精子線粒體膜電位作為綜合評估男性生育能力指標的初探

樊千，常鳳娟，陳赟，孫志興，張星，薛建國

(1.江蘇省中醫院,南京 210029;2.江蘇省中醫院男科生殖實驗室,南京 210029;3.南京中醫藥大學,南京 210046)

2022年中國人口正式步入負增長時代,其中原因之一是長期的低生育率。如今大約14%的夫妻難以受孕,其中男方因素占半數以上[1-2]。一直以來,傳統研究認為男性生育能力與精子濃度、精子前向運動(PR)、精子正常形態密切相關[3];世界衛生組織(WHO)為此專門公布了評價男性精液質量的正常參考值標準。但仍有相當比例的特發性男性不育癥患者精液參數正常,這使得傳統的精液參數檢查并不能準確地反映精子的形態、結構和功能,同時也無法全面地評估男性自然生育潛力[4]。得益于熒光探針檢測技術、流式細胞儀以及電子顯微鏡的發展和應用,臨床和科研已經可以在微觀層面觀察精子細胞內能量代謝的重要部位——線粒體,并能開展反映精子線粒體內三羥酸循環、體現能量代謝狀態的指標精子線粒體膜電位(MMP)研究。雖然精液常規分析和精子形態學檢測仍是判斷男性生育力的基礎,但現有研究已表明精子MMP對男性生育力的評價可能更加全面和高效。目前,國內外對應用精子MMP作為綜合評估男性生育潛力指標的研究較少,因此繪制精子MMP的受試者工作特征曲線(ROC),計算能綜合評估男性生育潛力的截斷值對臨床診斷和治療都有重要意義,本課題組對此進行了初步探索性研究,現報道如下。

資料與方法

一、研究對象

選擇2023年4—7月于江蘇省中醫院男科門診就診并進行孕前優生健康檢查、生育咨詢的已婚男性以及初診的男性不育癥患者作為研究對象。

精液質量正常組納入標準:年齡18～50歲;生殖器及附屬性腺發育正常,性生活正常;精液量>2 ml、pH值7.2～7.8、精子濃度≥15×106/ml、PR≥32%、精子形態正常率≥4%、精子DNA碎片指數(DFI)<30%。精液質量異常組納入標準:病程>1年;PR<32%、精子形態正常率<4%、精子DFI≥30%;就診前未進行過生育方面治療和用藥。

排除標準:男性免疫性不育;內分泌功能異常;生殖器官先天畸形或精子排出障礙所引起的不育;生殖系統感染或因高溫、輻射、油漆等明確因素所引起的死精子癥;近3個月內服用抗癲癇、抗腫瘤等影響精子生成與存活的藥物;合并嚴重心腦血管疾病、血液系統疾病;肝、腎功能不全者。

共納入124例患者。根據不同精液質量分為兩組:精液質量各項指標均正常,即精液量>2 ml、pH值7.2～7.8、精子濃度≥15×106/ml、PR≥32%、精子形態正常率≥4%、DFI<30%為精液質量正常組(n=57)。PR<32%、精子形態正常率<4%、DFI≥30%為精液質量異常組(n=67)。

所有樣本均在征得患者知情同意下進行采集,其使用和處理均按南京中醫藥大學附屬醫院倫理委員會相關管理和監督條例及標準進行,取得倫理委員會審查(2023NL-094-02)同意。

二、主要試劑和儀器

流式細胞儀(ACEA/D2040R,北京安捷倫),計算機輔助精液分析系統(S3-3全自動精子質量分析儀,上海北昂),低速離心機(BY-G16型,河北白洋離心機廠),精子線粒體膜染色試劑盒(FC0711AR,成都賽雷納)和精子核完整性染色試劑盒(FC9711A,成都賽雷納)。

三、研究方法

1.精液常規檢測:精液標本均在禁欲3～7 d手淫法留取,精液樣本置于37℃水浴箱孵育,30 min后記錄液化程度和時間、精液顏色,測量精液體積、pH值。取10 μl液化完全的精液樣本至精子計數板,蓋蓋玻片后靜置1 min,于光學顯微鏡下200倍視野下選擇精子分布均勻的10個小方格分析PR并計算百分率。取10個小方格的總精子個數(N)除以每個樣本所計數總排數(n)的體積乘以稀釋倍數為精子濃度(C),C=(N/n)×(1/20)×稀釋倍數,重復計算后取平均值。

