復方石淋通片質量評價方法研究

米振清，郭 佩

（山東省泰安市食品藥品檢驗檢測研究院·山東省泰安市纖維檢驗所，山東 泰安 271099）

復方石淋通片由廣金錢草、石韋、忍冬藤、海金沙、滑石粉配伍加工而成，臨床用于治療膀胱濕熱、泌尿系統感染等，對肝膽膀胱濕熱證療效顯著［1］。方中君藥廣金錢草利濕退黃、利尿通淋［2］；石韋清肺泄熱利水［3］、忍冬藤清熱疏風通絡［4］，合為臣藥，可助君藥排石通淋；佐藥海金沙、滑石粉可利水氣、排結石、通腎竅［5］，增君藥臣藥之效。全方共奏清熱利濕、通淋排石功效。目前復方石淋通片執行標準為《衛生部藥品標準中藥成方制劑：第12 冊》［1］，無含量測定控制項，馬杰等［6］采用高效液相色譜（HPLC）法僅測定了復方石淋通片中綠原酸和夏佛塔苷的含量，但尚未見指紋圖譜及多組分定量測定的報道。為了更全面地評價復方石淋通片的質量，本研究中采用了HPLC法建立復方石淋通片的指紋圖譜，同時結合多成分含量測定、聚類分析（CA）和主成分分析（PCA），為復方石淋通片的質量控制提供參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 2695 型高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；XP505 型分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度為0.01 mg）；KQ-400DE型超聲儀（昆山舒美超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

復方石淋通片10批（廣東萬年青制藥有限公司，批號分別為21070604，21070909，21091017，21091121，21091228，20091118，20091215，22050413，22050522，22050611，編號為S1 - S10）；夏佛塔苷對照品（批號為111912-202204，含量94.9%），異夏佛塔苷對照品（批號為111895-202103，含量93.7%），綠原酸對照品（批號為110753-202119，含量96.3%），咖啡酸對照品（批號為111914-202105，含量96.0%），馬錢苷對照品（批號為111520-202107，含量96.3%），芒果苷對照品（批號為111607 - 201704，含量98.1%），均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈為色譜純，磷酸為分析純，水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件［7-8］

色譜柱：WatersSunfireC18柱（200mm×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈（A）- 0.17%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～20 min 時19%A，20～39 min 時19%A →41%A，39～60 min 時41%A →62%A）；流速：0.9 mL/ min；檢測波長：327 nm（0～20 min，綠原酸、咖啡酸），334 nm（20～39 min，夏佛塔苷、異夏佛塔苷），240 nm（39～60 min，芒果苷、馬錢苷）；柱溫：35 ℃；進樣量：10μL。

2.2 溶液制備

混合對照品溶液：取夏佛塔苷、異夏佛塔苷、綠原酸、咖啡酸、馬錢苷、芒果苷對照品各適量，精密稱定，加70%甲醇溶解，定容，制成每1 mL含上述成分0.698 2，0.273 4，0.503 3，0.138 1，0.269 5，0.262 6 mg 的混合對照品貯備液；精密量取5.0 mL，置25 mL容量瓶中，加70%甲醇定容，即得。

供試品溶液：取樣品20 片，除去包衣，研勻，稱取1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，稱定質量，超聲（功率400 W、頻率40 kHz，下同）處理45 min，冷卻至室溫，再次稱定質量，用70%甲醇補足減失的質量，搖勻，經0.45μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

陰性對照品溶液：按復方石淋通片的處方和工藝制備分別缺廣金錢草、石韋、忍冬藤的單一陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制得。

2.3 HPLC 指紋圖譜建立

2.3.1 方法學考察

精密度試驗：取2.2 項下供試品溶液（編號S6）適量，按2.1 項下色譜條件連續進樣測定6 次，以夏佛塔苷峰為參照峰，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果的RSD分別為0.28%～0.51%和0.93%～1.46%（n=6），表明方法精密度良好。

