MyD88L265P及CD79B基因突變對(duì)原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤預(yù)后的影響

蔣皓云，金祺祺，張麗田，李翠翠，岳寧寧，吳重陽(yáng)

蘭州大學(xué)第二醫(yī)院血液科，甘肅蘭州 730030

原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤(primary central nervous system lymphoma，PCNSL)是一種罕見的侵襲性結(jié)外非霍奇金淋巴瘤，病變局限于腦、脊髓、軟腦膜或眼[1‐2]。由于化療藥物難以有效通過血腦屏障，PCNSL 患者治療效果不佳，且復(fù)發(fā)率高、預(yù)后差[3‐5]。目前PCNSL診斷的金標(biāo)準(zhǔn)仍為組織活檢，聯(lián)合特異性基因突變及腦脊液特征性細(xì)胞因子檢測(cè)可提高診斷的敏感度[6]。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，MyD88L265P、CD79B基 因 為PCNSL 熱點(diǎn) 突 變[7‐10]，對(duì)PCNSL 的診斷、預(yù)后及靶向治療具有潛在臨床價(jià)值。本研究檢測(cè)18 例PCNSL 患者腫瘤組織中MyD88L265P、CD79B的突變頻率，并回顧性分析其與PCNSL 患者預(yù)后的相關(guān)性，旨在為PCNSL 的臨床診治提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2018年8月－2020年11月在蘭州大學(xué)第二醫(yī)院診治的18例PCNSL患者作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)依據(jù)2016 年世界衛(wèi)生組織(WHO)造血和淋巴組織腫瘤分類的診斷標(biāo)準(zhǔn)診斷為PCNSL，且初診時(shí)均有明確的病理學(xué)診斷證據(jù)；(2)臨床檢驗(yàn)及病理資料完整；(3)免疫功能正常(無HIV感染史、無免疫抑制藥服用病史)；(4)接受以利妥昔單抗(Rituximab，R)、氨甲蝶呤(methotrexate，M)、替莫唑胺(temozolomide，T)/脂質(zhì)體多柔比星(dorubicin liposomes，D)/阿 糖 胞 苷(cytarabine，A)(R 375 mg/m2d0 ivgtt， M 3.0～3.5 mg/m2d1 ivgtt，T 200 mg/m2d1～d5 po，D 50 mg/m2ivgtt，A 2.0 mg/m2q12 d2～d3 ivgtt)為基礎(chǔ)治療方案，依照患者病情采用上述治療方案。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)系統(tǒng)性彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B‐cell lymphoma，DLBCL)中樞浸潤(rùn)；(2)既往存在其他惡性腫瘤病史；(3)存在精神性疾病。

1.2 方法 收集PCNSL患者的臨床病例資料，并對(duì)其臨床指標(biāo)及腫瘤組織中MyD88L265P、CD79B的突變頻率與預(yù)后的相關(guān)性進(jìn)行回顧性分析。患者生存分析采用Kaplan‐Meier 法。

1.2.1 免疫組化及結(jié)果判定 腫瘤組織標(biāo)本經(jīng)開顱手術(shù)或立體定位活檢術(shù)獲取，經(jīng)常規(guī)組織包埋、切片和染色，并采用Envision二步法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。本研究所使用的一抗包括：抗CD20、CD79a、CD10、CD23、BCL2、BCL6、MUM1、cyclin D1 及Ki67 抗體(福州邁新公司)。所有免疫組織化學(xué)染色結(jié)果均由蘭州大學(xué)第二醫(yī)院兩名具有高級(jí)職稱的病理科醫(yī)師判定為陽(yáng)性或陰性。

1.2.2MYD88L265P及CD79B基因突變檢測(cè) 分析存檔的5～10 μm厚的4%多聚甲醛溶液固定、石蠟包埋腦活檢切片，分別采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、一代基因測(cè)序技術(shù)對(duì)MyD88L265P及CD79B突變進(jìn)行全外顯子檢測(cè)。采用ABI7500 熒光定量?jī)x(美國(guó)賽默飛世爾科技公司)檢測(cè)MyD88L265P突變，PCR 正義引物5'‐GGGGATGGCTGTTGTTAA‐3'，反義引物5'‐GC‐AGGGGTTGGTGTAGTC‐3'。采用一代基因測(cè)序技術(shù)檢測(cè)CD79B突變，采用的PCR 擴(kuò)增引物序列見表1。PCR 產(chǎn)物經(jīng)15%瓊脂糖凝膠電泳，產(chǎn)物純化，并用ABI 3730XL測(cè)序儀(美國(guó)ABI)測(cè)序。

表1 PCR法擴(kuò)增 CD79B基因采用的引物序列Tab.1 Primer sequences for PCR amplification of CD79B

