骨奇泰搽劑質量標準提升研究*

林奕沁，秦銀燕，陳貞伶，何成章，陸 華

（廣西醫科大學第一附屬醫院，廣西 南寧 530021）

骨奇泰搽劑由川烏（制）、草烏（制）、細辛、乳香、威靈仙、徐長卿等12 味藥材組方，具有消腫止痛、舒筋活絡、祛風除濕、化瘀行氣功效［1］。該制劑已在臨床應用30 余年，主要用于治療腰椎間盤突出、關節炎、骨質增生等疾病引起的疼痛和功能障礙，因其使用簡便、價格低廉，廣受歡迎。但其現有質量標準僅對該制劑乙醇限量、澄明度、裝量差異、微生物限度等進行了控制。為了更好地反映藥品質量，確保臨床用藥安全有效，本研究中增加了薄層色譜（TLC）法定性鑒別徐長卿、細辛、威靈仙，并采用高效液相色譜（HPLC）法同時測定三七主要成分三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re 的含量，為完善和提升骨奇泰搽劑的質量標準提供參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC - 2030C 3D plus 型高效液相色譜儀（日本Shimadzu 公司）；HWS - 24 型恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司）；JP - 100S 型超聲波清洗機（深圳潔盟技術股份有限公司）；ZF-7型暗箱式紫外分析儀（成都華衡儀器有限公司）；ME204型電子天平、ME155DU型分析天平［梅特勒托利多科技（中國）有限公司，精度均為0.01 mg］；硅膠G 薄層板（煙臺新諾化工有限公司、青島邦凱高新技術材料有限公司、青島海洋化工有限公司、青島海浪化工有限公司）。

1.2 試藥

骨奇泰搽劑（批號分別為20200728，20210308，20211019，20220620），缺徐長卿、細辛、威靈仙、三七藥材的單一陰性樣品，均由醫院制劑室提供；細辛對照藥材（批號為121204-201608）、威靈仙對照藥材（批號為121189 - 201102），丹皮酚對照品（批號為110708 -201908，含量99.8%），細辛脂素對照品（批號為111889-201705，含量99.8%），齊墩果酸對照品（批號為110709-201808，含量91.1%），三七皂苷R1對照品（批號為110745 - 201921，含量90.4%），人參皂苷Rg1對照品（批號為110703 - 202034，含量94.0%），人參皂苷Re對照品（批號為110754-202028，含量93.9%），均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 TLC 鑒別

徐長卿：取樣品100 mL，置圓底燒瓶中，加水40 mL，蒸餾，棄去蒸餾液；加水60 mL，蒸餾，收集蒸餾液60 mL，用乙醚提取2次（35，30 mL），合并提取液，濃縮至干，殘渣加丙酮2 mL使溶解，即得供試品溶液。取丹皮酚對照品3 mg，加丙酮1.5 mL，制成對照品溶液。取缺徐長卿的陰性樣品100 mL，同供試品溶液制備方法制備缺徐長卿的陰性對照品溶液。按2020 年版《中國藥典（四部）》通則0502薄層色譜法［2］，吸取上述溶液各6μL，以環己烷-乙酸乙酯（8∶1，V/V）為展開劑，展開，取出，噴以鹽酸酸化的5%三氯化鐵乙醇溶液，置電熱板上加熱至斑點顯色清晰，置日光燈下檢視。結果供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置顯相同顏色的斑點，且陰性對照無干擾，詳見圖1 A。

圖1 薄層色譜圖A.Cynanchi Paniculati Radix et Rhizoma B.Asari Radix et Rhizoma C.Clematidis Radix et Rhizoma（C1.Under daylight lamp C2.Under ultraviolet lamp）1 - 3.Test solution 4.Reference solution 5.Negative reference solution 6.Reference medicinal solutionFig.1 TLC chromatograms

