瓜蔞皮注射液治療穩(wěn)定型心絞痛作用機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究*

魏 龍，李文潔，洪國君，陶 洋，吳連平

（江蘇大學(xué)附屬高淳醫(yī)院，江蘇 南京 211300）

心腦血管疾病嚴(yán)重危害人類健康，患者數(shù)達(dá)3.3億，其中冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（簡稱冠心病）患者數(shù)為1 139萬例［1］。冠心病屬中醫(yī)“胸痹”范疇，主要證型包括氣滯血瘀、痰阻熱蘊(yùn)、痰瘀互阻、氣虛血瘀、氣陰兩虛等［2］。穩(wěn)定型心絞痛（SAP）為冠心病的常見類型，治療原則為改善冠狀動脈的血液供應(yīng)，降低心肌耗氧量，預(yù)防冠狀動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展，提高患者的生活質(zhì)量，并延長其生存期［3］。SAP的基本病機(jī)為“陽微陰弦”，屬本虛標(biāo)實(shí)之證，發(fā)生與飲食不節(jié)、寒邪內(nèi)侵、勞倦內(nèi)傷等因素有關(guān)［4］。目前，臨床多以經(jīng)皮冠狀動脈介入術(shù)治療冠心病，術(shù)后以阿司匹林聯(lián)合氯吡格雷或替格瑞洛等治療［5］。但部分患者在藥物治療過程中會出現(xiàn)出血等并發(fā)癥［6］，故需探尋更安全有效的治療藥物。瓜蔞皮為葫蘆科植物栝樓Trichosanthes kirilowiiMaxim.或雙邊栝樓Trichosanthes rosthorniiHarms.的干燥成熟果皮，具有清熱化痰、利氣寬胸功效，用于治療痰熱咳嗽、胸悶脅痛［7］。瓜蔞皮注射液有行氣除滿、開胸除痹等功效，治療冠心病的療效顯著、安全性良好［8］。有研究表明，瓜蔞皮水提物可通過相關(guān)信號通路保護(hù)缺血缺氧的大鼠心肌細(xì)胞［9］，但其成分作用于相關(guān)疾病靶點(diǎn)和通路的機(jī)制還有待進(jìn)一步揭示。HOPKINS 在2007 年首次提出網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的理念［10］，契合了中醫(yī)藥的整體理論。我國學(xué)者也先后向中醫(yī)藥領(lǐng)域進(jìn)行探索，為中醫(yī)藥理論發(fā)展奠定了基礎(chǔ)［11］。本研究中通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)預(yù)測瓜蔞皮注射液治療SAP的活性成分和潛在作用靶點(diǎn)，探究其對SAP的作用機(jī)制?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 制劑活性成分與靶點(diǎn)收集

通過檢索中國知網(wǎng)自建庫起至2023年2月的相關(guān)重點(diǎn)文獻(xiàn)［12-14］獲取制劑的活性成分，并將其在PubChem數(shù)據(jù)庫（https：// pubchem. ncbi. nlm. nih. gov/）中通過SMILES 號統(tǒng)一名稱。使用SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫（http：//old.swisstargetprediction.ch/）對活性成分進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測，剔除無法獲得SMILES 號且無法預(yù)測靶點(diǎn)的活性成分，預(yù)測出的智人靶點(diǎn)評分需大于0。

1.2 SAP 疾病靶點(diǎn)與共有靶點(diǎn)

使用GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https：// www. genecards.org/），以“stable angina pectoris”為檢索關(guān)鍵詞收集相關(guān)性得分大于8 分的疾病靶點(diǎn)。以Venny 2.1 平臺（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）分析制劑活性成分靶點(diǎn)與SAP 疾病靶點(diǎn)，挑選出制劑中作用于SAP的靶點(diǎn)作為共有靶點(diǎn)［15］。

1.3 富集分析與成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將活性成分的靶點(diǎn)和SAP疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入MetaScape（https：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1）在線軟件進(jìn)行基因本體論（GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，結(jié)果以柱狀圖展示。將制劑中成分、靶點(diǎn)和和涉及的通路進(jìn)行一一映射，采用Cytoscape 3.9.1 軟件對映射結(jié)果進(jìn)行拓?fù)溆嬎悖瑯?gòu)建成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)。