1.2.3 隨訪 患者無進(jìn)展生存期(progression‐free survival，PFS)定義為初次診斷至疾病進(jìn)展、死亡或最后一次隨訪的時(shí)間；總生存期(overall survival，OS)定義為初次診斷至死亡或最后一次隨訪的時(shí)間；隨訪時(shí)間截至2022 年3 月31 日。生存時(shí)間以“月”為單位計(jì)算，中位隨訪時(shí)間為24.5(16～43)個(gè)月。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以例(%)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。Kaplan‐Meier 生存曲線之間的差異采用雙尾Log‐rank檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 臨床資料 本組18 例PCNSL 患者發(fā)病年齡為52.0(29.0～64.0)歲，其中≥50 歲13 例(占72.2%)。9 例為單發(fā)腫瘤，9例為多發(fā)腫瘤，其中8例深部腦組織受累(胼胝體、基底節(jié)、腦干或小腦)。18 例組織學(xué)分型均為DLBCL；按細(xì)胞來源分型，8 例為生發(fā)中心來源(germinal center B‐cell，GCB)，10例為非GCB。臨床表現(xiàn)多樣，10例(占55.6%)以頭痛、頭暈為首發(fā)癥狀，肢體無力11 例(占61.1%)，視物模糊6 例(占33.3%)，意識(shí)障礙2例(占11.1%)，言語(yǔ)功能障礙4例(占22.2%)。除1 例兩個(gè)療程治療無效死亡，其余17例均接受至少6個(gè)療程化療；患者在第4療程后接受療效評(píng)估，5 例完全緩解(complete response，CR)，4 例 部 分 緩 解(partial response，PR)，8 例 疾 病 進(jìn) 展(progressive disease，PD)。截 至2022 年3 月31 日，4例死亡(表2)。

表2 18例原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤的臨床資料Tab.2 Clinical data of 18 patients with primary central nervous system lymphoma

2.2MyD88L265P及CD79B基因突變分析 熒光定量PCR 和一代基因測(cè)序技術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，18 例PCNSL 組 織MyD88L265P突 變 率 為38.9%(7/18)；CD79B突變率為33.3%(6/18)，其中3 例檢測(cè)到CD79BY196突變(分別為CD79BY196F、CD79BY196C及CD79BY196S)，另外3例CD79B突變分別為CD79BF172 V、CD79B E197G、CD79B N37H突變；MyD88L265P/CD79B共突變率為27.8%(5/18)，其中CD79B突變位點(diǎn)均不相同， 分別為MyD88L265P/CD79BY196F、MyD88L265P/CD79BY196C、MyD88L265P/CD79BY196S、MyD88L265P/CD79BF172V、MyD88L265P/CD79B N37H。

2.3 PCNSL預(yù)后相關(guān)影響因素的單因素分析 病灶數(shù)量、病灶深部受累及腫瘤組織CD79B突變的PCNSL 患者中位無進(jìn)展生存期(median PFS，mPFS)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，表3)。Kaplan‐Meier 生存曲線顯示，與病灶單發(fā)患者比較，病灶多發(fā)患者mPFS 更 短(3 個(gè) 月vs.未 達(dá) 到，P＜0.05，HR=0.226，95%CI 0.046～1.107)，兩 者OS 差 異 無 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 意 義(P＞0.05，圖1)；與非深部受累患者比較，病灶深部受 累 患 者mPFS 更 短(3 個(gè) 月vs.未 達(dá) 到，P＜0.05，HR=0.223，95%CI 0.054～0.919)，OS 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，圖1)；與野生型患者比較，腫瘤組織中檢測(cè)到MyD88L265P突變型患者的mPFS 和OS 差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；與野生型患者比較，腫瘤組織中檢測(cè)到CD79B突變型患者的mPFS 更短(3 個(gè)月vs.未 達(dá) 到，P＜0.05，HR=0.249，95%CI 0.065～0.952)，OS差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，圖1)。

圖1 18例PCNSL患者的病灶數(shù)量、病灶深部受累、腫瘤組織CD79B突變與PFS、OS的關(guān)系Fig.1 Effects of number of lesions, deep involvement of the lesion, and CD79B mutation in the tumor on PFS and OS in 18 patients with PCNSL

表3 18例PCNSL 患者PFS的相關(guān)影響因素Tab.3 Related influencing factors to PFS of 18 patients with PCNSL

2.4 PCNSL 患者PFS 影響因素的Cox 回歸分析結(jié)果 將單因素分析中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的影響因素納入Cox 回歸分析，結(jié)果顯示，病灶深部受累(HR=0.135，95%CI 0.023～0.799，P＜0.05)、腫瘤組織CD79B突變(HR=0.149，95%CI 0.028～0.800，P＜0.05)是PCNSL 患者疾病進(jìn)展預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(表4)。