細辛：取樣品20 mL，水浴蒸干，殘渣加水30 mL 使溶解，加鹽酸調pH至2，用乙醚振搖提取2次，每次20 mL，合并乙醚液，揮發至干，殘渣加乙酸乙酯1 mL 使溶解，即得供試品溶液。取細辛脂素對照品2 mg，加甲醇2 mL制成對照品溶液。取細辛對照藥材0.5 g，加甲醇20 mL，超聲（功率250 W，頻率40 kHz）處理45 min，濾過，取續濾液，濃縮至2 mL，即得對照藥材溶液。取缺細辛的陰性樣品100 mL，同供試品溶液制備方法制備缺細辛的陰性對照品溶液。按2020 年版《中國藥典（四部）》通則0502 薄層色譜法［2］，吸取上述溶液各2μL，以環己烷-三氯甲烷- 乙酸乙酯（16∶3∶4，V/V/V）為展開劑，展開，取出，噴以2%香草醛硫酸溶液，熱風吹至斑點顯色清晰，置日光燈下檢視。結果供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液和對照品溶液色譜相應位置顯相同顏色的斑點，且陰性對照無干擾，詳見圖1 B。

威靈仙：取樣品70 mL，濾過，濾液濃縮至30 mL，加鹽酸調pH 至1～2，加熱回流1 h，加水15 mL，冷卻至室溫，加石油醚（60～90 ℃）35 mL振搖，分取石油醚部，蒸干，殘渣加無水乙醇5 mL 使溶解，即得供試品溶液。取齊墩果酸對照品2 mg，加甲醇2 mL制成對照品溶液。另取威靈仙對照藥材0.5 g，加乙醇45 mL，加熱回流2 h，濾過，取續濾液，濃縮至30 mL，同供試品溶液制備方法制備對照藥材溶液。取缺威靈仙的陰性樣品70 mL，同供試品溶液制備方法制備缺威靈仙的陰性對照品溶液。按2020 年版《中國藥典（四部）》通則0502 薄層色譜法［2］，吸取上述溶液各5μL，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（20∶3∶0.2，V/V/V）為展開劑，展開，取出，噴以10%硫酸乙醇溶液，置電熱板上加熱至斑點顯色清晰，分別置日光燈和紫外光燈（365 nm）下檢視。結果供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液和對照品溶液色譜相應位置顯相同顏色的斑點，且陰性對照無干擾，詳見圖1 C。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Shimadzu WondaSil Superb C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）- 水（B），梯度洗脫（0～30 min 時20%A，30～40 min 時20%A →29%A，40～41 min 時29%A）；流速：1.0 mL/ min；檢測波長：203 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：20μL。

2.2.2 溶液制備

混合對照品溶液：稱取人參皂苷Re對照品1.98 mg，精密稱定，置5 mL 容量瓶中，得對照品貯備液Ⅰ；另取三七皂苷R1對照品5.03 mg，人參皂苷Rg1對照品8.10 mg，精密稱定，置同一10 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，即得對照品貯備液Ⅱ。精密吸取對照品貯備液Ⅰ0.3 mL、對照品貯備液Ⅱ1.2 mL，置同一容量瓶中，用甲醇定容至5 mL，即得。

供試品溶液：取樣品4 mL，置90 ℃水浴蒸至近干，用15 mL 水分次溶解，轉入分液漏斗中，每次加入水飽和的正丁醇15 mL，振搖提取，重復5次，合并提取液；用氨試液洗滌3次，每次20 mL，再用正丁醇飽和的水洗滌3次，每次20 mL，正丁醇液蒸干，殘渣用甲醇溶解，并轉入25 mL 容量瓶，加甲醇定容，搖勻，經0.45μm 微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

陰性對照品溶液：精密吸取缺三七的陰性樣品4 mL，同供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學考察

系統適用性試驗：取2.2.2 項下混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液各適量，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果，理論板數按三七皂苷R1峰計應不低于8 000，分離度均大于1.8，基線分離良好。詳見圖2。

