超高效液相色譜串聯(lián)線性離子阱質(zhì)譜法檢測減肥類產(chǎn)品中N-丁基-3-（三氟甲基）-α-甲基苯乙胺*

方 韻，賈昌平，張 萍，張 斌△

（1. 江蘇省蘇州市藥品檢驗檢測研究中心，江蘇 蘇州 215000； 2. 安徽省蕪湖市食品藥品檢驗中心，安徽 蕪湖 241006）

隨著社會的發(fā)展，越來越多的人關(guān)注健康，減肥類產(chǎn)品也愈加受關(guān)注［1-2］，但其中非法添加藥物成分的情況也較常見。目前，市場上減肥類中成藥及（保健）食品中添加的違禁成分主要有芬氟拉明、西布曲明等［3-4］。芬氟拉明化學名為N-乙基-α-甲基-3-三氟甲基苯乙胺，屬苯丙胺類食欲抑制劑［5］，不合理使用可能引起心臟瓣膜疾病、神經(jīng)系統(tǒng)損傷、急性腎衰竭等［4，6-7］。國家法定檢驗標準（如《國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品檢驗補充檢驗方法和檢驗項目》）均已收載芬氟拉明的檢測方法，并列為禁用成分。N- 丁基- 3 -（三氟甲基）-α- 甲基苯乙胺（C14H20F3N）為芬氟拉明的修飾物，也需防止其出現(xiàn)在減肥類產(chǎn)品中。目前尚未見常用方法［8-11］檢測N-丁基-3-（三氟甲基）-α-甲基苯乙胺的報道。鑒于此，本課題組擬建立超高效液相色譜串聯(lián)線性離子阱質(zhì)譜法檢測減肥類產(chǎn)品中非法添加的該成分，以為相關(guān)產(chǎn)品的監(jiān)管提供技術(shù)支撐。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC - 30A 型超高效液相色譜儀，含二極管陣列檢測器（日本Shimadzu 公司）；ABSCIEX QTRAP?6500 +線性離子阱質(zhì)譜儀（美國AB SCIEX 公司）；KQ - 300 DA 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Milli-Q 純水系統(tǒng)（美國Millipore 公司）；XS205DU 型電子天平（梅特勒-托利多儀器＜上海＞有限公司，精度為0.1 mg）。

1.2 試藥

N-丁基-3-（三氟甲基）-α-甲基苯乙胺對照品（加拿大TRC 公司，批號為5 - TJS - 159 - 2，含量100%）；甲醇和甲酸均為質(zhì)譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。減肥類產(chǎn)品樣品（10 批，包括中成藥2 批，保健食品7 批，食品1 批，均為蘇州市藥品檢驗檢測研究中心抽樣所得，批號依次為170518，不詳，170602，不詳，181102，不詳，20210502，19079890，150402，171029，記為樣品A-J）。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗條件

色譜條件：色譜柱為Waters ACQUITY UPLC?HSS T3柱（100 mm×2.1 mm，1.8μm）；流動相為0.1%甲酸溶液（A）-0.1%甲酸水溶液-甲醇（B），梯度洗脫（0～1 min 時30%B，10～10.2 min 時75%B →95%B，12～12.2 min時95%B →30%B）；流速為0.3 mL/min；檢測波長為215 nm；柱溫為30 ℃；進樣量為1μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧電離離子源、正離子模式（ESI+）；脫溶劑氣為氮氣（N2）；去溶劑氣溫度為550 ℃；監(jiān)測模式為正離子模式；離子化電壓為5 500 V；噴霧氣壓力（Gas1）為55 psi；輔助加熱氣壓力（Gas2）為55 psi；多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）、二級質(zhì)譜（MS2）采集模式；氣簾氣壓25 psi；碰撞氣為Medium。化合物離子對參數(shù)：母離子m/z260.2，去簇電壓60 V，MRM 離子對m/z260.2/187.1及260.2/159.1（定量離子對），碰撞電壓20，25，30 V，MS2碎片m/z187.1，159.1，109.1，74.1，57.2。

2.2 溶液制備

取N- 丁基- 3 -（三氟甲基）-α- 甲基苯乙胺對照品約10 mg，精密稱定，置100 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并定容，配成質(zhì)量濃度約為100 μg / mL 的對照品貯備液；取適量，用甲醇逐級稀釋，配成質(zhì)量濃度約為10 ng / mL 的對照品溶液。取一次服用量的樣品，精密稱定，置100 mL 容量瓶中，加甲醇70 mL，渦旋1 min，室溫水浴超聲（功率300 W，頻率40 kHz）提取30 min，放冷至室溫，加甲醇定容，混勻，13 000 r/ min離心5 min，取上清液，即得陽性、陰性供試品溶液。以甲醇為空白對照品。

