被認(rèn)為是EphB4的候選miRNA。

4.starBase數(shù)據(jù)庫分析:starBase是探究miRNA相關(guān)研究的數(shù)據(jù)庫。本研究利用starBase數(shù)據(jù)庫分析LGG中miRNA-EphB4和lncRNA-hsa-miR-346表達(dá)的相關(guān)性。此外,starBase用于分析hsa-miR-346在LGG和正常組織中的表達(dá)情況,以及預(yù)測與hsa-miR-346相關(guān)的lncRNA。

5.miRNA在LGG和非癌人尿液中的表達(dá)分析:在基因表達(dá)綜合(Gene Expression Omnibus,GEO)數(shù)據(jù)庫中檢索LGG和非癌人的尿液miRNA相關(guān)數(shù)據(jù),并下載GSE145510,利用R studio軟件,選用limma包等對潛力的miRNA進(jìn)行差異分析驗(yàn)證。

6.腫瘤免疫評估資源(Tumor Immune Estimation Resource,TIMER)數(shù)據(jù)庫分析:TIMER數(shù)據(jù)庫是用于分析腫瘤中免疫浸潤細(xì)胞情況的網(wǎng)絡(luò)工具。TIMER數(shù)據(jù)庫用于分析LGG中EphB4與免疫細(xì)胞浸潤水平相關(guān)性和免疫檢查點(diǎn)表達(dá)相關(guān)性。

7.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:本研究的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析是由在線數(shù)據(jù)庫自動生成,以P<0.05或者Log-rankP<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中,EphB4在33種癌癥中的表達(dá)利用R語言limma包將數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化并進(jìn)行TPM格式化后進(jìn)行Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。在相關(guān)性預(yù)測中,r>0.1 和P<0.05 視為篩選條件。

結(jié) 果

1.EphB4表達(dá)的泛癌分析:為了探究EphB4在致癌過程中可能的作用,本研究首先分析了EphB4在33種癌癥中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,與正常組織比較,EphB4在16種癌癥中明顯上調(diào)(BLCA、BRCA、CHOL和THYM等),在11種癌癥中明顯下調(diào)(CESC、KICH和KIRC等),詳見圖1A。接著本研究采用GEPIA數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步驗(yàn)證EphB4在癌癥中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,與正常組織比較,EphB4在CHOL、COAD、GBM、LGG、PAAD、READ、STAD、TGCT、THYM中明顯上調(diào);在KICH、LAML、OV、PCPC、THCA、UCFC、UCS中明顯下調(diào),詳見圖1B。以上結(jié)果說明EphB4有可能是這16種癌癥的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。

圖1 EphB4基因在不同癌癥中的表達(dá)水平

2.EphB4在人癌中的預(yù)后評估:本研究通過OS和DFS指標(biāo)評估EphB4的表達(dá)對上述33種癌癥患者生存期的影響。在OS預(yù)測結(jié)果中發(fā)現(xiàn),EphB4高表達(dá)會導(dǎo)致BLCA、BRCA、LGG和MESO患者有不良的預(yù)后,詳見圖2A。在DFS預(yù)測結(jié)果中發(fā)現(xiàn),EphB4高表達(dá)僅會導(dǎo)致LGG、MESO和PAAD患者有不良預(yù)后,詳見圖2B。結(jié)合上一結(jié)果,本研究在16種EphB4表達(dá)上調(diào)的癌癥中發(fā)現(xiàn)僅有LGG患者的OS和DFS結(jié)果均不良。以上結(jié)果說明EphB4可能是LGG患者的不良預(yù)后的標(biāo)志物。