線性關系考察：分別精密量取2.2.2項下對照品貯備液Ⅰ4 mL，用甲醇稀釋成20 mL，精密吸取0.25，0.75，1.5，2.5，3.0，5.0 mL，置5 mL 容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得系列對照品溶液Ⅰ。分別精密量取2.2.2項下對照品貯備液Ⅱ0.15，0.25，0.75，1.5，2.5，3.0 mL，置5 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，制成系列對照品溶液Ⅱ。精密量取20μL，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分進樣量（X，μg）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re 的回歸方程分別為Y1=287 556X1-2 537（R2=1.000 0，n=6），Y2=320 059X2+756（R2=0.999 8，n=6），Y3=227 889X3-112.49（R2=0.999 9，n=6）。結果表明，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re 進樣量分別在0.281 0～5.465 2 μg、0.479 5～9.207 7μg、0.073 2～1.485 8μg范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：取2.2.2 項下混合對照品溶液適量，按2.2.1 項下色譜條件連續進樣測定6 次，記錄峰面積。結果，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re 峰面積的RSD為0.04%，0.21%，0.22%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取2.2.2 項下供試品溶液（批號為20211019）適量，分別于室溫下放置0，2，4，8，12，24 h時按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re 峰面積的RSD分別為0.36%，0.97%，0.65%（n=6），表明供試品溶液在室溫放置24 h內基本穩定。

重復性試驗：取樣品（批號為20211019）適量，精密稱定，各6 份，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結果，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re平均含量分別為0.244 7，1.013 8，0.110 1 mg/mL，RSD分別為1.36%，0.13%，0.89%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（批號為20211019）2 mL，共6份，分別加入一定質量濃度的三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re對照品溶液，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率，結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果（n=6）Tab.1 Results of the recovery test（n = 6）

2.2.4 樣品含量測定

取4 批樣品各適量，分別按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，平行測定2次，記錄峰面積，并計算樣品含量，結果見表2。

表2 樣品含量測定結果（mg/mL，n=2）Tab.2 Results of the content determination of three ingredients in samples（mg / mL，n = 2）

3 討論

骨奇泰搽劑組方藥材多達12味，成分復雜，對有效成分進行提取分離，并同時進行定性鑒別和定量分析的研究尚未見報道。本研究中增加了威靈仙、徐長卿和細辛的TLC 鑒別，并對提取方式、提取溶劑、展開劑及比例和進樣量進行了考察。其中，徐長卿的主要活性成分丹皮酚屬揮發油，熔點低，不溶于冷水，可隨水蒸氣蒸餾［3］，故采用水蒸氣蒸餾法提取。細辛TCL 鑒別預試驗中，供試品溶液嘗試了用石油醚（60～90 ℃）和乙醚提取。首先參考2020 年版《中國藥典（一部）》［4］提取方法，采用石油醚振搖提取，結果主斑點不明顯且始終有拖尾；嘗試用乙醚提取，發現所得斑點較清晰；同時分別考察了4種不同展開劑及比例，石油醚-乙酸乙酯（17∶1，V/V），石油醚- 乙酸乙酯（3∶1，V/V），甲苯- 乙酸乙酯-甲酸（20∶3∶0.5，V/V/V），環己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯（16∶3∶4，V/V/V）。經過多次對比，最后選擇第4 個組合作為展開劑時的分離效果較好，斑點清晰，且陰性對照無干擾。

預試驗中以人參皂苷Rb1作為主成分之一，參考藥典和文獻［5-7］，考察了乙腈、水2 個流動相的多種梯度洗脫比例，發現人參皂苷Rb1出峰時間較長，且隨著分析時間的延長，乙腈比例增加，洗脫的雜峰也增多，并干擾所測成分，故采用了人參皂苷Re取代。但人參皂苷Re 與人參皂苷Rg1的出峰時間非常接近，以往研究中也發現這2個成分的色譜峰較難分離［8］。經過多次試驗優化，最終以乙腈-水為流動相進行梯度洗脫，基線平穩，且峰形良好，陰性對照無干擾。

采用現代質量控制技術，對醫院制劑質量標準進行研究和提升［9-11］，不僅能促進其高質量發展，也可為臨床療效提供可靠保障，從而讓更多的患者受益。本研究中建立了HPLC 法同時測定三七中主要成分三七皂苷R1及人參皂苷Rg1、人參皂苷Re 的含量，該方法用于三七的含量控制，靈敏度高，操作簡便，經濟快捷，重復性較好。同時，徐長卿、細辛、威靈仙3 味藥材的TLC 鑒別方法經反復驗證，最終分離效果均良好，不受其余成分干擾，斑點清晰。綜上，本研究中所建立的定性定量方法可為骨奇泰搽劑的質量標準提升提供參考。