1.4 蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與數(shù)據(jù)驗(yàn)證

將共有靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫（https：//www.stringdb.org/）。利用Cytoscape 3.9.1 軟件構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)并分析。通過基因表達(dá)綜合（GEO）數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）選定GSE19339微陣列數(shù)據(jù)集作為研究對象（該數(shù)據(jù)集包含8 個樣本，本研究中通過采集急性冠狀動脈綜合征患者冠狀動脈閉塞處血栓并通過GPL570 平臺進(jìn)行分析）。通過GEO 數(shù)據(jù)庫中的基因芯片，以“coronary heart disease”為檢索詞檢索數(shù)據(jù)，利用R 4.2.2 軟件進(jìn)行差異分析，并繪制火山圖，從而檢驗(yàn)制劑治療SAP 的靶點(diǎn)是否存在于冠心病的差異基因中。差異基因通過R軟件的limma包分析，設(shè)定|log2FC|＞1且adj.P＜0.05（FC為差異倍數(shù)）。

1.5 分子對接驗(yàn)證

通過PPI 網(wǎng)絡(luò)選擇度值較高的靶點(diǎn)作為分子對接的受體，通過成分- 靶點(diǎn)- 通路網(wǎng)絡(luò)分析出分子對接的配體，從而通過預(yù)測活性小分子之間的結(jié)合能來預(yù)測其親和力（親和力越低，結(jié)合越穩(wěn)定）。通過RCSB PDB 數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org/）下載關(guān)鍵靶點(diǎn)結(jié)構(gòu)，采用PyMOL 2.3.0 軟件處理靶點(diǎn)。將處理后的關(guān)鍵靶點(diǎn)文件錄入AutoDockTools 1.5.6 軟件進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，利用AutoDock Vina 軟件進(jìn)行分子對接，得到的最佳構(gòu)象采用PyMOL 2.3.0 軟件進(jìn)行可視化分析。

2 結(jié)果

2.1 制劑活性成分與靶點(diǎn)

共獲得57種活性成分，包括氨基酸類、黃酮類、多肽類、核苷類、唾液酸類、生物堿類、葡萄糖。預(yù)測出517個靶點(diǎn)。

2.2 SAP 疾病靶點(diǎn)與共有靶點(diǎn)

共獲得SAP 疾病靶點(diǎn)139個，分析后得到制劑作用于SAP的靶點(diǎn)26個，包括NOS2，NOS3，EGFR，MMP-9，ICAM1，ITGB3，ACE，REN，F(xiàn)2，ITGA2B，JAK2，MPO，MAPK1，MMP3，TERT，SERPINE1，CETP，TTR，TNF，IL-2，APP，PIK3CA，ALDH2，SELP，SELE，F(xiàn)GF2。

2.3 富集分析與成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)

共富集到GO 功能條目37 個，包括生物過程（BP）20 個，分子功能（MF）9 個，細(xì)胞組成（CC）8 個，以及KEGG通路9條，詳見圖1、圖2。

圖1 GO功能富集分析柱狀圖Fig.1 Histogram of GO functional enrichment analysis

圖2 KEGG通路富集分析柱狀圖Fig.2 Histogram of KEGG pathway enrichment analysis

成分- 靶點(diǎn)- 通路網(wǎng)絡(luò)包含66 個節(jié)點(diǎn)和153 條邊，詳見圖3，其中黃色表示活性成分，紅色表示作用靶點(diǎn)，藍(lán)色表示KEGG 通路?；钚猿煞置Q及具體KEGG通路見表1。

表1 活性成分與KEGG通路名稱Tab.1 Names of active ingredients and KEGG pathways

圖3 成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Network of ingredients - targets - pathways

