土大黃對銀屑病模型小鼠焦慮樣行為學的影響*

熱比姑麗·伊斯拉木，尤力都孜·買買提，巴合沙拉·馬乃甫，玉素甫江·艾力，高 莉，開麗比努爾·阿布來提

（1. 新疆維吾爾自治區維吾爾醫藥研究所，新疆 烏魯木齊 830000； 2. 新疆維吾爾醫方劑學實驗室，新疆 烏魯木齊 830000； 3. 新疆醫科大學維吾爾醫學院，新疆 烏魯木齊 830000）

銀屑病又名牛皮癬，屬免疫介導的慢性炎癥性皮膚病，以角質形成細胞過度增殖和異常分化及炎性細胞浸潤為主要特征［1-3］，也是被列為全球主要健康問題的少數非傳染性疾病之一。銀屑病患者多伴有不同程度的外表皮膚損害，易產生焦慮、抑郁等消極情緒，因其病程長且易復發，加之社會歧視、外界猜疑等因素影響，進一步加重病恥感，嚴重影響患者的日常生活和工作［4-6］。本課題組前期研究表明，土大黃對模型小鼠的銀屑病癥狀有改善作用［7-11］；同時，銀屑病模型小鼠伴有行為學變化，如自發活動能力降低，產生焦慮樣行為，認知能力受損等［12］。基于此，本研究中探討了土大黃對銀屑病模型小鼠焦慮樣行為學的影響。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

儀器：EL - 5.2K 型電子天平（常州市天之平儀器設備有限公司，精度為0.5 g）；BS110S 型電子天平（北京賽多利斯天平有限公司，精度為0.1 mg）；YLS-37B（3TB）型全自動大小鼠跳臺記錄儀（濟南益延科技發展有限公司）；LDZM-80KCS-Ⅱ型立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫療器械廠）；KQ-3200DV型數碼超聲波清洗機（北京市永光明醫療儀器有限公司）；DNP-9272型恒溫箱、DHG 型恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）；JK-6 型烤片機、JB-L5 型包埋機、JT-12 型脫水機（武漢俊杰電子有限公司）；Histocore BIOCUT 型切片機、APERIO VERSA 8 型掃描儀（德國Leica 公司）；Nikon E200型生物顯微鏡（日本Nikon公司）。

試藥：甲氨蝶呤片（上海信宜藥廠有限公司，批號為036201001）；阿瑞匹坦膠囊（齊魯制藥有限公司，批號為1A0012E54）；咪喹莫特乳膏（四川明飲藥業有限責任公司，批號為39201201）；4%多聚甲醛通用性組織固定液（北京蘭杰柯科技有限公司，批號為LOT71041800）；二甲苯、無水乙醇（天津市富宇精細化工有限公司，批號分別為10023418，10092680）；蘇木素（H）染液（福州邁新生物技術開發有限公司，批號為CTS-1097）；伊紅（E）染液、中性樹膠（北京中杉金橋生物技術有限公司，批號分別為ZLI-9613，ZLI-9555）。土大黃根（天津市富宇精細化工有限公司，批號為180501），經中國科學院新疆理化技術研究所魯春芳副研究員鑒定為正品。

動物：SPF 級Balb/c 小鼠，6～7 周齡，雌性，體質量18～22 g，購于新疆醫科大學動物實驗中心，實驗動物生產許可證號SCXK（新）2018-0003。實驗在新疆維吾爾自治區維吾爾醫藥研究所藥物安全性評價中心SPF級動物房進行，實驗動物使用許可證號SYXK（新）2021-0004。本研究經新疆維吾爾自治區維吾爾醫藥研究所倫理委員會批準（批件號nGLP - 2021 - 006），實驗設計及實施過程嚴格遵循3R 原則。SPF 大小鼠生長繁殖飼料（批號為21013113）、SPF 壓縮墊料（批號為20129623）均購于北京科澳協力飼料有限公司。

