千里光藥材功效關聯物質預測研究*

蔣學青，陳彥潔，羅 鑫，謝譚芳，王志萍△

（1. 廣西中醫藥大學藥學院，廣西 南寧 530200； 2. 廣西高校中藥制劑共性技術研發重點實驗室，廣西 南寧 530200）

千里光為菊科植物千里光SenecioscandensBuch. -Ham. 的地上干燥部分，廣泛分布在我國陜西、湖北、四川、廣西等地，有抗炎鎮痛、抗腫瘤、抑菌等功效［1-4］。近年來，千里光藥材的獲得主要為野生來源，產地、環境氣候的不同均會影響藥材質量，且缺少能直觀反映多批次千里光藥材差異標志物的指紋圖譜研究［5］。鑒于此，本研究中采用高效液相色譜（HPLC）法建立了千里光藥材的指紋圖譜，并結合聚類分析、主成分分析探索引起千里光藥材質量差異的主要成分，同時以網絡藥理學分析千里光藥材的功效關聯物質及作用基礎，以期為全面控制和評價千里光藥材的質量提供參考?，F報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

ML204T/02 型電子天平、XSR205DU/A 型電子天平（梅特勒-托利多儀器＜上海＞有限公司，精度分別為0.1 mg 和0.01 mg）；LC-2030 Plus 型高效液相色譜儀（日本Shimadzu 公司）；KQ - 800DE 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；UPH -IV20TN 型優普超純水機（四川優普超純科技有限公司）。

1.2 試藥

綠原酸對照品、金絲桃苷對照品（成都曼思特生物科技有限公司，批號分別為MUST-22111711，MUST-22071210，含量分別為99.82%，98.41%）；咖啡酸對照品、蘆丁對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號分別為110885 - 201703，100080 - 201811，含量分別為99.7%，91.7%）；異槲皮苷對照品（成都麥德生科技有限公司，批號為RP200404，含量為99.18%）；異綠原酸A對照品、異綠原酸C 對照品（上海融禾醫藥科技發展有限公司，批號分別為211106，211128，含量均為98%）；乙腈、磷酸均為分析純，水為超純水。千里光藥材15 批（樣品信息見表1），經廣西中醫藥大學田慧教授鑒定為正品。

表1 藥材樣品信息Tab.1 Information of medicinal material samples

2 方法與結果

2.1 HPLC 指紋圖譜建立

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Shim-pack GIST C18柱（250 mm×4.6 nm，5μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～20 min 時11%A，20～21 min 時11%A →13%A，21～65 min 時13%A →21%A，65～67 min 時21%A，67～75 min 時21%A →25%A，75～81 min 時25%A →28%A，81～90 min 時28%A →11%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：345 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：10μL。

2.1.2 溶液制備

取對照品各適量，用60%甲醇溶解，制成綠原酸、咖啡酸、金絲桃苷、異槲皮苷、蘆丁、異綠原酸A、異綠原酸C 質量濃度分別為0.342，0.172，0.366，0.186，0.178，0.224，0.164 mg/ mL 的混合對照品溶液。取藥材樣品適量，粉碎，過2 號篩，取1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入60%甲醇25 mL，稱定質量，加熱回流1 h，放冷，再次稱定質量，并用60%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

2.1.3 方法學考察

精密度試驗：精密吸取供試品溶液（編號Q11）適量，按2.1.1項下色譜條件連續進樣測定6次，以4號峰為參照峰。結果各共有峰相對保留時間的RSD均小于0.25%（n=6），相對峰面積的RSD均小于2.44%（n=6），表明方法精密度良好。

穩定性試驗：精密吸取供試品溶液（編號Q11）適量，分別于室溫下放置0，2，4，8，12，24 h 時按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，以4 號峰為參照峰。結果各共有峰相對保留時間的RSD均小于0.41%（n= 6），相對峰面積的RSD均小于1.40%（n= 6），表明供試品溶液室溫下放置24 h內較穩定。

