注射用鹽酸頭孢甲肟丁基橡膠塞質(zhì)量控制研究*

郭勝才，席時(shí)東，戴安印，周文威

（1. 中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇三醫(yī)院，浙江 杭州 310013； 2. 浙江省寧波市藥品檢驗(yàn)所，浙江 寧波 315000； 3. 浙江省寧波市第二醫(yī)院，浙江 寧波 315010）

藥用鹵化丁基橡膠塞呈立體網(wǎng)狀多孔結(jié)構(gòu)，主要成分是生膠，具有良好的彈性、阻隔性、低萃取性，對(duì)熱、臭氧和化學(xué)品有良好的抗耐性。為確保膠塞符合藥用質(zhì)量要求，需在膠塞中添加配合劑。配合劑按作用的不同，可分為硫化劑、硫化促進(jìn)劑、防老劑、填充劑、著色劑及活性劑等［1-4］。硫磺和二硫化四甲基秋蘭姆（下文簡稱秋蘭姆）分別是常用的硫化劑和硫化促進(jìn)劑，其可使橡膠膠料通過生膠分子間交聯(lián)，生成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)［1］。抗氧劑可延長膠塞材料的壽命，抑制或延緩膠塞老化，其中2，6 - 二叔丁基- 4 - 甲基苯酚（BHT）是優(yōu)良的通用型酚類抗氧劑，在橡膠塞的生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛［5］。但配合劑可能存在對(duì)人體有害的成分，且影響膠塞與藥物的相容性［2-3］，單質(zhì)硫和常見抗氧劑可從膠塞遷移至藥品中，因此多國對(duì)膠塞中的抗氧劑、硫化劑等有關(guān)成分作了限量規(guī)定。基于此，本研究中參考2020年版《中國藥典（二部）》和相關(guān)文獻(xiàn)［6-15］，建立了同時(shí)測(cè)定藥用丁基膠塞中單質(zhì)硫、秋蘭姆和BHT 含量的高效液相色譜（HPLC）法，并將其用于市場上多批膠塞和藥品樣品的檢測(cè)，為注射用頭孢甲肟藥品的質(zhì)量控制和藥品與包材的相容性研究提供參考。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1200 型高效液相色譜儀，配二極管陣列檢測(cè)器（美國Agilent 公司）；CP225D 型電子分析天平（德國Sartorius 公司，精度為0.001 g）；SB - 5200DTN 型超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；ST40R型離心機(jī)（美國Thermo Fisher Scientific 公司）。

1.2 試藥

注射用鹽酸頭孢甲肟（含膠塞）為2018年國家藥品抽檢樣品，其中S1 - S4，S5 - S7，S8 - S9，S10 - S13，S14 - S17，S18 - S20，S21 - S23，S24 - S29 樣品分別由廠家A-H 提供；空白丁基橡膠塞（由廠家A-H 提供，各2 個(gè)；分別由廠家I，J，K，K，I，L，L，K 生產(chǎn)，編號(hào)分別為I1、I2，J1、J2，K1、K2，K3、K4，I3、I4，L1、L2，L3、L4，K5、K6）；秋蘭姆對(duì)照品（批號(hào)為stbf1299v，含量97%），BHT 對(duì)照品（批號(hào)為bcbv3237，含量＞99.0%），均購自德國Merck 公司；單質(zhì)硫?qū)φ掌罚▏幖瘓F(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)為20170227，含量99.999%）；乙腈為色譜純，二氯甲烷、無水乙醇、三氟乙酸均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Shiseido CAPCELL PAK MGⅡC18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：1%三氟乙酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～6 min時(shí)30%A，6～26 min時(shí)30%A →10%A，26～31min時(shí)30%A）；流速：1.0mL/min；檢測(cè)波長：280 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：20μL。

2.2 溶液制備

分別取秋蘭姆、BHT、單質(zhì)硫?qū)φ掌?9.40，23.30，10.07 mg，精密稱定，分別置50 mL 容量瓶中，加入二氯甲烷-無水乙醇（1∶1，V/V）溶解并定容，搖勻，即得質(zhì)量濃度分別為388.0，461.3，201.4μg/mL 的單一對(duì)照品溶液，各取適量，置同一容量瓶中，稀釋10倍，制成混合對(duì)照品溶液。