2.3 質(zhì)譜行為分析

取2.2 項下對照品溶液及供試品溶液，采用超高效液相色譜串聯(lián)線性離子阱質(zhì)譜法進行定性篩查，按2.1 項下試驗條件進樣測定，采集空白對照品、供試品和對照品色譜圖，如出現(xiàn)與對照品保留時間一致的色譜峰，且紫外吸收光譜均一致，其質(zhì)譜一級母離子和二級主要子離子質(zhì)量數(shù)均相同，主要子離子的相對豐度比接近（相對離子豐度≤10%，＞10%～20%，＞20%～50%，＞50%時，允許的最大偏差分別為± 50%，±30%，±25%，±20%）。以上要求若同時滿足，則確定樣品中添加了N-丁基-3-（三氟甲基）-α-甲基苯乙胺，利用MRM 模式建立標準曲線進行含量測定；任意一條不滿足，則確定未添加N- 丁基- 3 -（三氟甲基）-α-甲基苯乙胺。

2.4 方法學考察

系統(tǒng)適用性試驗及專屬性試驗：取2.2 項下對照品溶液、陽性供試品溶液、空白對照品溶液各適量，按2.1 項下試驗條件進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果陽性供試品溶液色譜圖中，與對照品溶液色譜中各成分峰保留時間一致，峰形良好，且空白對照無干擾。詳見圖1、圖2。

圖1 超高效液相色譜圖1.N -｛1 -［3 -（Trifluoromethyl）phenyl］- 2 - propanyl｝- 1 - butanamineA.Reference solution B.Positive test solution C.Negative test solutionFig.1 UPLC chromatograms

圖2 MRM色譜圖（m/z 260.2/187.1）1.N -｛1 -［3 -（Trifluoromethyl）phenyl］- 2 - propanyl｝- 1 - butanamineA.Reference solution B.Positive test solution C.Negative test solutionFig.2 MRM chromatograms（m / z 260.2 / 187.1）

線性關(guān)系考察：精密吸取2.2 項下的對照品貯備液適量，加甲醇稀釋，配制成質(zhì)量濃度分別為0.1，0.5，1.0，5.0，10.0，50.0 ng / mL 的系列對照品溶液，按2.1 項下試驗條件進樣測定，采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)，以質(zhì)量濃度（X，ng / mL）為橫坐標、MRM 定量離子對峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y= 933 619X+ 108 875（r= 1.000 0，n= 6）。結(jié)果顯示，N- 丁基- 3 -（三氟甲基）-α- 甲基苯乙胺質(zhì)量濃度在0.1～50 ng / mL 范圍內(nèi)與定量離子對峰面積線性關(guān)系良好。

檢測限與定量限考察：精密吸取對照品溶液適量，用甲醇溶液稀釋10 倍后按2.1 項下試驗條件進樣測定，以信噪比為3 和10 時對應(yīng)的質(zhì)量濃度為檢測限和定量限，結(jié)果分別為0.40 ng/g和1.20 ng/g。

精密度試驗：取對照品溶液適量，按2.1 項下試驗條件連續(xù)進樣測定6 次，記錄質(zhì)譜數(shù)據(jù)，計算待測成分的色譜保留時間和定量離子對峰面積。結(jié)果的RSD分別為0.12%和0.80%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取對照品溶液適量，置自動進樣器中（15 ℃），分別于0，2，4，8，12，24 h 時按2.1 項下試驗條件進樣測定，記錄質(zhì)譜數(shù)據(jù)計算定量離子對的峰面積。結(jié)果的RSD為2.26%（n= 6），表明對照品溶液15 ℃下放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗：取陽性樣品（樣品C）1 粒，共6 份，按2.2 項下方法制備陽性供試品溶液，按2.1 項下試驗條件進樣測定，記錄質(zhì)譜數(shù)據(jù)，計算待測成分的母離子峰面積。結(jié)果的RSD為2.80%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：取陰性樣品（樣品J）1粒，置100 mL 容量瓶中，加入對照品貯備液（稀釋成100 ng/ mL）1，5，10 mL，各平行3 份，再加甲醇70 mL，按2.2 項下方法制備陰性供試品溶液，按2.1 項下試驗條件進樣測定，記錄質(zhì)譜數(shù)據(jù)，計算離子對峰面積，并計算加樣回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗結(jié)果（n=9）Tab.1 Results of the recovery test（n = 9）