1.2 方法

1.2.1 建模、分組與給藥

取小鼠90 只，以夾尾尖（3 min，距尾根1 cm）、搖晃、晝夜照明刺激、24 h禁食、24 h禁飲、混籠（兩籠混為一籠引起擁擠、兩籠各抓2只混籠）、60 V 電壓電擊足底（2 次，每次5 s，間隔10 s）刺激小鼠，每天定時給予1 種刺激，每種刺激累計最多3 次且非連續出現，持續刺激10 d，以復制焦慮小鼠模型；成功后，于焦慮模型小鼠背部脫毛（2 cm×2 cm），涂以5%咪喹莫特乳膏（60 mg/d），每天1 次，連續6 d，以復制焦慮復合銀屑病模型小鼠［12-15］。將90 只模型小鼠分為模型組（等體積生理鹽水）、甲氨蝶呤組（1.3 mg/kg）、阿瑞匹坦組（5 mg/kg）及土大黃低、中、高劑量組（1，2，4 g/kg），各15 只。各組小鼠灌胃相應藥物或生理鹽水（每10 g體質量0.2 mL），每天1 次，連續15 d；給藥期間，隔日涂抹咪喹莫特乳膏及混合刺激1 次，以保持模型穩定性。另取15 只小鼠作為正常對照組，無刺激，背部脫毛區涂抹凡士林，灌胃等體積生理鹽水。

1.2.2 體質量及臟器系數測定與計算

稱定小鼠給藥前及給藥6，11，16 d 時的體質量。末次給藥2 h 后，取小鼠腦、心臟、肝臟、腎上腺、脾臟、胸腺，稱定質量，并計算各臟器系數。

1.2.3 行為學指標考察

曠場實驗［6，16-23］：給藥第14 天及第15 天，將小鼠置中央區中心點，記錄其5 min 內在測試箱內（中央區和邊緣區）的運動距離、停留時間、潛伏期，以及中央區進入次數，并計算各區域平均速率、中央區和邊緣區運動距離及停留時間的比值。

Y 型迷宮實驗［19-21，23-24］：1）訓練。用隔板擋住新異臂，于起始臂放入小鼠，使其在起始臂和其他臂中自由活動10 min。2）檢測。訓練結束4 h 后抽開新異臂隔板，于起始臂放入小鼠，使其在3個臂中自由活動5 min。記錄小鼠在各個臂的停留時間和穿梭次數。統計并分析小鼠在Y 型迷宮中3 個臂的停留時間及進出次數的百分比。

1.2.4 病理學觀察

末次給藥2 h 后，取小鼠背部皮膚組織標本，多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，HE 染色。顯微鏡下觀察小鼠背部皮膚組織病理學變化，包括表皮（角質層、顆粒層、棘層、基底層），真皮（乳頭層、網狀層），皮下組織、皮膚附屬器及皮膚的血管、淋巴管、神經等。按Baker 評分標準（見表1）對各皮膚組織進行評分，并進行統計與分析［25-26］。

表1 銀屑病皮膚病理評分（Baker評分）標準Tab.1 Criteria of skin pathology score of psoriasis（Baker score）

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 體質量

與正常對照組比較，模型組小鼠建模初期出現短暫的活動興奮，且給藥第6 天時小鼠體質量顯著減小（P＜0.05）。與模型組比較，各給藥組小鼠出現短暫的活動減少，且甲氨蝶呤組和阿瑞匹坦組小鼠體質量顯著減小（P＜0.05），隨著實驗周期的延長，其影響逐漸縮小，實驗期間未見明顯毒性反應。詳見表2。

表2 各組小鼠體質量比較（，g，n=10）Tab.2 Comparison of body mass in each group（，g，n = 10）

表2 各組小鼠體質量比較（，g，n=10）Tab.2 Comparison of body mass in each group（，g，n = 10）

注：與正常對照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與模型組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01。下表同。Note：Compared with those in the normal control group，*P ＜0.05，**P ＜0.01.Compared with those in the model group，#P ＜0.05，##P ＜0.01（for Tab.2 - 6）.

