新型冠狀病毒滅活疫苗（Vero 細胞）內毒素檢查方法比較*

袁 晶，孫也婷，許馨月，王 琳，張立志

（北京科興中維生物技術有限公司，北京 102600）

目前，新型冠狀病毒（簡稱新冠病毒）滅活疫苗（Vero細胞）已成為全球獲批上市疫苗。然而，疫苗中若混入細菌內毒素，則能激活機體中性粒細胞釋放內源性熱原物質，并作用于體溫調節中樞引起機體發熱［1-2］，隨后發生嚴重休克，且接種者通常在確診前就已死亡［3］。因此，各國藥典已明確指出需控制疫苗中的內毒素濃度。疫苗注射劑中細菌內毒素的主要來源除細菌污染外，還有生產和控制階段與產品接觸的材料和介質［4-5］。細菌內毒素的檢查方法包括凝膠法和光度測定法，其中凝膠法已被作為檢查注射劑藥品細菌內毒素的“仲裁”方法［6］，光度測定法中的動態濁度（TKA）法也已收載于各國藥典。鱟已被列為國家二級保護動物，導致鱟試劑的獲取逐漸受到嚴格限制，亟需尋求減少鱟試劑使用量的替代檢測方法。微量動態顯色（mKCA）法是新一代的光度測定檢查方法，具有節省鱟試劑、高靈敏度、強抗干擾能力、數據完整和可追溯等特點［7］。然而，這3種檢查方法用于新冠病毒滅活疫苗內毒素檢查的適宜性和精確性尚未明晰。鑒于此，本研究中擬討論并篩選出最適宜的新冠病毒滅活疫苗（原液和成品）內毒素定量檢測方法，以期為相應疫苗的數據追溯、質量安全控制提供技術支持?，F報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

TAL-40D型試管恒溫儀［恒溫精度（37±0.2）℃］，Bioprobe Robot I 細菌內毒素檢測系統（精度變異系數≤0.2%，0.3～3 Abs），細菌內毒素檢查96孔反應板（內毒素濃度＜0.005 EU/mL），均購自湛江安度斯生物有限公司；MS 3 D S025 型漩渦混合器（德國IKA 公司，功率為10 W）；LKL164 - 03 型64 通道動態試管儀（英國Lab Kinetics公司，光學精度漂移小于±3%/30 min）。

1.2 試藥

新冠病毒滅活疫苗原液及成品（Vero 細胞，北京科興中維生物技術有限公司，原液批號分別為C202112-005 - 1，C202112 - 005 - 2，C202112 - 005 - 3，C202112 - 006 - 1，C202112 - 006 - 2，C202112 -006-3，C202112-007-1，C202112-007-3，成品批號分別為OD202201001，OD202201002，OD202201003，OD202201005，ON202201002，ON202201006，規格均為每瓶0.5 mL）；細菌內毒素工作標準品（中國食品藥品檢定研究院，批號為150601-202191，規格為每支90 EU）；鱟試劑1（福州新北生化工業有限公司，批號為22090212，靈敏度為0.03 EU/mL，規格為每支0.1 mL），鱟試劑2（批號分別為2009181，2112290，靈敏度為0.03 EU/mL，規格為每支0.1 mL，用于凝膠法），鱟試劑3（批號為2105210，靈敏度為0.01 EU/mL，規格為每支1.25 mL，用于光度測定法），細菌內毒素檢查用水（BET 用水，批號為2106010，內毒素濃度＜0.003 EU/ mL，規格為每瓶100 mL），均購自湛江安度斯生物有限公司。

2 方法與結果

2.1 試劑可靠性評價

2.1.1 凝膠法鱟試劑靈敏度復核

吸取BET用水1.0 mL，加入1支細菌內毒素工作標準品中，振蕩15 min，混勻，獲得終濃度為90 EU/mL的工作標準溶液。鱟試劑靈敏度（λc）按公式λc=lg-1（ΣX/4）計算，式中，X為反應終濃度的對數（lg）值，反應終濃度即系列遞減的內毒素濃度中最后一個呈陽性結果（+）的濃度，4為每個濃度的平行管數。當λc為0.5λ～2.0λ時，判定該鱟試劑可用于內毒素檢查。結果2 個廠家的鱟試劑均符合規定和檢測要求。