2.5 樣品含量測定

取10 批樣品各適量，按2.2 項下方法制備供試品溶液（均平行2 份），與對照品溶液按2.1 項下試驗條件進樣測定。結(jié)果1 批樣品（樣品C）供試品溶液色譜中，在與對照品溶液中N-丁基-3-（三氟甲基）-α-甲基苯乙胺峰保留時間一致處對應(yīng)的總離子流（TIC）圖、MRM圖、MS2碎片均一致，且二級主要碎片的豐度比滿足規(guī)定（見圖3至圖5）。最終確定了樣品C中含有N-丁基-3-（三氟甲基）-α-甲基苯乙胺，含量為41.6 mg/g。

圖3 總離子流色譜圖1.N -｛1 -［3 -（Trifluoromethyl）phenyl］- 2 - propanyl｝- 1 -butanamineA.Reference solution B.Positive test solutionFig.3 Total ion chromatograms

圖4 MS2質(zhì)譜圖（CE：20 V）A.Reference solution B.Positive test solutionFig.4 MS2 spectra（CE：20 V）

圖5 MS2質(zhì)譜圖（CE：30 V）A.Reference solution B.Positive test solutionFig.5 MS2 spectra（CE：30 V）

3 討論

3.1 研究背景

隨著社會的發(fā)展，以及人們對自身健康的關(guān)注度越來越高，減肥類中成藥及保健食品中非法添加物質(zhì)層出不窮，且越來越隱秘。本研究中的檢出物與現(xiàn)行檢驗標準（BJS 201701）中收錄的西布曲明、N-單去甲基西布曲明、N，N-雙去甲基西布曲明取代基均僅有微小差異。其次，本研究中同時檢出有一定減肥作用的O-雙去乙酰基比沙可啶、普萘洛爾、利多卡因［12-14］。N-丁基-3-（三氟甲基）-α-甲基苯乙胺和芬氟拉明的骨架相同，差異在于側(cè)鏈取代基由乙基換成了丁基，又在減肥保健食品中發(fā)現(xiàn)，推測新檢出的化合物可能是一種新的非法添加物，且尚無明確的檢測手段，可能成為不法分子逃避監(jiān)管的新手段，亟須新的檢測方法填補漏洞。否則，隨著該物質(zhì)的使用增多，不僅會影響人民健康，還會對目前的監(jiān)管質(zhì)量造成沖擊。

3.2 流動相選擇和優(yōu)化

預(yù)試驗中考察了甲醇、乙腈作為有機相時化合物的色譜分離及質(zhì)譜響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)待測物質(zhì)譜響應(yīng)良好，有機相的變化影響較小。由于使用乙腈時液相系統(tǒng)單向閥易造成黏連，故選擇甲醇作為有機相。另外，還考察了甲酸、乙酸作為流動相添加劑對檢測的影響，結(jié)果變化不大，所以選擇0.1%甲酸溶液。

3.3 質(zhì)譜條件選擇

本研究中采用的相關(guān)質(zhì)譜儀器，可在實施MRM 模式的同時，采集化合物的二級質(zhì)譜，增加了定性的準確度。并可采用單因素試驗優(yōu)化去溶劑氣溫度、離子化電壓、噴霧氣壓力、輔助加熱器壓力、去簇電壓、碰撞電壓等質(zhì)譜條件參數(shù)，以使質(zhì)譜信號最佳。

3.4 方法評價

本研究中建立了定性、定量檢測新的非法添加物N-丁基-3-（三氟甲基）-α-甲基苯乙胺的超高效液相色譜串聯(lián)線性離子阱質(zhì)譜法。通過比對色譜峰保留時間、一級質(zhì)譜母離子、二級主要碎片離子進行定性確證，同時采用MRM模式建立外標法測定含量，可實現(xiàn)準確、快速、靈敏地完成樣品的檢測。但要注意，本方法采用的儀器靈敏度高，而造假樣品中添加物的含量大，因此，樣品前處理時需適當增加樣品稀釋倍數(shù)，避免儀器污染。此外，該方法雖然用的是離子阱質(zhì)譜，但與普通的四極桿質(zhì)譜儀基本原理相同，后期監(jiān)管檢測中若用到本試驗中所建立的方法，微調(diào)分析參數(shù)，即可使用。