取藥品粉末或剪碎的空白膠塞樣品2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入二氯甲烷-無水乙醇（1∶1，V/V）10 mL，稱定質(zhì)量，100 ℃水浴回流3.5 h，放冷，再次稱定質(zhì)量，用二氯甲烷-無水乙醇（1∶1，V/V）補(bǔ)足減失的質(zhì)量，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜濾過，取濾液，即得供試品溶液或膠塞供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液和膠塞供試品溶液各適量，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果膠塞供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液相同保留時(shí)間處有相應(yīng)BHT、單質(zhì)硫色譜峰，理論板數(shù)按秋蘭姆峰、BHT 峰、單質(zhì)硫峰計(jì)均大于2 000，保留時(shí)間分別為4.389，12.985，23.872 min，各成分峰之間分離良好，分離度均大于2.0。詳見圖1。

線性關(guān)系考察：精密量取2.2 項(xiàng)下3 種單一對(duì)照品溶液各適量，加入二氯甲烷-無水乙醇（1∶1，V/V）分別稀釋至每1 mL 含BHT 0.46，0.74，0.92，4.61，23.07，46.13，230.67 μg，單質(zhì)硫0.20，0.32，0.40，2.01，10.07，20.14，100.70 μg，秋蘭姆0.000 2，0.000 3，0.000 5，0.001 0，0.001 9，0.009 7，0.048 5μg的系列單一對(duì)照品溶液。取20μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以待測(cè)成分質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見表1。

表1 線性關(guān)系及檢測(cè)限、定量限考察結(jié)果Tab.1 Results of the linear relation test，LOD and LOQ investigation

檢測(cè)限與定量限考察：取“線性關(guān)系考察”項(xiàng)下的系列單一對(duì)照品溶液各適量，稀釋，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以信噪比為10∶1 和3∶1 時(shí)的待測(cè)成分質(zhì)量濃度為定量限和檢測(cè)限。結(jié)果見表1。

精密度試驗(yàn)：取2.2 項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液（分別含秋蘭姆0.009 7 μg/ mL，BHT 4.61 μg/ mL，單質(zhì)硫2.01μg/mL）適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果秋蘭姆、BHT、單質(zhì)硫峰面積的RSD分別為1.09%，0.46%，1.44%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取2.2 項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，分別于室溫放置1，9，30 d 時(shí)按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果秋蘭姆、BHT、單質(zhì)硫保留時(shí)間的RSD分別為0.30%，0.60%，0.47%，峰面積的RSD分別為1.94%，1.53%，1.38%（n=3），表明混合對(duì)照品溶液在室溫條件下放置30 d內(nèi)基本穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的A廠家膠塞（編號(hào)為I1）2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入每1 mL含秋蘭姆0.048μg BHT 23.05μg、單質(zhì)硫10.07μg的單一對(duì)照品溶液4，5，6 mL，按2.2項(xiàng)下方法制備膠塞供試品溶液，再按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表2。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）Tab.2 Results of the recovery test（n=9）

2.4 樣品含量測(cè)定

取注射用頭孢甲肟粉末及經(jīng)剪碎的包材膠塞、空白膠塞樣品，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液及膠塞供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。采用外標(biāo)法計(jì)算待測(cè)成分含量，結(jié)果見表3 至表5（S0 為日本武田制藥公司所產(chǎn)原研藥，使用覆膜丁基膠塞）；與20 ℃及以下（陰涼庫）存放比較，藥品粉末樣品60 ℃條件下倒置存放5 d 后包材膠塞BHT 含量無顯著變化（t= 1.284，P＞0.05），單質(zhì)硫含量顯著減少（t=2.928，P＜0.05），詳見表6。以上檢測(cè)中均未檢出秋蘭姆。

表3 空白膠塞樣品含量測(cè)定結(jié)果（μg/g，n=3）Tab.3 Results of content determination of relevant ingredients in blank rubber stoppers（μg/g，n=3）

表4 注射用頭孢甲肟粉末樣品的含量測(cè)定結(jié)果（μg/g，n=3）Tab.4 Results of content determination of relevant ingredients in Cefmenoxime Hydrochloride for Injection powder（μg/g，n=3）

表5 包材膠塞樣品含量測(cè)定結(jié)果（μg/g，n=3）Tab.5 Results of content determination of relevant ingredients in packaging rubber stoppers（μg/g，n=3）