圖2 GEPIA中EphB4表達(dá)與腫瘤生存預(yù)后的相關(guān)性

3.預(yù)測EphB4的上游miRNAs:眾所周知,ncRNA負(fù)責(zé)上游調(diào)節(jié)基因表達(dá)情況的因子。為了確定EphB4是否受某些ncRNA調(diào)節(jié),本研究首先預(yù)測了可能與EphB4結(jié)合的上游miRNA,最終發(fā)現(xiàn)了42個miRNA在LGG患者中與EphB4表達(dá)有相關(guān)性,詳見圖3A。基于miRNA調(diào)控靶基因表達(dá)的作用機(jī)制,miRNA與EphB4之間應(yīng)該存在負(fù)相關(guān)。因此,剔除了13個正相關(guān)的miRNA。之后本研究利用GEO數(shù)據(jù)庫中的GSE 145510進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)在剩余的29個miRNA中,hsa-miR-107、hsa-miR-133a-3p、hsa-miR-133b、hsa-miR-146-5p、hsa-miR-326、hsa-miR-346、hsa-miR-642a-5p和hsa-miR-1249-3p在非癌人尿樣中表達(dá)高于LGG尿樣(圖3B)。接著本研究預(yù)測8個潛力的miRNA表達(dá)對LGG患者OS影響。如圖3J～Q所列,只有hsa-miR-346的高表達(dá)與患者預(yù)后有顯著的正向調(diào)節(jié)關(guān)系。以上結(jié)果說明hsa-miR-346可能是LGG中EphB4最有潛力的調(diào)控 miRNA。

圖3 驗(yàn)證hsa-miR-346為LGG中EphB4的潛在上游miRNA

4.預(yù)測hsa-miR-346的上游lncRNA:本研究繼續(xù)使用starBase數(shù)據(jù)庫預(yù)測hsa-miR-346的上游長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA),并在GEPIA數(shù)據(jù)庫中驗(yàn)證這些lncRNA在LGG中的表達(dá)情況。本研究預(yù)測到的68個lncRNA篩選出在LGG中表達(dá)顯著上調(diào)的有5個:GAS5、PITPNA-AS1、GABPB1-AS1、UBA6-AS1和AP002748.3(圖4中A～E)。隨后,評估了5種lncRNA在LGG中的預(yù)后價(jià)值。由于lncRNA與miRNA之間應(yīng)該存在負(fù)相關(guān),而只有UBA6-AS1高表達(dá)會影響LGG患者的OS和DFS(圖4中F～O)。除此之外,本研究還使用starBase數(shù)據(jù)庫檢測了LGG中5種lncRNA與hsa-miR-346之間的表達(dá)相關(guān)性。綜合表達(dá)分析、生存分析和相關(guān)分析,UBA6-AS1可能是LGG中hsa-miR-346-EphB4軸的上游lncRNA。

圖4 LGG中與hsa-miR-346相關(guān)的上游lncRNA的表達(dá)、生存期及相關(guān)性分析

5.LGG中EphB4與免疫細(xì)胞浸潤的相關(guān)性:EphB4是Eph的成員之一,Eph受體在抗腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用,Eph受體是腫瘤相關(guān)抗原的來源,可誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生選擇性抗腫瘤免疫。LGG中免疫細(xì)胞的浸潤水平均受到EphB4不同類型體細(xì)胞拷貝數(shù)變異的影響。此外,本研究評估了EphB4表達(dá)水平與免疫細(xì)胞浸潤水平的相關(guān)性。在LGG中EphB4表達(dá)與所有分析的免疫細(xì)胞,包括B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞浸潤呈顯著正相關(guān)(圖5中A、B)。