重復性試驗：取藥材樣品（編號Q11）適量，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，平行6 份，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，以4 號峰為參照峰。結果各共有峰相對保留時間的RSD均小于0.09%（n=6），相對峰面積的RSD均小于2.74%（n=6），表明方法重復性良好。

2.1.4 特征圖譜的建立及相似度評價

取15 批藥材樣品各適量，按2.1.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012 版）評價，以Q11 樣品的HPLC 圖譜為參照圖譜，時間窗寬度為0.1 min，采用中位數法生成共有模式，多點校正和Mark峰匹配生成疊加圖譜及對照圖譜（見圖1、圖2），共確定18個共有峰，與混合對照品溶液色譜圖（見圖3）對比后，指認出其中7 個。15 批藥材樣品的指紋圖譜相似度介于0.892～0.997（僅Q6 樣品低于0.9），詳見表2?？梢?，不同產地千里光藥材的成分差異較小，較穩定。

圖2 藥材樣品高效液相色譜對照指紋圖譜Fig.2 HPLC reference fingerprints of medicinal material samples

圖3 混合對照品溶液高效液相色譜圖4.Chlorogenic acid 5.Caffeic acid 11.Rutin 12.Hyperoside 13.Isoquercetin 15.Isochlorogenic acid A 16.Isochlorogenic acid CFig.3 HPLC chromatograms of mixed reference solution

表2 樣品相似度Tab.2 Similarity of samples

2.2 聚類分析

將15 批藥材樣品指紋圖譜相對峰面積數據導入SPSS 25.0 軟件進行聚類分析，結果見圖4。當平方歐氏距離為10或6時，樣品分別可聚為2類（S6為一類，其余為一類）或3類（S12和S15為一類，S6為一類，其余為一類）?？梢姡煌a地的樣品存在差異，可能與環境、氣候及地理位置因素有關。

圖4 15批藥材樣品聚類樹圖Fig.4 Tree diagram of cluster analysis of 15 batches of medicinal material samples

2.3 主成分分析

將15 批藥材樣品中18 個共有峰的相對峰面積（以綠原酸峰為參照）導入SPSS 25.0 和SIMCA 14.1.0 軟件，以主成分特征值和方差貢獻率進行主成分分析，結果見表3、圖5。共有4 個主成分被提取，累積方差貢獻率為90.195%，表明能代表樣品大部分信息。

圖5 PCA得分圖Fig.5 Scoring plot of PCA

表3 藥材樣品主成分特征值及方差貢獻率Tab.3 Eigenvalue and variance contribution rates of principal components of medicinal material samples

主成分因子成分矩陣見表4?？芍暂d荷系數的正方向值為依據，第1-4 主成分分別反映了指紋圖譜中1 - 3，5，7，9，11 - 18 號峰，6，8，10 號峰，4 號峰，1 號峰的信息。提示這些成分是引起千里光藥材質量和功效差異的重要因素。

表4 藥材樣品成分矩陣Tab.4 Component matrix of medicinal material samples

2.4 網絡藥理學分析

候選成分靶點預測及成分- 靶點網絡構建：利用SwissTargetPredication（http：// www. swisstargetprediction.ch）、SEA（http：// sea.bkslab.org）數據庫，將前述7 種成分導入，預測其靶點，刪除重復靶點后共得到109 個相關靶點，利用Cytoscape 3.8.0 軟件構建成分-靶點網絡，詳見圖6。

圖6 成分-靶點網絡Fig.6 Network of components - targets

蛋白相互作用（PPI）網絡構建：將篩選出的109 個相關靶點導入String 數據庫（https：// string - db. org），設置PPI 評分＞0.4，刪除游離靶點（見圖7），通過Cytoscape 3.8.0 軟件對PPI 網絡進行拓撲分析，篩選出關鍵靶點18個［度（degree）值＞12.46（均值）］，詳見表5。