給藥第16天21.10±1.63 20.10±1.67 19.51±1.86 18.49±1.18#19.76±1.47 19.51±1.98 19.41±1.18組別正常對照組模型組甲氨蝶呤組阿瑞匹坦組土大黃低劑量組土大黃中劑量組土大黃高劑量組劑量（g/kg）0.001 3 0.005 1 2 4給藥前19.53±1.91 19.42±2.35 19.62±1.92 19.17±1.32 20.62±1.09 19.59±1.85 20.28±1.68給藥第6天20.51±2.08 18.16±1.87**16.64±1.69#15.58±1.25##17.86±0.99 17.11±1.53 18.04±1.40給藥第11天20.77±1.85 19.57±1.86 16.97±2.39##17.38±1.36##18.86±0.89 18.25±1.63 19.24±1.32

2.2 臟器系數

與正常對照組比較，模型組小鼠腎臟系數及脾臟系數均顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，阿瑞匹坦組、土大黃高劑量組小鼠肝臟系數及土大黃中劑量組小鼠腎臟系數均顯著降低（P＜0.05）。詳見表3。

表3 各組小鼠臟器系數比較（，mg/g，n=10）Tab.3 Comparison of organ coefficients in each group（，mg / g，n = 10）

表3 各組小鼠臟器系數比較（，mg/g，n=10）Tab.3 Comparison of organ coefficients in each group（，mg / g，n = 10）

組別正常對照組模型組甲氨蝶呤組阿瑞匹坦組土大黃低劑量組土大黃中劑量組土大黃高劑量組劑量（g/kg）0.001 3 0.005 1 2 3腦系數0.021 6±0.001 4 0.021 2±0.001 9 0.021 8±0.002 2 0.023 1±0.001 6#0.022 1±0.001 3 0.021 4±0.002 2 0.022 7±0.001 4心臟系數0.006 3±0.000 6 0.006 6±0.000 7 0.007 0±0.000 6 0.006 6±0.001 1 0.006 7±0.000 7 0.006 3±0.000 8 0.006 7±0.000 9肝臟系數0.050 7±0.003 2 0.052 5±0.002 7 0.055 6±0.005 2 0.053 9±0.004 1 0.053 8±0.002 8 0.049 3±0.004 4 0.045 6±0.014 0#腎臟系數0.012 7±0.000 7 0.013 6±0.000 6*0.014 4±0.001 1 0.013 5±0.000 9 0.012 9±0.001 0 0.012 6±0.001 1#0.013 9±0.000 9腎上腺系數0.001 0±0.001 6 0.000 6±0.000 2 0.000 6±0.000 1 0.000 6±0.000 1 0.000 6±0.000 1 0.000 6±0.000 1 0.000 5±0.000 1脾臟系數0.003 3±0.000 4 0.009 5±0.002 7**0.010 9±0.004 5 0.007 3±0.001 2 0.007 3±0.001 0 0.006 3±0.001 0 0.006 2±0.001 1胸腺系數0.001 6±0.000 3 0.001 5±0.000 4 0.002 6±0.003 7 0.002 1±0.001 3 0.001 8±0.000 3 0.001 4±0.000 3 0.001 7±0.000 6

2.3 行為學

曠場實驗：與正常對照組比較，模型組小鼠各數值均有顯著變化（P＜0.05）。與模型組比較，土大黃各劑量組小鼠的中央區運動距離均顯著延長、中央區/邊緣區平均速率均顯著提升、進入中央區次數均顯著增加、潛伏期均顯著延長（P＜0.05）。結果見表4。