穩定性試驗：取同一份供試品溶液（編號S6）適量，室溫下分別于0，4，8，16，20，24 h 時按2.1 項下色譜條件進樣測定，以夏佛塔苷峰為參照峰，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果的RSD分別為0.37%～0.66%（n= 6）和0.82%～1.53%（n= 6），表明供試品溶液室溫放置24 h內基本穩定。

重復性試驗：取復方石淋通片（編號S6）適量，按2.2 項下方法制備供試品溶液6 份，按2.1 項下色譜條件進樣測定，以夏佛塔苷峰為參照峰，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果的RSD分別為0.54%～0.92%和1.11%～1.88%（n=6），表明方法重復性良好。

2.3.2 指紋圖譜建立及相似度評價

將10 批樣品的HPLC 圖導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012A 版），生成10批樣品HPLC 疊加指紋圖譜，詳見圖1。并以S6圖譜為參考圖譜，以多點校正自動匹配生成樣品HPLC對照指紋圖譜，詳見圖2。共標示出21 個共有峰，10 批樣品的HPLC 圖譜與對照指紋圖譜的相似度分別為0.994，0.991，0.993，0.992，0.995，0.996，0.979，0.990，0.981，0.993，均大于0.970，表明10批樣品共有成分基本一致，質量較穩定。

圖1 10批樣品高效液相色譜疊加指紋圖譜Fig.1 HPLC superimposed fingerprint of 10 batches of samples

圖2 樣品高效液相色譜對照指紋圖譜Fig.2 HPLC reference fingerprint of samples

2.3.3 主要特征峰歸屬

取2.2 項下混合對照品溶液適量，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖（見圖3）。與指紋圖譜各主要共有峰進行對比，確認出其中6 個共有成分，分別為綠原酸（3 號峰）、咖啡酸（4 號峰）、夏佛塔苷（11 號峰）、異夏佛塔苷（14號峰）、芒果苷（15號峰）、馬錢苷（16號峰），選擇保留時間居中、色譜峰響應最大的11 號夏佛塔苷色譜峰為參照峰。

圖3 混合對照品高效液相色譜圖3.Chlorogenic acid 4.Caffeic acid 11.Schaftoside 14.Isoschaftoside 15.Mangiferin 16.LoganinFig.3 HPLC chromatograms of mixed reference

2.4 多指標成分含量測定

2.4.1 方法學考察

系統適用性試驗：取2.2項下各溶液適量，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果供試品溶液色譜中，在與混合對照品溶液色譜相應保留時間處有色譜峰，6個待測成分與相鄰峰的分離度均大于1.5，理論板數均不低于4 000。詳見圖3、圖4。

圖4 供試品和陰性對照品高效液相色譜圖3.Chlorogenic acid 4.Caffeic acid 11.Schaftoside 14.Isoschaftoside 15.Mangiferin 16.LoganinA.Test solution B.Negative reference solution lacking Desmodii Styracifolii Herba C.Negative reference solution lacking Pyrrosiae Folium D.Negative reference solution lacking Lonicerae Japonicae CaulisFig.4 HPLC chromatograms of test sample and negative reference

線性關系考察：分別精密吸取2.2項下混合對照品貯備液0.5，1.0，2.0，5.0，7.0，10.0 mL，置同一25 mL容量瓶中，加70%甲醇稀釋，定容，得系列混合對照品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸。結果見表1。

表1 線性關系考察結果（n=6）Tab.1 Results of the linear relation test（n = 6）

精密度試驗：吸取2.2 項下混合對照品溶液適量，按2.1 項下色譜條件連續進樣測定6 次，記錄峰面積。結果夏佛塔苷、異夏佛塔苷、綠原酸、咖啡酸、馬錢苷和芒果苷峰面積的RSD分別0.95%，1.13%，0.82%，1.24%，1.06%，1.31%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取同一份供試品溶液（編號S6）適量，分別于室溫下放置0，5，10，15，20，24 h時按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果6 種待測成分峰面積的RSD分別為0.77%，1.06%，0.92%，0.84%，1.17%，0.95%（n= 6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內基本穩定。