2.1.2 光度測定法標準曲線可靠性試驗

以BET 用水稀釋細菌內毒素工作標準溶液，配制成濃度分別為10.0，1.00，0.10，0.01 EU/mL 的內毒素標準溶液，每一濃度平行3 份，最低稀釋濃度不低于鱟試劑的標注檢測限，同時設立2 管陰性對照（NC）。按鱟試劑說明書要求加入試劑，檢測405 nm 波長處的吸光度（OD）值，以反應時間（t）對濃度（c）的lg 值進行線性擬合。當NC 的內毒素檢測值小于標準曲線最低點的檢測值或反應時間大于標準曲線最低點的反應時間，TKA法的CV＜10%［8］，mKCA 法的CV≤20%［9］時，判定該試驗條件成立；當標準曲線的|r|≥0.980 時，判定該試驗有效，該鱟試劑可用于內毒素檢查。以lgc為橫坐標、lgt為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程lgt1= 2.90 -0.25 lgc1，lgt1=2.90-0.28 lgc2（見圖1），標準曲線最低濃度均大于NC的內毒素濃度，|r|＞0.980，CV＜10%（見表1）。可見，曲線可靠，試驗結果可信，鱟試劑符合要求。

表1 光度測定法鱟試劑標準曲線可靠性試驗結果Tab.1 Results of the reliability test of TAL standard curve by photometric assays

圖1 回歸曲線A.TKA B.mKCAFig.1 Regression curves

2.2 干擾初篩試驗

2.2.1 細菌內毒素限值（L）的確定

新型冠狀病毒滅活疫苗（Vero 細胞）內毒素L，原液為不超過5 EU/600 SU，成品為不超過每劑5 EU。

2.2.2 最大有效稀釋倍數（MVD）的確定

MVD=CL/λ。式中，C為供試品疫苗的體積分數，單位為mL/mL；L的單位為EU/mL；λ為凝膠法鱟試劑的標示靈敏度（EU/mL），或為光度測定法中標準曲線最低內毒素濃度。計算得凝膠法、TKA 法、mKCA 法中供試品的MVD分別為333倍、1 000倍、1 000倍。

2.2.3 干擾初篩試驗

取Vero 細胞原液、成品各1 批，作為供試品分別進行干擾初篩試驗。

凝膠法：將供試品稀釋10 倍、20 倍、40 倍（均不超過MVD），作為供試品陰性對照溶液（NPC），同時制備2λ濃度標準內毒素的溶液作為供試品陽性對照（PPC）。取2 個廠家的鱟試劑分別與PPC 和NPC 進行反應，每一濃度設置2 個平行，并設陽性對照（PC）和NC。在NC 為陰性且PC 為陽性前提下，各稀釋倍數中，NPC均為陰性，PPC均為陽性，則認為在該濃度下無干擾。初步篩選出供試品的最小無干擾濃度，用于正式干擾試驗。初篩結果顯示，供試品（原液和成品）在稀釋到10倍及以上濃度時未見增強或抑制的干擾作用，且2個廠家鱟試劑的檢測結果一致（見表2；+/- 分別為陽性/陰性反應，表4同），故選擇稀釋10倍進行正式干擾試驗。

表2 凝膠法Vero細胞原液和成品干擾初篩試驗結果Tab.2 Results of the interference pre - test of Vero cell bulk and final products by gel - clot method

光度測定法：采用2.1.2 項下方法繪制回歸曲線，將供試品稀釋20倍、40倍、80倍（均不超過MVD），作為NPC，選擇λm作為供試品干擾試驗中添加的內毒素濃度，制備PPC。加入相應鱟試劑，每一濃度設置2 個平行，并設NC，分別置64 通道動態試管儀和細菌內毒素檢測系統、96 孔反應板中進行檢測。反應結束后，根據回歸方程分別計算NPC 和PPC 的內毒素濃度Ct和Cs，回收比（R）=（Ct-Cs）/λm× 100%，式中，λm為一個靠近中點的內毒素濃度。根據2.1.2試驗條件成立的前提下，當回收比在50%～200%范圍內時，說明在該試驗條件下供試品溶液無干擾作用，可進行正式干擾試驗。結果顯示，各稀釋倍數的回收率均在該范圍內，詳見表3，故選擇稀釋20倍進行正式干擾試驗。

表3 光度測定法Vero細胞原液和成品干擾初篩試驗結果Tab.3 Results of the interference pre - test of Vero cell bulk and final products by photometric assays

2.3 干擾試驗

另取原液、成品各3批，作為供試品，分別進行正式干擾試驗。

凝膠法：取上述供試品，以初篩試驗所得供試品無干擾稀釋倍數分別制備未檢驗出內毒素且不超過MVD的溶液為干擾試驗溶液。按鱟試劑靈敏度復核試驗方法操作，用干擾試驗溶液作為稀釋劑，每一濃度設置4個平行，NC設置2個平行；使用BET用水作為稀釋劑，每一濃度設置2 個平行，NC 設置2 個平行。結果當NPC和NC 的所有平行管均為陰性，以BET 用水做稀釋劑時的鱟試劑靈敏度實測值符合鱟試劑靈敏度復核試驗要求時，認為供試品在該濃度下無干擾作用，試驗方為有效。結果2 個廠家的鱟試劑對3 批Vero 細胞原液（C202112 - 005 - 1，C202112 - 005 - 2，C202112 -005 - 3）和3 批成品（OD202201001，OD202201002，OD202201005）的檢測結果均在稀釋10 倍時無干擾作用，詳見表4。