表4 各組小鼠曠場實驗結果比較（，n=10）Tab.4 Results of open field test in each group（，n = 10）

表4 各組小鼠曠場實驗結果比較（，n=10）Tab.4 Results of open field test in each group（，n = 10）

總區域中央區組別劑量（g/kg）正常對照組模型組甲氨蝶呤組阿瑞匹坦組土大黃低劑量組土大黃中劑量組土大黃高劑量組0.001 3 0.005 1 2 3總運動距離（mm）11 954.73±8 507.33 8 545.78±3 521.28**9 426.97±2 653.54 15 470.40±8 910.08 10 575.89±2 566.91 9 519.89±2 166.61 10 323.07±3 737.49平均速率（mm/s）51.95±30.18 38.54±40.67**32.06±8.60 53.60±29.39 37.48±7.14 34.86±5.74 36.45±11.63停留時間（s）25.81±20.82 47.13±31.68**48.03±32.53 30.45±22.70 26.92±19.10 36.96±16.73 39.36±17.97運動距離（mm）16.19±14.67 7.29±7.06**17.41±7.78##16.03±12.41##16.16±8.80##16.39±8.65##17.24±8.98##平均速率（mm/s）20.87±19.28 8.35±8.18**19.30±9.27##18.00±9.27##19.53±9.93##20.59±9.38##19.00±6.64##停留時間（s）122.86±134.57 64.18±76.74**69.11±12.58 90.05±35.29 70.03±20.93 84.03±25.65 77.91±15.40進入次數52.00±82.37 133.66±136.26**23.40±19.56##23.03±19.83##27.68±34.28##13.43±17.84##10.45±11.78##潛伏期（s）0.38±0.56 0.18±0.42**0.53±0.39##0.26±0.37##0.43±0.56##0.50±0.56##0.59±0.56##邊緣區中央區/邊緣區組別劑量（g/kg）正常對照組模型組甲氨蝶呤組阿瑞匹坦組土大黃低劑量組土大黃中劑量組土大黃高劑量組0.001 3 0.005 1 2 3運動距離（mm）209.63±73.94 250.42±58.48*257.34±7.53 252.64±17.94 247.24±20.40 239.13±30.54 247.29±14.42平均速率（mm/s）57.40±27.12 39.76±23.85*67.50±18.80##74.81±20.21##71.88±25.23##67.87±21.54##62.56±19.89##停留時間（s）130.48±28.13 127.12±36.52 111.47±6.98 136.22±31.90 118.77±7.52 112.28±7.29 114.50±11.53潛伏期（s）17.13±15.38 33.62±22.82*33.88±23.07 21.63±16.29 18.62±13.28 25.54±12.42 27.27±12.64停留時間0.930±1.069 0.453±0.395**0.618±0.090 0.667±0.204 0.591±0.177 0.756±0.268 0.682±0.122運動距離0.080±0.062 0.031±0.029**0.068±0.032 0.065±0.055 0.065±0.037 0.068±0.035 0.070±0.037

迷宮實驗：與正常對照組比較，模型組小鼠新異臂、起始臂停留時間百分比顯著降低，其他臂停留時間百分比顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，甲氨蝶呤組、阿瑞匹坦組及土大黃中、高劑量組小鼠新異臂、起始臂停留時間百分比均顯著升高，其他臂停留時間百分比均顯著降低（P＜0.05）。詳見表5。

表5 各組小鼠迷宮實驗結果比較（，%，n=10）Tab.5 Results of maze test in each group（，%，n = 10）

表5 各組小鼠迷宮實驗結果比較（，%，n=10）Tab.5 Results of maze test in each group（，%，n = 10）

組別正常對照組模型組甲氨蝶呤組阿瑞匹坦組土大黃低劑量組土大黃中劑量組土大黃高劑量組劑量（g/kg）停留時間百分比進入次數百分比起始臂14.58±8.82 5.24±4.24**25.74±8.31##31.00±9.72##9.34±5.80#18.69±9.35##21.58±6.17##其他臂68.29±16.91 86.14±9.41**48.26±9.92##47.21±14.68##71.32±11.17##49.79±15.87##38.87±12.89##1 2 3 0.001 3 0.005新異臂17.12±10.98 8.61±6.23**25.99±8.90##21.79±7.98##19.34±8.30#31.52±10.51##39.55±11.04##新異臂32.62±11.81 28.50±5.11 30.57±5.34 34.36±6.04#32.26±4.26 37.29±4.69##38.11±4.26##起始臂29.50±6.74 25.87±15.05 32.91±51.19 31.30±5.62 31.26±6.00 29.65±5.01 30.41±6.21其他臂41.99±5.88 41.51±12.37 36.52±4.23 34.34±6.42 36.48±6.15 33.06±5.98 31.47±6.39

2.4 組織病理學

病理形態學：正常對照組小鼠背部皮膚表皮層較薄，層次清晰，未見明顯異常；真皮內無炎性細胞浸潤，皮脂腺、毛囊結構清晰。與正常對照組比較，模型組小鼠背部皮膚表皮層明顯增厚，伴角化不全及角化過度，棘層肥厚，角質層內可見Munro 小膿腫，部分區域表皮突延長，真皮乳頭上移伴毛細血管增生及擴張，皮下組織內較多淋巴細胞浸潤。與模型組比較，各給藥組小鼠背部皮膚棘層增厚、角化不全及角化過度程度均減輕，未見明顯表皮突延長及真皮乳頭上移，皮下炎性細胞浸潤減少。詳見圖1。