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與數(shù)據(jù)驗(yàn)證

PPI 網(wǎng)絡(luò)見圖4，其中度值最高的5 個節(jié)點(diǎn)分別是TNF，F(xiàn)GF2，MMP-9，ICAM1，EGFR。PPI網(wǎng)絡(luò)具有25個節(jié)點(diǎn)和164 條邊，其中ALDH2 與其他靶點(diǎn)無關(guān)聯(lián)，屬游離靶點(diǎn)，故隱藏。PPI 網(wǎng)絡(luò)說明制劑中活性成分與SAP疾病靶點(diǎn)相互作用，共同發(fā)揮治療作用。冠心病差異表達(dá)基因火山圖見圖5。共篩選出384個差異基因，其中紅色表示P值和log2FC均符合要求，屬差異表達(dá)基因，藍(lán)色表示P值符合要求，綠色表示log2FC符合要求，灰色表示無顯著差異的靶點(diǎn)。從TNF，F(xiàn)GF2，MMP - 9，ICAM1，EGFR 這5 個靶點(diǎn)中，顯示出制劑治療SAP 的靶點(diǎn)也部分存在于冠心病的差異基因中。

圖4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.4 PPI network

圖5 差異表達(dá)基因火山圖Fig.5 Volcano plot of the differentially expressed genes

2.5 分子對接

以TNF和EGFR作為分子對接的受體；TNF和EGFR主要與分子MOL052（木犀草苷）、MOL053（芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷）、MOL054（香葉木素-7-O-β-葡萄糖苷）發(fā)生相互作用，選做本次分子對接的配體。通過RCSB PDB 數(shù)據(jù)庫選定TNF（PDB ID：7KPA）和EGFR（PDB ID：6JOL）作為受體，其固有配體為D84 和STI（見表2）。3 種配體與TNF 和EGFR 均有較好的結(jié)合能，說明3 種黃酮類化合物均能較好地結(jié)合在受體TNF和EGFR 上，發(fā)揮治療作用?；钚猿煞峙cEGFR/TNF 的結(jié)合模式見圖6，活性成分均可落入受體的口袋中，MOL052 與EGFR 的836 位天門冬氨酸殘基形成氫鍵（見圖6 A）；MOL053 與EGFR 的658 位纈氨酸殘基和836位天門冬氨酸殘基形成氫鍵（見圖6 B）；MOL054與EGFR 的836 位天門冬氨酸殘基形成氫鍵（見圖6 C）；MOL052 與TNF 的A 鏈60 位絲氨酸殘基、B 鏈121 位甘氨酸殘基、120位亮氨酸殘基及C 鏈60位絲氨酸殘基和151 位酪氨酸殘基形成氫鍵（見圖6 D）；MOL053 與TNF的A鏈60位絲氨酸殘基及B鏈119位酪氨酸殘基、121位甘氨酸殘基形成氫鍵（見圖6 E）；MOL054 與TNF 的A鏈60 位絲氨酸殘基、120 位亮氨酸殘基、151 位酪氨酸殘基和B 鏈121 位甘氨酸殘基及C 鏈60 位絲氨酸殘基形成氫鍵（見圖6 F）。

表2 活性成分與受體間的結(jié)合能（kcal/mol）Tab.2 Binding energies between the active ingredients and the receptors（kcal / mol）

圖6 活性成分與EGFR/TNF結(jié)合模式圖A.MOL052 - EGFR B.MOL053 - EGFR C.MOL054 - EGFR D.MOL052 - TNF E.MOL053 - TNF F.MOL054 - TNFFig.6 Binding patterns of active ingredients and EGFR / TNF

3 討論

SAP屬中醫(yī)學(xué)“胸痹”“心痛”范疇，其主要證候要素組合可分為痰瘀互結(jié)、氣虛血瘀、氣滯血瘀等，其中痰瘀互結(jié)證在心血管疾病研究中具有重要意義［16］。SAP病機(jī)為氣虛，由于氣的推動作用不足，水液運(yùn)行不暢，產(chǎn)生痰濁，進(jìn)而血液阻滯，而瓜蔞皮注射液有行氣除滿、開胸除痹之功效，可用于治療痰濁阻絡(luò)型冠心病。臨床研究表明，該制劑與瑞舒伐他汀聯(lián)合治療心肌梗死，可降低心血管不良事件發(fā)生率，改善心臟和內(nèi)皮舒張功能［17］。同時，瓜蔞皮提取物對受損的心肌細(xì)胞可產(chǎn)生顯著的保護(hù)作用［18］，還可通過激活PI3K/Akt通路從而增加NO 含量，產(chǎn)生抗凋亡作用，進(jìn)而保護(hù)受損的心肌細(xì)胞［19］。