圖5 LGG中免疫細(xì)胞浸潤和免疫檢查點(diǎn)與EphB4水平的關(guān)系

為了進(jìn)一步探究EphB4在腫瘤免疫中的作用,本研究利用GEPIA數(shù)據(jù)庫檢測了EphB4與LGG免疫細(xì)胞生物學(xué)標(biāo)志物的表達(dá)相關(guān)性。EphB4與B細(xì)胞生物學(xué)標(biāo)志物(CD19和CD79A),CD8+T細(xì)胞生物學(xué)標(biāo)志物(CD8B),CD4+T細(xì)胞的生物學(xué)標(biāo)志物(CD4),單核細(xì)胞的生物學(xué)標(biāo)志物(CD86和CD115),M1型巨噬細(xì)胞的生物學(xué)標(biāo)志物(NOS2和IRF5),M2型巨噬細(xì)胞的生物學(xué)標(biāo)志物(CD163、VSIG4和MS4A4A),中性粒細(xì)胞的生物學(xué)標(biāo)志物(CEACAM8、ITGAM和CCR7),以及樹突狀細(xì)胞的生物學(xué)標(biāo)志物(HLA-DPB1、HLA-DQB1、HLA-DRA、HLA-DPA1、CD1C、NRP1和ITGAX)呈顯著正相關(guān)(表1)。這些發(fā)現(xiàn)支持了EphB4與免疫細(xì)胞浸潤正相關(guān)的觀點(diǎn)。

表1 GEPIA數(shù)據(jù)庫檢測LGG中EphB4與免疫細(xì)胞生物學(xué)標(biāo)志物的相關(guān)性分析

6.LGG中EphB4與免疫檢查點(diǎn)的關(guān)系:PD1、PD-L1和CTLA-4是腫瘤免疫逃逸的重要免疫檢查點(diǎn)。考慮到EphB4在LGG中的潛在致癌作用,本研究評估了EphB4與PD1、PD-L1或CTLA-4的關(guān)系。TIMER數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示,LGG中EphB4的表達(dá)與PD1、PD-L1和CTLA-4呈顯著正相關(guān),這與純度有關(guān)(圖5中C～E)。與TIMER數(shù)據(jù)分析類似,GEPIA數(shù)據(jù)庫中也發(fā)現(xiàn),在LGG中EphB4與PD1、PD-L1或CTLA-4存在顯著的正相關(guān)(圖5中F～H)。這些結(jié)果表明,腫瘤免疫逃逸可能參與了EphB4致癌作用。

討 論

本研究通過生物信息學(xué)方法預(yù)測EphB4在LGG中的表達(dá)情況,以及其潛在的上游調(diào)控ncRNA,以期改進(jìn)免疫治療方法,更加精準(zhǔn)腫瘤治療靶標(biāo)。

近年來研究發(fā)現(xiàn),EphB4對腦腫瘤的發(fā)生、發(fā)展起重要作用,例如體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)EphB4促進(jìn)成神經(jīng)細(xì)胞瘤的增殖、遷移和浸潤[10]。但EphB4表達(dá)對膠質(zhì)瘤的影響尚存一些爭議,研究認(rèn)為,過表達(dá)EphB4改變膠質(zhì)瘤的血管形態(tài)發(fā)生、周細(xì)胞覆蓋和細(xì)胞凋亡,抵抗其抗血管治療[11];通過對患者腦組織中EphB4表達(dá)情況分析,認(rèn)為EphB4影響膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后[12, 13]。然而,另有研究認(rèn)為,EphB4的配體EFNB2對患者及小鼠膠質(zhì)瘤的生長有影響,EphB4對膠質(zhì)瘤患者預(yù)后無影響[14]。本研究通過TCGA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行EphB4的泛癌分析及GEPIA數(shù)據(jù)庫觀察EphB4表達(dá)情況。聯(lián)合生存分析驗(yàn)證EphB4高表達(dá)的LGG患者預(yù)后較差。

