敲低鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ZIP7抑制小鼠睪丸支持細(xì)胞增殖的研究

特力格爾，劉璇，李媛靜，李歡歡，王樹松，，，馬婧*

(1. 河北醫(yī)科大學(xué)研究生院,石家莊 050017;2. 河北師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院,石家莊 050024;3. 河北省生殖健康醫(yī)院 河北省生殖醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,石家莊 050071)

鋅在多個(gè)生物學(xué)過程中具有重要功能,確保其含量穩(wěn)定對(duì)于維持正常生命過程至關(guān)重要。這一動(dòng)態(tài)平衡主要由鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Zn transporters,ZnT)家族和鋅鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Zrt-,Irt-related proteins,ZIP)家族的相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(統(tǒng)稱為鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)調(diào)控。其中,ZnT家族可降低細(xì)胞質(zhì)鋅濃度;ZIP家族可升高細(xì)胞質(zhì)鋅濃度。這些鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞膜或細(xì)胞器質(zhì)膜表面,調(diào)控細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞器中的鋅穩(wěn)態(tài)[1-4]。近年來有研究表明鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在男性生殖中發(fā)揮重要作用:有研究顯示ZnT7和ZnT8蛋白可能通過調(diào)節(jié)睪酮合成酶的表達(dá)參與睪酮合成過程[5-6];Zhu等[7]發(fā)現(xiàn)睪丸ZIP12蛋白在精子發(fā)生過程中維持鋅穩(wěn)態(tài),可保護(hù)精原細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷。

ZIP7是ZIP家族LIV-1亞家族的重要成員之一,在多種組織中廣泛表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn),ZIP7不僅可以直接調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的鋅離子穩(wěn)態(tài),而且參與了多種信號(hào)通路的調(diào)控,在胰島素抵抗、Ⅱ型糖尿病、乳腺癌、心肌再灌注損傷等的病理過程中起重要作用[8-10]。有研究表明,ZIP7在睪丸組織粗線期精母細(xì)胞中的含量高于圓形精子細(xì)胞,提示其可能參與精子發(fā)生過程中鋅穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)[11]。然而,既往研究對(duì)睪丸支持細(xì)胞中鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體的生理功能及作用機(jī)制的報(bào)道較少。因此,本研究觀察了ZIP7在小鼠睪丸支持細(xì)胞(TM4細(xì)胞)中的表達(dá)定位,建立ZIP7基因敲低(siRNA干擾)模型來研究ZIP7敲低對(duì)TM4細(xì)胞的影響及其機(jī)制,旨在從細(xì)胞水平探究ZIP7的生物學(xué)功能,以期為研究鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在雄性生殖細(xì)胞中的作用提供一定理論基礎(chǔ)。

材料與方法

一、材料與試劑

小鼠睪丸支持細(xì)胞系(TM4細(xì)胞)購(gòu)自武漢普諾賽公司。DMEM/F-12完全培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;胎牛血清和馬血清購(gòu)自美國(guó)VivaCell Biosciences公司;青霉素-鏈霉素雙抗溶液和Trypsin EDTA Solution A購(gòu)自以色列Biological Industries公司;1×PBS緩沖液、H2O2、Triton X-100和抗熒光衰減封片劑購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;BSA購(gòu)自澳大利亞Bovogen Biologicals公司;siRNA套餐(mSlc39a7)購(gòu)自天津中實(shí)基因科技有限公司;OPTI-MEM減血清培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;LipofectamineTM2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;SuperKineTM超敏型細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑(CCK-8)購(gòu)自美國(guó)Abbkine公司;6分鐘耐熱首鏈cDNA合成試劑盒購(gòu)自天津中實(shí)基因科技有限公司;2×SYBR Green Fast qPCR Mix購(gòu)自美國(guó)ABclonal公司;活性氧檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京盒子生工科技有限公司;兔抗ZIP7抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司;鼠抗蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)抗體購(gòu)自美國(guó)GeneTex公司;鼠抗性別決定區(qū)Y框蛋白9(SOX9)抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司;辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG(H+L)和異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的山羊抗兔IgG(H+L)購(gòu)自美國(guó)KPL公司;HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(H+L)購(gòu)自美國(guó)Sera Care公司;Fluor594標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(H+L)購(gòu)自美國(guó)Affinity公司;鼠抗GAPDH抗體購(gòu)自美國(guó)Immunoway公司;兔抗c-Jun氨基末端激酶(JNK)抗體、兔抗磷酸化JNK(p-JNK)抗體、兔抗細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)抗體和兔抗磷酸化ERK(p-ERK)抗體購(gòu)自杭州華安生物技術(shù)有限公司;高效RIPA細(xì)胞裂解液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;Western blot相關(guān)試劑購(gòu)自北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司;超敏ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑購(gòu)自上海李記生物有限公司。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.TM4細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定:TM4細(xì)胞培養(yǎng)在DMEM/F12培養(yǎng)基(含5%HS、2.5%FBS、1%青霉素-鏈霉素雙抗溶液)中,置于5%CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中48～72 h。顯微鏡下觀察到細(xì)胞呈上皮細(xì)胞樣貼壁生長(zhǎng),鏡下細(xì)胞形態(tài)與標(biāo)準(zhǔn)TM4細(xì)胞系一致;并對(duì)TM4細(xì)胞進(jìn)行短串聯(lián)重復(fù)序列(Short tandem repeat,STR)基因分型鑒定,通過細(xì)胞免疫熒光染色法檢測(cè)TM4細(xì)胞上支持細(xì)胞標(biāo)志物SOX9的表達(dá),結(jié)果認(rèn)為可鑒定為TM4細(xì)胞系。