本研究結(jié)果表明，氨基酸類、多肽類、核苷類、生物堿類、黃酮類、唾液酸類等為瓜蔞皮注射液的主要活性成分。黃酮類活性成分主要為木犀草素、蘆丁、芹菜素、香葉木素等。木犀草素可通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而降低血管緊張素Ⅱ?qū)π募〖?xì)胞的肥大作用，其機(jī)制可能為通過激活Nrf2/Gpx4 通路，從而抑制鐵死亡［20］。木犀草素可激活SIRT1抑制炎性反應(yīng)，進(jìn)而減少膿毒性心臟損傷［21］。蘆丁為天然黃酮類活性成分，具有抗心肌損傷、抗氧化能力、抗炎反應(yīng)、抗菌等作用［22］；可通過激活SIRT1蛋白減輕心肌細(xì)胞的損傷，也可通過調(diào)控RAP1/ERK 信號通路來治療抗腫瘤藥物所致心肌損傷［23-24］。芹菜素可抑制血管內(nèi)皮炎癥，改善血管內(nèi)皮功能，對心肌細(xì)胞有一定保護(hù)作用，其可能的機(jī)制為抑制核因子（NF）- κB 活化，進(jìn)而影響下游細(xì)胞間黏附分子1（ICAM1）mRNA 的表達(dá)，發(fā)揮抗炎作用［25］。此外，芹菜素還可通過激活PI3K/Akt 通路抑制線粒體凋亡，從而減輕心肌缺血再灌注的損傷［26］。香葉木素可產(chǎn)生抗炎、抗氧化、抗凋亡等作用，通過加強(qiáng)射血功能、心室重構(gòu)等達(dá)到對心肌缺血模型大鼠心臟的保護(hù)作用［27］。通過對比香葉木素和香葉木素-7-O-β-葡萄糖苷發(fā)現(xiàn)，香葉木素-7-O-β-葡萄糖苷更有可能成為一種保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的藥物，其可通過抑制細(xì)胞凋亡、自噬和下調(diào)ROS 水平來保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞［28］。SAP 引發(fā)心肌細(xì)胞缺血、缺氧，而瓜蔞皮注射液含有的主要黃酮類成分可通過影響氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等途徑改善心肌缺血再灌注損傷。

瓜蔞皮注射液主要通過26個靶點(diǎn)作用于SAP 發(fā)揮治療作用。由基因富集的生物過程可見，主要富集于脂質(zhì)與動脈粥樣硬化通路、COVID-19 通路、癌癥信號通路、恰加斯病通路、PI3K-Akt信號通路、糖尿病性心肌病通路、肥厚性心肌病通路、IL - 17 信號通路、精氨酸和脯氨酸代謝通路等9條KEGG通路。BP功能主要包括對細(xì)胞遷移的正向調(diào)控、對脂多糖的反應(yīng)、蛋白質(zhì)磷酸化的正向調(diào)控、平滑肌細(xì)胞增殖的調(diào)控、炎性反應(yīng)的調(diào)控、血管的發(fā)育及外源性凋亡細(xì)胞信號通路的負(fù)向調(diào)控等。PI3K-Akt信號通路參與多種細(xì)胞過程，可通過抑制炎性因子白細(xì)胞介素6和腫瘤壞死因子-α 的表達(dá)進(jìn)而發(fā)揮心臟保護(hù)作用；還可通過作用于下游靶點(diǎn)Bad，發(fā)揮抗凋亡作用而發(fā)揮保護(hù)作用［29］。PI3K-Akt信號通路也可調(diào)控下游NF-κB信號通路，其可調(diào)控血管內(nèi)皮生成、促進(jìn)缺血再灌注心肌細(xì)胞的修復(fù)而發(fā)揮重要作用［30］。NOS3 作為一氧化氮合酶之一，在血管生成中可誘導(dǎo)釋放內(nèi)皮型一氧化氮，從而促進(jìn)血管生成和血小板聚集等，當(dāng)表達(dá)受限時會造成血管內(nèi)皮功能紊亂，進(jìn)而導(dǎo)致SAP等疾病的發(fā)生、發(fā)展［31］。