2.精子形態學涂片及染色:用加樣器吸取2～10 ml精液標本滴至載玻片一端5 mm處,采用拉薄技術進行涂片,靜置后經空氣干燥再浸入95%乙醇中固定15 min以上;計數200個精子,分別記錄正常形態精子數目、頭部缺陷、頸部缺陷和尾部缺陷精子數目,并統計精子缺陷總數,根據記錄結果計算精子形態正常率,重復計數200個精子后取平均值,檢測結果經審核后簽發報告。

3.精子DFI檢測:按試劑盒說明書,將液化的精液用37℃緩沖液稀釋精子至1～2×106/ml;將500 μl稀釋過的精子加入到流式細胞儀上樣管中,加入酸化處理緩沖液30 s后加入試劑盒中的染色液;在酸化處理后利用吖啶橙染料與雙鏈DNA結合發綠色或黃色熒光,與單鏈DNA結合發紅色熒光的特性,確定精子DNA碎片化程度;設定流式細胞儀的校準,將檢測管上機,每管樣本至少連續測定兩次,每管樣本至少記錄樣本主群5 000個細胞并使用DFIView軟件統計分析;染色后的精子細胞懸液通過流式細胞儀收集精子的紅綠熒光信號(即FITC與PerCP熒光信號),通過收集到的紅色熒光精子占收集精子總數的比例,判定樣本的DFI。

4.精子MMP檢測:按照精子線粒體膜染色試劑盒說明書,用0.01 mol/L、pH 7.4的PBS洗滌精液標本兩次后,300g離心5 min,棄上清液后PBS重懸沉淀精子,將樣本濃度調至1～2×106個/ml,試劑盒預先置于室溫15 min,調節恒溫水浴箱至37℃,85℃預熱金屬浴,每個樣本準備并標記對照管和檢測管。每管加l00 μl試劑盒中的A液后,加入精子樣本取樣量(μl)=1×108/濃度,將對照管置于金屬浴85℃溫育2 min后取出置于室溫靜置滅活,檢測管置于室溫。后對照管和檢測管分別加入0.4 ml試劑A,再分別加入5 μl試劑B,混勻后均置于37℃水浴箱中,避光恒溫孵育15 min染色。染色40 min內上流式細胞儀,激發波長為488 nm,通過熒光通道FL1(綠)和FL2(紅)檢測橙紅色熒光強度,每個樣本檢測5 000個精子。

四、統計學分析

結 果

一、兩組精液參數比較

兩組間平均年齡、精液量比較均無顯著差異(P>0.05),精液質量正常組精子濃度、PR、精子形態正常率、MMP顯著高于精液質量異常組,DFI顯著低于精液質量異常組(P<0.05)(表1)。

表1 兩組精液參數比較(-±s)

二、MMP與各精液參數相關性比較

Spearman相關性分析結果顯示,MMP與精子濃度(r=0.396,P<0.001)、PR(r=0.471,P<0.001)、精子正常率呈正相關(r=0.468,P<0.001),與DFI(r=-0.701,P<0.001)呈負相關,與精液量無明顯相關性(P>0.05)(表2、圖1)。

圖1 MMP與精液各參數相關性散點圖

表2 MMP與各精液參數相關性比較

三、MMP評估、預測男性生育能力的ROC

為了分析MMP作為評估總精液質量及其各項指標(精子濃度、PR、精子形態正常率、DFI)的評估價值,分別繪制ROC曲線。MMP預測總的精液質量的ROC最大AUC為0.891,截斷值為53.69%;MMP預測精子濃度的AUC為0.787,截斷值為43.97%;MMP預測PR的AUC為0.741,截斷值為56.33%;MMP預測精子形態正常率的AUC為0.733,截斷值為56.63%;MMP預測DFI的AUC為0.809,截斷值為54.78%(圖2,表3)。

圖2 ROC曲線

表3 MMP對男性精液各項指標及生育能力診斷價值

討 論

一、MMP是反映精子線粒體功能的重要指標,采用流式細胞術能高效、便捷地開展大規模臨床檢測

精子在形成、成熟的過程中,大多數線粒體都會隨多余細胞質一同丟失,最終在成熟精子中僅保留22～75個線粒體呈螺旋式排列分布在精子尾部中段形成精子線粒體鞘[5]。精子線粒體是精子運動能量的主要來源,同時也發揮著精子能量代謝、氧自由基生成、三羥酸循環、氧化磷酸化以及多種離子跨膜轉運的重要作用[6]。MMP是精子線粒體內三羥酸循環過程中線粒體內膜基質側泵到內膜外所形成的跨膜電位差[7],能直接反映了精子活力的高低[8]。商學軍等[9]最早在國內開展利用熒光探針羅丹明123(Rhodamine123,Rh123)檢測精子MMP的研究并發現活性氧(ROS)會通過對MMP的影響損傷線粒體功能。夏欣一等[10]采用流式細胞術應用熒光染料5,5′,6,6′-四氯-1,1′,3,3′-四乙基苯并咪唑基-羰化青碘(JC-1)對MMP進行檢測研究,并證實,JC-1相比Rh123是一種的特異性和靈敏性更高的熒光探針,其紅綠熒光強度比率不易受線粒體差異的干擾。得益于流式細胞術的高效、便捷,熒光探針檢測MMP更加適合臨床應用和生殖實驗室開展大樣本量規模性檢測[11]。