表4 凝膠法干擾試驗結果Tab.4 Results of the interference test by gel - clot method

光度測定法：取上述供試品，以干擾初篩試驗得到的供試品無干擾稀釋倍數分別制備NPC，按干擾初篩試驗方法進行干擾驗證試驗，結果鱟試劑對疫苗稀釋20 倍時，3 批原液和成品的回收比均在50%～200%范圍內，詳見表5。表明在該稀釋倍數下對結果無干擾作用，可進行內毒素定量檢查。

表5 光度測定法干擾試驗結果Tab.5 Results of the interference test by photometric assays

2.4 供試品檢查

取4批Vero細胞原液（C202112-006-1，C202112-006-2，C202112-006-3，C202112-007- 1）及2 批成品（ON202201006，OD202201003），分別利用3 種檢測方法進行內毒素檢測，小于限值時為合格。結果內毒素實測值凝膠法均小于0.3 EU/ mL，光度測定法均小于0.2 EU/ mL，均在限值范圍內，判定供試品均合格。詳見表6。雖然3 種方法檢測結果均符合企業質量標準要求，但凝膠法屬定性檢測，光度法屬定量檢測，特別是后者中mKCA法的鱟試劑原料使用量更少。

表6 光度測定法的供試品內毒素檢查結果Tab.6 Results of the endotoxin determination of test samples by photometric assays

3 討論

目前，全球已有多個廠家生產新冠病毒滅活疫苗，產量超過50 億劑。截至2023 年3 月16 日，全球已有132.368 5 億劑次新冠疫苗接種（數據來自世界衛生組織官網）。在臨床試驗中，接種新冠病毒滅活疫苗（Vero細胞）的總體不良反應發生率較低，未見死亡病例報告。

疫苗質量安全的保障與內毒素的檢查緊密相關。本研究中利用內毒素檢查的3 種常用方法檢測新冠病毒滅活疫苗（Vero 細胞）原液和成品中內毒素的濃度。發現3種方法使用的鱟試劑均具有可靠性，初篩試驗條件對結果均無干擾作用，即影響凝集反應的因素（含電解質、pH、反應時間、溫度、鱟試劑來源、供試品顏色和成分等）無干擾作用；測得的供試品內毒素濃度均低于企業規定限值，即符合要求；檢測目的和性質略有差異，但檢測結果具有一致性。本研究結果提示，mKCA 法能減少鱟試劑的使用量，且能更直觀、更大范圍、更快速地進行內毒素濃度的定量檢查，測得數據回收率較高和變異系數較低，故建議使用mKCA法對新冠病毒滅活疫苗（Vero細胞）原液和成品進行內毒素檢查。

在以往的注射液領域，鱟試劑凝膠法檢查內毒素的應用最廣泛，涉及藥物包括喘可治、鹽酸法舒地爾、鹽酸吡硫醇、單硝酸異山梨酯、高濃度維生素B6、膦甲酸鈉氯化鈉、柴胡等注射液［10-16］。與凝膠法相比，TKA法更能減少人為判斷誤差，滿足數據完整和可追溯的要求。范治云等［17］建議利用TKA 法檢查碘克沙醇注射液的內毒素濃度。與TKA 法相比，mKCA 法使用的鱟試劑更少（用量僅為凝膠法的1/10），還能減少人為操作誤差、滿足數據完整和可追溯的要求。在以往的疫苗領域，TKA 法［18］和mKCA 法檢查內毒素的應用居多，后者尤其適用于檢測重組新冠病毒疫苗（CHO 細胞）的內毒素［19］。與本研究相同的是，上述研究均針對新冠病毒，均選用mKCA法檢查疫苗中內毒素含量。這進一步佐證了mKCA 法檢查新冠病毒滅活疫苗（Vero 細胞）原液和成品內毒素的可行性；不同的是，本研究的檢測對象為滅活疫苗，而以往研究檢測對象為重組疫苗，且本研究是通過比較3種不同檢測方法后得出的結論，數據更全面，更有利于支撐最適方法的結論?？梢?，該方法可用于新冠病毒滅活疫苗（Vero 細胞）的原料和成品的內毒素檢測，可作為滅活疫苗領域的內毒素檢查手段，并在滅活疫苗領域廣泛應用。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突。