PPI 網(wǎng)絡(luò)顯示了關(guān)鍵作用靶點(diǎn)相互作用，共同調(diào)控發(fā)揮治療SAP 作用，其度值最高的5 個節(jié)點(diǎn)分別是TNF，F(xiàn)GF2，MMP - 9，ICAM1，EGFR。通過對冠心病差異表達(dá)基因的分析，僅ICAM1 為差異表達(dá)基因，但數(shù)據(jù)集GSE19339 主要研究對象為急性冠狀動脈綜合征患者，存在一定差異。同樣說明瓜蔞皮注射液作用靶點(diǎn)可特異性地作用于SAP差異表達(dá)基因。EGFR為酪氨酸激酶受體家族成員之一，可通過調(diào)控MAPK信號通路、PI3K/Akt 信號通路和JAK/STAT 信號通路參與細(xì)胞增殖、分化和轉(zhuǎn)移［32］。MMP-9 為鋅依賴基質(zhì)金屬蛋白酶，可導(dǎo)致心肌細(xì)胞的過度增殖引發(fā)纖維化，引起心肌細(xì)胞的受損和重構(gòu)［33］。FGF2 為成纖維細(xì)胞生長因子多肽家族成員，調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、分化和凋亡，在炎性反應(yīng)中起到重要作用［34］。ICAM1作為經(jīng)典的細(xì)胞黏附分子，是白細(xì)胞黏附蛋白LFA-1 的配體，對細(xì)胞間炎性反應(yīng)及血管內(nèi)皮細(xì)胞活化起重要作用，從而對心肌細(xì)胞產(chǎn)生炎性反應(yīng)，進(jìn)而產(chǎn)生纖維化和血栓［35-36］。制劑作用靶點(diǎn)說明其可通過PI3K/Akt信號通路進(jìn)而抑制心肌細(xì)胞凋亡，作用于MMP-9，ICAM1，EGFR防止心肌細(xì)胞纖維化和過度增殖，進(jìn)而逆轉(zhuǎn)心肌細(xì)胞的受損和重構(gòu)。

分子對接結(jié)果表明，瓜蔞皮注射液中黃酮類活性成分木犀草苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷和香葉木素- 7 -O-β- 葡萄糖苷可和受體TNF 與EGFR 間相互作用，其親和力均低于- 6 kcal/mol，但與原始配體相比親和力仍有一定差距，可通過結(jié)構(gòu)修飾開發(fā)出更好的活性成分，為治療SAP 提供更多選擇。目前，多款TNF 抑制劑如阿達(dá)木單抗已投入臨床使用，其主要抑制細(xì)胞因子TNF，從而導(dǎo)致促細(xì)胞生長和程序性細(xì)胞死亡，用于治療免疫系統(tǒng)疾?。?7］。目前已開發(fā)出多種小分子酪氨酸激酶抑制劑用于靶向EGFR，EGFR - 酪氨酸激酶抑制劑的不斷研發(fā)將對肺癌患者的預(yù)后和生存期的改善產(chǎn)生影響［38］。

綜上所述，本研究中發(fā)現(xiàn)瓜蔞皮注射液含有多種活性成分，其中所含黃酮類化合物為主要活性成分。其可能特異性作用于NOS3，EGFR，MMP - 9 等靶點(diǎn)進(jìn)而影響脂質(zhì)與動脈粥樣硬化通路、PI3K-Akt信號通路和精氨酸和脯氨酸代謝通路等通路，通過Akt 和SIRT1 表達(dá)，誘導(dǎo)NO 釋放產(chǎn)生抗氧化應(yīng)激、抗凋亡、松弛血管平滑肌等作用，改善冠狀動脈的血液供應(yīng)和降低心肌耗氧量，進(jìn)而治療SAP。但本研究尚處于模擬預(yù)測其作用機(jī)制階段，為預(yù)防與治療SAP 及新藥研發(fā)提供了參考，仍有待進(jìn)一步驗(yàn)證。