圖7 PPI網絡Fig.7 PPI network

表5 關鍵靶點篩選結果Tab.5 Results of key targets screening

富集分析：將篩選出的18 個關鍵靶點導入Metascape 數據庫（https：// metascape. org），以P＜0.05進行基因本體論（GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。GO 富集得條目233條，其中生物學過程（BP）197 條，細胞組成（CC）17 條，分子功能（MF）19條，以-lgP值排序，分別取顯著性排前10的條目進行可視化分析，詳見圖8。其中BP主要涉及細胞對輻射、活性氧、紫外線（UV-A）、化學應激、光刺激、無機物質、金屬離子和氧化應激的反應，以及調控miRNA 代謝過程等；CC 主要涉及膜筏、膜微域、囊泡腔、細胞投影膜、細胞前緣、前沿膜、轉錄調節復合體、細胞外基質、細胞質囊泡腔等；MF 主要涉及信號受體活性調節、染色體結合、酶活性調節等。KEGG富集得59條信號通路，以-lgP值排序，取排前10 的條目進行可視化分析，詳見圖9和表6。

圖8 GO功能富集分析Fig.8 Results of GO functional enrichment analysis

圖9 KEGG通路富集分析Fig.9 Results of KEGG pathway enrichment analysis

表6 靶點富集分析Tab.6 Analysis of target enrichment

成分- 靶點- 通路網絡構建：利用Cytoscape 3.8.0 軟件構建成分-靶點-通路網絡，詳見圖10。采用Network Analysis 功能對網絡進行分析，發現JUN，FOS，MMP - 9，EGFR 的degree 值較高，腫瘤信號通路、內分泌耐藥通路與核心靶點關系密切。

圖10 成分-靶點-通路網絡Fig.10 Network of components - targets - pathways

3 討論

預試驗中在制備供試品溶液時，考察了不同提取方式（超聲、回流），不同提取溶劑（40%，60%，75%，100%甲醇），不同提取時間（20，30，40，50，60 min）對提取效果的影響，發現樣品經60%甲醇回流提取1 h，其色譜峰數目豐富，整體峰形較好。同時對乙腈- 水、甲醇-水和乙腈-0.1%磷酸水溶液這3個流動相體系進行考察，發現以乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動相時的基線穩定，各峰分離效果較好，故選擇。

中藥成分復雜多樣，具有多成分、多靶點、整體性等特點，其質量是保證臨床療效的關鍵［6］。2020 年版《中國藥典（一部）》僅將金絲桃苷作為千里光藥材質量評價指標，缺乏多指標成分評價［7］。鑒于此，本研究中對千里光藥材化學成分進了表征，建立了15 批藥材樣品的HPLC 指紋圖譜，相似度均較高，并確定了18 個共有峰，指認出其中7 個成分。通過聚類分析和主成分分析得到了影響藥材質量和導致功效差異的活性成分。

文獻研究發現，千里光藥材的主要活性成分為黃酮類成分（如蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷等，具有抗炎、抗腫瘤等作用）［8-11］及酚酸類成分（如綠原酸、咖啡酸、異綠原酸A、異綠原酸C 等，具有抗氧化、抑菌作用）［12-13］。網絡藥理學分析結果顯示，7 種活性成分通過調控EGFR，ESR1，JUN，MMP - 9 等關鍵靶點作用于腫瘤信號通路、內分泌耐藥通路、松弛素信號通路等關鍵信號通路。EGFR 是跨膜受體激酶家族HER/ ERB - B 成員之一，主要參與細胞的增殖、分化、遷移、凋亡等環節，但EGFR 過度表達會導致細胞分裂、生長失控，與腫瘤細胞的形成和發展密切相關［14-15］。ESR1是核受體蛋白超家族重要成員，可與雌激素結合調節機體產生相應生物學效應。有研究表明，ESR1的表達與機體細菌感染狀態有關［16-17］。

綜上所述，本研究中通過建立千里光藥材的HPLC指紋圖譜，并結合聚類分析、主成分分析、網絡藥理學研究初步預測，與EGFR，ESR1，JUN，MMP-9等關鍵靶點有關的咖啡酸、異槲皮苷、金絲桃苷可能為千里光藥材發揮抗腫瘤和抑菌等作用的功效關聯物質。