圖1 小鼠背部皮膚組織病理學A1 - A7.（HE，× 100） B1 - B7.（HE，× 200）A1，B1.Normal control group A2，B2.Model group A3，B3.Methotrexate group A4，B4.Aprepitant group A5，B5.Rumicis Obtusifolii Radix low - dose group A6，B6.Rumicis Obtusifolii Radix medium - dose group A7，B7.Rumicis Obtusifolii Radix high - dose groupFig.1 Pathology of skin tissue on the back of mice

Baker評分：與正常對照組比較，模型組小鼠皮膚角質層、表皮層、真皮層各層評分及其總評分均顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，土大黃各劑量組小鼠真皮層評分及總評分均顯著降低，土大黃中、高劑量組小鼠表皮層評分均顯著降低，土大黃低、高劑量組小鼠角質層評分均顯著降低（P＜0.05）；甲氨蝶呤組小鼠真皮層及總評分均顯著降低（P＜0.05），阿瑞匹坦組小鼠角質層、真皮層及總評分均顯著降低（P＜0.01）。詳見表6。

表6 各組小鼠皮膚組織評分比較（，n=10）Tab.6 Comparison of skin tissue scores in each group（，n = 10）

表6 各組小鼠皮膚組織評分比較（，n=10）Tab.6 Comparison of skin tissue scores in each group（，n = 10）

組別正常對照組模型組甲氨蝶呤組阿瑞匹坦組土大黃低劑量組土大黃中劑量組土大黃高劑量組劑量（g/kg）0.001 3 0.005 1 2 3角質層0.00±0.00 2.10±0.97**1.06±0.53 0.40±0.66##0.50±0.41##1.10±0.99 0.27±0.47##表皮層0.15±0.47 2.20±0.95**1.17±0.56 1.05±1.12 1.00±0.47 0.75±0.54#0.91±0.49#真皮層0.10±0.32 1.55±0.64**0.39±0.42##0.30±0.35##0.30±0.35##0.30±0.35##0.14±0.32##Baker評分0.25±0.79 5.85±1.99**2.61±1.27#1.75±1.65##1.80±0.82##2.15±1.60##1.32±1.12##

3 討論

銀屑病的發展、轉歸及預后與個體心理健康狀態密切相關。銀屑病會誘發焦慮抑郁情緒，后者又會加重前者病情，形成惡性循環，及時消除焦慮抑郁情緒能有效提高臨床療效和改善預后。

一般狀況及臟器系數測定結果表明，給予慢性刺激、涂抹咪喹莫特可影響小鼠的活動及食欲，從而影響體質量，但隨著時間的推移，小鼠適應了外部和內部刺激，體質量逐漸恢復正常；但甲氨蝶呤、阿瑞匹坦對小鼠的體質量影響相對更大，其原因可能是體內產生蓄積或排泄緩慢等。同時，小鼠臟器系數均受到一定影響，其中腎臟、脾臟系數波動較大，同文獻［13，15，27-28］的報道一致。2 g/ kg 劑量下土大黃可降低小鼠腎臟系數，各藥物（除甲氨蝶呤外）均有降低脾臟系數的作用。

行為學實驗結果表明，模型組小鼠各區域總運動距離、平均速率降低，停留時間增加；中央區與邊緣區停留時間和運動距離各自比值均有所降低。提示模型小鼠自發活動能力降低并出現焦慮樣表現，如主要在邊緣區域活動，而在中央區活動減少，這與文獻［6，13-15，20-22］的報道相似；經藥物干預后，上述指標均有好轉。模型組新異臂、起始臂停留時間百分比降低，其他臂停留時間百分比升高；新異臂、起始臂進入次數百分比呈下降趨勢，與文獻［20-21］的報道相似。提示銀屑病可能損傷小鼠的認知能力。而經藥物干預后，上述指標均有好轉。

組織病理學實驗結果表明，各給藥組小鼠的背部皮膚棘層增厚、角化不全及角化過度程度均有減輕，未見明顯表皮突延長及真皮乳頭上移，且皮下炎性細胞浸潤減少。

綜上所述，土大黃不僅能緩解銀屑病樣模型小鼠皮膚角質層、表皮層、真皮層損傷，同時能改善其焦慮、認知能力受損狀態。同時也提示臨床醫師，在銀屑病藥物干預中，須考慮情志因素、自然環境因素等，從而縮短治療周期，提高療效。