ncRNA包括miRNA、lncRNA和circularRNA,可以通過相互作用的ceRNA機(jī)制參與調(diào)節(jié)基因表達(dá)。在ceRNA網(wǎng)絡(luò)中,lncRNA作為內(nèi)源性分子競爭性地與miRNA結(jié)合,間接地調(diào)節(jié)mRNA的表達(dá)水平。大量實(shí)驗(yàn)表明,這種miRNA調(diào)控的lncRNA和mRNA網(wǎng)絡(luò)參與了癌癥的發(fā)生、發(fā)展和侵襲[15, 16]。本研究首先預(yù)測EphB4的上游調(diào)節(jié)miRNA,而后選取了LGG患者尿樣的miRNA檢測樣本,最終發(fā)現(xiàn)8個潛力的miRNA,這些潛力成員均有調(diào)節(jié)腫瘤的作用。其中hsa-miR-107是通過介導(dǎo)CDK14發(fā)揮腫瘤抑制劑的作用[17]。hsa-miR-133通過靶向FOXC1抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87的生長和侵襲[18]。包含hsa-miR-146的外泌體降低膠質(zhì)瘤移植物的生長[19]。lncRNA可以靶向hsa-miR-326/sirt1或hsa-miR-326/SOX9軸抑制腫瘤細(xì)胞的生長[20, 21]。hsa-miR-642通過調(diào)控SEMA4C和p38 MAPK信號通路在肝細(xì)胞癌中發(fā)揮抑癌作用[22]。與數(shù)據(jù)庫預(yù)測相反,研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)hsa-miR-1249可促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖,下調(diào)hsa-miR-1249可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖[23]。在綜合了表達(dá)分析和生存期分析后,本研究認(rèn)為,hsa-miR-346是最具潛力的上游miRNA抑制腫瘤靶向EphB4。既往研究發(fā)現(xiàn),hsa-miR-346通過靶向NFIB抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長,這些證據(jù)更支持了本研究的觀點(diǎn)[24]。

基于ceRNA假說,hsa-miR-346/EphB4軸的潛在lncRNA是LGG的致癌關(guān)鍵。接下來預(yù)測hsa-miR-346/EphB4軸上游lncRNA,發(fā)現(xiàn)68個可能的lncRNA。通過表達(dá)分析、生存分析和相關(guān)分析,本研究發(fā)現(xiàn)了1個最有可能的lncRNA-UBA6-AS1。據(jù)報(bào)道,UBA6-AS1通過GCN2-ATF4軸增強(qiáng)PARP1活性調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng),促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞存活[25]。但是在腦部膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的作用尚無研究。推測UBA6-AS1/hsa-miR-346/EphB4軸可能為潛在的調(diào)控LGG的通路。

大量研究證實(shí),腫瘤免疫細(xì)胞浸潤可影響化療、放療或免疫治療的療效及癌癥患者的預(yù)后。本研究結(jié)果表明,EphB4與LGG中的各種免疫細(xì)胞及這些浸潤免疫細(xì)胞的生物學(xué)標(biāo)志物均呈顯著正相關(guān)。這些結(jié)果表明腫瘤免疫浸潤可能是EphB4在LGG中致癌的部分原因。此外,免疫治療的療效不僅需要腫瘤微環(huán)境中有足夠的免疫細(xì)胞浸潤,還依賴于腫瘤微環(huán)境關(guān)于免疫檢查點(diǎn)的充分表達(dá)。因此,本研究也評估了EphB4與免疫檢查點(diǎn)之間的關(guān)系。在LGG中,EphB4高表達(dá)與PD1、PD-L1或CTLA-4密切相關(guān),這說明靶向EphB4可能會提高LGG的免疫治療療效。

綜上所述,本研究闡明了EphB4在多種類型的人類癌癥(包括LGG)表達(dá),并且揭示其與LGG不良預(yù)后相關(guān)。本研究還預(yù)測EphB4在LGG中的上游調(diào)控機(jī)制,即UBA6-AS1/hsa-miR-346/EphB4軸,并推測EphB4可能通過增加腫瘤免疫細(xì)胞的浸潤和免疫檢查點(diǎn)表達(dá)來增強(qiáng)其促癌作用。然而,這些結(jié)果還需要通過更多的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和大型臨床試驗(yàn)予以進(jìn)一步驗(yàn)證。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。