2.5MyD88L265P及CD79B基因突變對(duì)治療反應(yīng)的影響 7 例MyD88L265P基因突變患者的客觀緩解率(objective response rate，ORR)為42.9%(3/7)；6例CD79B基因突變患者ORR為33.3%(2/6)。伴發(fā)上述兩種基因突變的患者中，治療有效者與無效者的mPFS差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.019、P=0.044)，而中位總生存期(mOS)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(表5)。

表5 MyD88L265P 及CD79B 基因突變對(duì)13 例PCNSL 患者治療反應(yīng)的影響Tab.5 Effects of the mutations of MyD88L265P and CD79B on therapeutic response in 13 patients with PCNSL

3 討 論

PCNSL 是一種罕見的累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的非霍奇金淋巴瘤，多繼發(fā)于免疫功能缺陷患者，但近年來在免疫功能正常患者中的發(fā)病率也逐漸升高。PCNSL 疾病進(jìn)展迅速，早期診斷困難，疾病預(yù)后較差。PCNSL 診斷的金標(biāo)準(zhǔn)仍為接受立體定向活檢術(shù)或開顱手術(shù)，行病理學(xué)及免疫抗原檢測(cè)確診，但手術(shù)活檢可能存在嚴(yán)重并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)及活檢無法觸及的病變部位等手術(shù)禁忌。目前病損切除的預(yù)后意義尚存在爭(zhēng)議。對(duì)于不能活檢的患者，可行腦脊液檢查，但其敏感度較低，尚無可替代活檢的細(xì)胞因子或其他標(biāo)志物。90%以上的PCNSL 病理表現(xiàn)為DLBCL，其中以非GCB亞型多見[11]。本研究中18例PCNSL 病理表現(xiàn)均為DLBCL，其中56%的患者為非GCB亞型。既往研究發(fā)現(xiàn)，非GCB亞型PCNSL預(yù)后較GCB 亞型差[11]；本研究中非GCB 亞型的mPFS 與GCB 亞型差異不明顯，與既往研究結(jié)果不一致，可能與樣本量較小有關(guān)。

國(guó)際結(jié)外淋巴瘤研究組織(International Extranodal Lymphoma Study Group，IELSG)提出的PCNSL 預(yù)后評(píng)分系統(tǒng)，共納入年齡、ECOG 評(píng)分、乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)水平、腦脊液蛋白水平、病灶累及腦深部(腦室旁、基底節(jié)、腦干、小腦)5個(gè)危險(xiǎn)因素，目前已在臨床廣泛應(yīng)用。本研究18 例PCNSL 初診評(píng)估56%出現(xiàn)深部腦組織受累，腦組織深部受累者mPFS明顯短于非深部受累者，且Cox回歸分析結(jié)果顯示腦組織深部受累是預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，與IELSG 評(píng)分系統(tǒng)一致。但本研究中PCNSL 患者年齡、ECOG 評(píng)分、LDH 水平與預(yù)后的相關(guān)性不明顯，可能與樣本量小、隨訪時(shí)間短有關(guān)。本研究因部分患者顱內(nèi)高壓未行腰穿或拒絕腰穿，未收集到全部病例的腦脊液相關(guān)數(shù)據(jù)，未進(jìn)一步行腦脊液分析。本研究中，初診時(shí)PCNSL腫瘤多發(fā)者的mPFS 明顯短于單發(fā)者(3個(gè)月vs.未達(dá)到)；患者性別及免疫組化BCL2、BCL6、MUM1 是否陽(yáng)性表達(dá)與預(yù)后的相關(guān)性不明顯，可能與樣本量較小、隨訪時(shí)間較短有關(guān)，有待擴(kuò)大樣本量及延長(zhǎng)隨訪時(shí)間進(jìn)一步觀察。