表6 60 ℃下倒置5 d后包材膠塞含量測(cè)定結(jié)果（μg/g，n=3）Tab.6 Results of content determination of relevant ingredients in packaging rubber stoppers after inversion at 60 ℃for 5 d（μg/g，n=3）

3 討論

3.1 色譜條件選擇

預(yù)試驗(yàn)中考察了不同配比的甲醇-水、乙腈-水、乙腈-四氫呋喃-水、乙腈-0.1%三氟乙酸等溶劑作為流動(dòng)相的分離效果，結(jié)果顯示，以乙腈- 0.1%三氟乙酸（90∶10，V/V）為流動(dòng)相時(shí)秋蘭姆、BHT和單質(zhì)硫的分離效果較好，色譜峰峰形對(duì)稱，但秋蘭姆保留時(shí)間過短，易受溶劑峰干擾，因此以乙腈- 0.1%三氟乙酸作為流動(dòng)相時(shí)，前6 min 兩者體積比為70∶30，待秋蘭姆出峰后，流動(dòng)相配比調(diào)整為90∶10（V/ V），這樣既可避免溶劑峰對(duì)秋蘭姆峰的干擾，又可縮短分析時(shí)間，提高分析效率。利用光電二極管陣列檢測(cè)器可在線獲得3種待測(cè)成分的紫外光譜圖的特點(diǎn)，比較紫外檢測(cè)光譜圖，發(fā)現(xiàn)在280 nm 波長處3 種待測(cè)成分均有較強(qiáng)紫外吸收，故選擇280 nm作為檢測(cè)波長。

3.2 提取方式選擇

比較了無水乙醇、乙腈、二氯甲烷、二氯甲烷- 無水乙醇（1∶1，V/V）作為提取溶劑的3 種待測(cè)成分的得率，發(fā)現(xiàn)二氯甲烷- 無水乙醇（1∶1，V/ V）對(duì)BHT 和單質(zhì)硫的提取更完全，但在膠塞提取試驗(yàn)中均未檢測(cè)到秋蘭姆。另外考察了超聲提取和溶劑回流提取及不同回流時(shí)間對(duì)待測(cè)成分溶出的影響，發(fā)現(xiàn)超聲提取不及溶劑回流提取的提取率高，溶劑回流提取3.5 h達(dá)最大提取率，延長提取時(shí)間不會(huì)顯著影響提取結(jié)果，因此確定提取時(shí)間為3.5 h，但秋蘭姆在加熱回流條件下的加樣回收率較低。

3.3 測(cè)定結(jié)果分析

本研究結(jié)果顯示，所有樣品均未檢出秋蘭姆，可能因?yàn)榍锾m姆在丁基橡膠塞生產(chǎn)過程中與其他添加劑發(fā)生反應(yīng)或秋蘭姆類之間發(fā)生相互反應(yīng)，導(dǎo)致其在硫化過程中被消耗殆盡，故檢測(cè)不到［1］。秋蘭姆的加樣回收率低于70%，可能還與其熱穩(wěn)定性較差有關(guān)。不同制劑生產(chǎn)廠家提供的空白膠塞和實(shí)際樣品使用丁基橡膠塞中BHT 和單質(zhì)硫的測(cè)定結(jié)果不一致，批次差異大，說明膠塞生產(chǎn)廠家質(zhì)量不夠穩(wěn)定。2 家國內(nèi)公司與（原研廠家）日本武田制藥公司生產(chǎn)的注射用頭孢甲肟粉末使用覆膜丁基膠塞，其他廠家均使用普通丁基橡膠塞，使用覆膜丁基膠塞的藥品粉末中未檢出BHT 和單質(zhì)硫。20 ℃及以下存放樣品和60 ℃下倒置5 d 后樣品的丁基橡膠塞中BHT 含量無顯著差異，但單質(zhì)硫的含量顯著減少，表明溫度對(duì)丁基橡膠塞中BHT 的遷移無太大影響，但對(duì)單質(zhì)硫的遷移影響較大，可能有更多的硫遷移到了藥品粉末中，提示藥品應(yīng)在陰涼庫中保存。個(gè)別廠家的藥品粉末樣品中也檢出BHT，但均未檢出單質(zhì)硫，說明存在BHT向藥品粉末遷移的情況，需要制劑生產(chǎn)廠家對(duì)丁基橡膠塞除按現(xiàn)行國家藥品包材標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)外，還需重視其與制劑相容性引起的質(zhì)量問題。