重復性試驗：取樣品（編號S6）適量，按2.2 項下方法平行制備6 份供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算待測成分含量。結果6種待測成分平均含量分別為1.636，0.594 7，1.159，0.301 7，0.608 4，0.609 2 mg/ g，RSD分別為0.75%，0.87%，0.95%，1.21%，1.33%，0.85%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（編號S6）6 份，每份約0.5 g，精密稱定，精密加入混合對照品溶液（分別含6 種成分0.281 9，0.102 2，0.200 3，0.054 3，0.108 9，0.107 1 mg/mL）3.0 mL，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率。結果見表2。

表2 加樣回收試驗結果（n=6）Tab.2 Results of the recovery test（n = 6）

2.4.2 樣品含量測定

取10 批樣品各適量，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，采用外標法計算含量。結果見表3。

表3 樣品含量測定結果（mg/g，n=3）Tab.3 Results of the content determination of six components in samples（mg / g，n = 3）

2.5 復方石淋通片質量分析

CA：以21 個共有峰的峰面積為變量，導入SPSS 24.0 統計學軟件進行CA。結果歐式平方距離為10 時，10批樣品可聚為3類，S1-S3為第Ⅰ類，S4-S7為第Ⅱ類，S8-S10為第Ⅲ類。詳見圖5。

圖5 聚類分析圖Fig.5 Results of cluster analysis

PCA：將表3 中的樣品含量測定數據導入SPSS 24.0 統計學軟件進行PCA。結果見表4、表5 和圖6。由表4 可知，前3 個主成分的特征值均大于1，累積方差貢獻率為77.864%（＞70%），表明提取前3 個主成分即可評價樣品質量。由表5可知，夏佛塔苷、異夏佛塔苷和綠原酸對第一主成分，馬錢苷和芒果苷對第二主成分，咖啡酸對第三主成分的影響較大。

表4 特征值和方差貢獻率Tab.4 Eigenvalue and variance contribution rates

表5 復方石淋通片中6種成分含量測定的相關性分析Tab.5 Correlation analysis of content determination of six components in Compound Shilintong Tablets

圖6 主成分分析碎石圖Fig.6 Scree plot of principal component analysis

3 討論

復方石淋通片中廣金錢草、石韋均含有黃酮、酚酸等多類成分，是發揮利尿護腎、抑菌、預防草酸鈣結石形成的主要藥效成分。其中，廣金錢草的有效成分為夏佛塔苷、異夏佛塔苷及綠原酸［9］，石韋中主要有芒果苷、綠原酸［10］。忍冬藤具有抗炎、增強免疫力及防治結石的功效，特征成分環烯醚萜苷類（馬錢苷）和有機酸（綠原酸、咖啡酸）［11］在HPLC圖譜中清晰可分辨。海金沙及礦物藥滑石粉用量較少，在該色譜條件下未發現特征成分峰。廣金錢草、石韋、忍冬藤均含有綠原酸。故將夏佛塔苷、異夏佛塔苷、綠原酸、咖啡酸、馬錢苷、芒果苷作為復方石淋通片的含量測定指標。

預試驗中采用二極管陣列檢測器進行全波長（200～400 nm）掃描，發現復方石淋通片中不同成分最大吸收波長差異較大，故為有效區分成分選擇了3個波長，并采用波長切換法。在優化梯度洗脫條件時，考察了乙腈-水、甲醇-水作為流動相梯度洗脫的效果，結果色譜圖中未能同時檢測到6 個目標成分，同時綠原酸、咖啡酸均為有機酸，水相易電離，峰形拖尾嚴重；流動相中加入磷酸，可抑制其電離且峰形及分離度均較好。遂對磷酸溶液的體積分數不斷優化，最終確定采用本研究中確定的流動相。

綜上所述，本研究中建立了復方石淋通片HPLC 指紋圖譜，通過對主要藥效成分夏佛塔苷、異夏佛塔苷、綠原酸、咖啡酸、馬錢苷、芒果苷含量的同時測定，建立了該制劑的多指標成分質量控制模式，同時采用CA，PCA 等化學計量學方法對10批復方石淋通片樣品質量進行了綜合評價。所建立的方法結果準確、重復性好，可用于復方石淋通片的質量評價。