二、MMP與精子濃度、PR、精子形態正常率呈顯著正相關,與DFI呈顯著負相關,不僅能體現精子能量代謝狀態更能反映精子凋亡程度

精液常規和精子形態學檢測仍是臨床中評估男性精子質量和預測男性生育潛力的重要手段,但臨床上仍有很多精液參數正常的男性無法生育且原因不明,甚至WHO在第5版指南中下調了相關參數的參考值下限。近年來越來越多的研究支持將精子MMP作為評估和預測男性生育能力的重要新指標。劉宇等[12]論述了精子MMP比精液常規參數更能直接反映男性生育能力,對于臨床上評估男性生育力具有重要意義。Kasai等[13]對原因不明的不育癥男性精液質量研究發現,精子MMP與精子活力呈正相關。該結論也得到了Zhang等[14]的驗證。Sharbatoghli等[15]在ICSI治療中發現,精子MMP與精子活率和精子濃度均呈正相關。本研究結果證實,精子MMP與精子濃度和PR呈顯著正相關(P<0.05),這可能是因為MMP與精子線粒體內三羥酸循環和氧化磷酸化密切相關,是促使ATP正常生成的重要條件;當MMP因為各種原因降低時,精子線粒體兩側電勢能降低,ATP產生障礙,精子鞭毛供能不足,導致精子活動力下降進而影響受孕率。本研究結果顯示,精子MMP與精子形態正常率呈顯著正相關(P<0.05),與DFI呈顯著負相關(P<0.05)。此結果與Zhang等[14]研究結果相一致。這可能與氧化應激刺激和隨之而來的損傷導致的精子線粒體介導的細胞凋亡程序啟動相關,當精子線粒體受刺激強度超過耐受極限時,線粒體通透性轉換孔開放引起精子MMP下降,該現象發生在染色質濃縮、DNA斷裂等細胞核凋亡特征之前,且線粒體一旦崩潰,精子細胞凋亡過程將不可逆轉,最終導致精子畸形率和DFI升高導致不育[16-19]。本研究結果發現,精子MMP與DFI Spearman相關系數高于其他精液質量指標,也從側面佐證上述結論。

三、精子MMP能更全面地反映精液質量、評估和預測男性生育能力,在臨床中推薦將54%作為精子MMP參考值下限用于綜合評估和預測

男性精液質量的優劣與生育能力直接相關,ROC曲線分析結果顯示,精子MMP預測精液質量整體水平的AUC為0.891,敏感度和特異性較高,有較好預測價值。當MMP≥54%時,檢測者精液質量和功能均趨向正常,臨床生育能力趨向正常;對于以生育前檢查和生育咨詢為目的的檢測者推薦通過精子MMP初步整體評估生育能力,將比全面的檢查精液常規、精子形態學和DFI更具有經濟性價比和便捷性。本研究結果與錢路杰[20]研究結果(MMP參考下限為50.7%)、Kasai等[13]研究結果(MMP參考下限值為52%)基本相近但仍有一定差別。分析原因為:(1)上述學者的研究以既往是否生育、精子活動力以及精子形態學參數分別為分組標準,未將DFI納入分析;(2)不同品牌試劑盒之間檢測差異性大。我們將在后續研究中納入更多數據并比較不同品牌的試劑盒結果,以期得到更準確的大樣本MMP臨床數據,為綜合評估和預測男性生育能力提供臨床參考依據。當MMP<54%時,建議進一步完善精液常規參數、精子形態學、DFI和生育相關基因檢測。目前,將MMP作為綜合評估男性不育、優化輔助生殖技術方案的指標也已經得到了國內同行的認可[21]。

綜上所述,精子MMP是線粒體功能的重要指標,與精子濃度、PR、精子形態正常率和DFI均密切相關,既能體現精子的能量代謝狀態還能反映精子凋亡,在臨床工作中推薦采用流式細胞術檢測MMP并將參考值下限設為54%,能比各單項精液指標更加全面、高效地評估和預測男性生育能力。