PCNSL 高度依賴于慢性活化的 BCR 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，其 特 點(diǎn) 是MyD88和CD79B基 因 頻 繁 突 變[12‐13]。MyD88 是一種重要的銜接蛋白，屬于Toll 樣受體(Toll‐like receptors，TLR)/白 細(xì) 胞 介 素(interleukin，IL)‐1R家族，可介導(dǎo)多種細(xì)胞因子受體和TLR、JAK‐STAT、核因子κB(nuclear factor kappa‐B，NF‐κB)等通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，上述信號(hào)通路的失調(diào)誘導(dǎo)激活NF‐κB 復(fù)合物[14]，從而促進(jìn)腫瘤免疫逃逸、腫瘤發(fā)生和進(jìn)展，因此，抑制MyD88蛋白活化是一種潛在的治療途徑。PCNSL 中影響MyD88基因TIR 結(jié)構(gòu)域90%的突變是MyD88L265P[7]。MyD88L265P在其他血液腫瘤中少見[15]，是PCNSL 較好的分子標(biāo)志，多項(xiàng)研究認(rèn)為腦脊液MyD88L265P檢測(cè)是一種潛在的微創(chuàng)診 斷 方 法[6,16‐17]。本 研 究 中PCNSL 腫 瘤 組 織 中MyD88L265P突變率為38.9% (7/18)，與其他研究報(bào)道 的 突 變 率(33%～87%) 一 致[18‐20]； 在 檢 測(cè) 到MyD88L265P突變的7 例中，除1 例在2 個(gè)療程免疫化療病灶進(jìn)展死亡外，其余6例均接受至少6個(gè)療程免疫化療；7例的ORR為42.9%(3/7)；治療有效患者的mPFS明顯長(zhǎng)于無效患者(32個(gè)月vs.2個(gè)月)，但中位生存期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(32個(gè)月vs.17個(gè)月)。既往對(duì)于PCNSL中MyD88L265P突變的意義存在爭(zhēng)議，本研究結(jié)果顯示腫瘤組織MyD88L265P突變與患者PFS相關(guān)不明顯，提示PCNSL 的生物學(xué)異質(zhì)性。

已報(bào)道的PCNSL 中CD79B突變率為6.7%～83.0%[10,21]，且大多數(shù)CD79B突變集中在Y196周圍的免疫受體酪氨酸激活基序(ITAM)區(qū)域[22‐23]。本研究在33.3%(6/18)PCNSL 患者中檢測(cè)到CD79B突變，其中3 例為CD79BY196突變，其他3 例分別為CD79B F172V、CD79B E197G、CD79B N37H突變，這在以往有關(guān)PCNSL 的基因突變類型中少有報(bào)道，提示CD79B突變的復(fù)雜性。本研究結(jié)果顯示，PCNSL 腫瘤組織CD79B突變與患者 PFS 相關(guān)，且為預(yù)后不良的獨(dú)立因素；在檢測(cè)到CD79B突變6 例的ORR 為33.3%(2/6)，其中5例接受了至少6個(gè)療程免疫化療；治療無效者的mPFS 明顯短于治療有效者(2 個(gè)月vs.30 個(gè)月)，但中位生存期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(17 個(gè)月vs.30個(gè)月)。

本研究MyD88L265P/CD79B共突變5例PCNSL患者的ORR為20%(1/5)，其中4例接受了至少6個(gè)療程免疫化療；治療有效者的mPFS、mOS與無效者比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(40個(gè)月vs.2個(gè)月，40個(gè)月vs.17個(gè)月)。單因素分析顯示，MyD88L265P/CD79B共突變與PFS 相關(guān)不明顯，但5 例中，3 例CD79BY196突變的患者均發(fā)生疾病進(jìn)展，因此，MyD88L265P/CD79BY196共突變是否與PCNSL 的不良預(yù)后相關(guān)，仍需進(jìn)一步臨床驗(yàn)證。雖然MyD88L265P、CD79B常被認(rèn)為與NF‐κB 通路相關(guān)，但這兩種分子均與其他通路有廣泛交聯(lián)，對(duì)PCNSL 預(yù)后的影響及作用機(jī)制可能還與下游信號(hào)分子的效應(yīng)總和相關(guān)。

本研究中所有PCNSL均以R‐MTX 為基礎(chǔ)方案進(jìn)行治療，初始治療方案中不包含放療。18 例中，16例(88.9%)接受單純免疫化療，2例(例5、例13)因病灶進(jìn)展輔以放療，這2 例腫瘤組織中均未檢測(cè)到MyD88L265P、CD79B突變。促進(jìn)PCNSL患者疾病進(jìn)展、影響預(yù)后的因素較多，本研究的缺陷之一是僅對(duì)初診時(shí)腫瘤組織中MyD88L265P、CD79B突變狀態(tài)進(jìn)行生存分析，因不同患者疾病狀態(tài)、顱內(nèi)壓等條件的變化，未能檢測(cè)初診時(shí)腦脊液MyD88L265P、CD79B突變加以對(duì)照，也未能在病程中或疾病進(jìn)展時(shí)再次取腫瘤組織或收集腦脊液動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)基因突變，疾病進(jìn)展是否與這兩種基因的克隆演變相關(guān)尚需進(jìn)一步觀察。

總之，PCNSL 是一種罕見的淋巴瘤，具有侵襲性高、預(yù)后差等特點(diǎn)，MyD88L265P、CD79B在腫瘤組織中的高突變率可為PCNSL的靶向治療提供更有利的依據(jù)；腫瘤組織CD79B突變可能是PCNSL的不良預(yù)后因素。鑒于本研究樣本量較小和隨訪時(shí)間較短，未來應(yīng)進(jìn)一步行多中心、大樣本量研究以驗(yàn)證MyD88L265P及CD79B突變對(duì) PCNSL的影響。