2.細(xì)胞免疫熒光染色法檢測(cè)ZIP7在TM4細(xì)胞上的定位:將細(xì)胞爬片放入24孔板中接種細(xì)胞,細(xì)胞貼壁24 h后吸棄培養(yǎng)液,PBS清洗3次;冰甲醇固定10 min;固定后PBS清洗3次;0.5%Triton X-100通透處理15 min;PBS清洗3次;5%BSA溶液室溫封閉50 min;棄去封閉液,一抗稀釋液4℃過夜孵育,一抗稀釋濃度為ZIP7(1∶200)、PDI(1∶200)、SOX9(1∶200)。次日,從4℃冰箱取出細(xì)胞爬片后室溫平衡30 min,PBS清洗3次;熒光二抗稀釋液37℃避光孵育1 h,二抗稀釋濃度為FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶250)、Fluor594標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(1∶250),PBS避光清洗3次,用抗熒光衰減封片劑封片,使用MD ImageXpress Micro高內(nèi)涵細(xì)胞成像分析系統(tǒng)采集圖像。

3.細(xì)胞轉(zhuǎn)染:將TM4細(xì)胞接種在6孔板中,待細(xì)胞密度達(dá)到70%～90%時(shí)轉(zhuǎn)染ZIP7 siRNA。OPTI-MEM減血清培養(yǎng)基分別與LipofectamineTM2000和siRNA混勻,室溫靜置5 min。將LipofectamineTM2000緩慢滴進(jìn)siRNA中,輕輕吹吸混勻后室溫靜置20 min。將6孔板中舊的培養(yǎng)基棄掉,加入800 μl的OPTI-MEM減血清培養(yǎng)基,再將LipofectamineTM2000-siRNA混合物逐滴加入每孔中。轉(zhuǎn)染4～6 h后觀察細(xì)胞狀態(tài),棄掉舊培養(yǎng)基,加入2 ml完全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染24 h后檢測(cè)RNA水平變化,48 h后檢測(cè)蛋白水平變化,用ZIP7 siRNA組與對(duì)照組的相對(duì)表達(dá)水平表示干擾效率(剩余基因/蛋白表達(dá)百分比)。

4.CCK8法檢測(cè)TM4細(xì)胞增殖能力:TM4細(xì)胞分為對(duì)照組和ZIP7 siRNA組,按5×103個(gè)細(xì)胞/孔的密度在96孔板中接種細(xì)胞,每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,觀察細(xì)胞密度和貼壁狀態(tài),進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染24 h和48 h后,棄去96孔板中的舊細(xì)胞培養(yǎng)液,加入含10%CCK-8溶液的培養(yǎng)基,在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30 min,用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處每孔的OD值,處理數(shù)據(jù)并繪制增殖曲線。

5.DHE熒光探針檢測(cè)TM4細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平:DHE可以穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞,被細(xì)胞內(nèi)的ROS氧化后形成氧化乙啶摻入染色體DNA中,使細(xì)胞核呈現(xiàn)明亮紅色熒光。用DMEM/F12培養(yǎng)基稀釋DHE(1∶500),使終濃度為10 μmol/L。去除舊細(xì)胞培養(yǎng)液,向24孔板加入200 μl稀釋好的DHE。細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min,每隔3～5 min顛倒混勻一次,使探針和細(xì)胞充分接觸。棄去上層培養(yǎng)液,用PBS反復(fù)輕輕吹打,在熒光顯微鏡上檢測(cè)熒光并拍照記錄,采用Image J軟件對(duì)圖片進(jìn)行熒光強(qiáng)度的半定量分析。

6.實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)檢測(cè)TM4細(xì)胞內(nèi)ZIP7 mRNA的相對(duì)表達(dá)量:細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)束后吸棄6孔板中的細(xì)胞培養(yǎng)液,PBS清洗3次,每孔加入500 μl RL1裂解液,室溫裂解10 min后,轉(zhuǎn)移至DNA-cleaning管中,隨后操作按試劑盒說明書提取RNA。每份RNA標(biāo)本中加入4 μl 5×Fast Plus RT Master mix和1 μl 20×Oligo dT &Random Primer,并用RNase-free水將整個(gè)反應(yīng)體系補(bǔ)足20 μl,充分混勻,瞬時(shí)離心后上機(jī)。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序設(shè)置:50℃ 5 min(第一鏈cDNA合成)、95℃ 1 min(失活反轉(zhuǎn)錄酶MuLV)。從逆轉(zhuǎn)錄儀中取出cDNA樣本,配制20 μl qPCR反應(yīng)體系:10 μl 2×SYBR qPCR Mix,1 μl cDNA,0.4 μl上游引物,0.4 μl下游引物,8.2 μl H2O。設(shè)置qPCR擴(kuò)增程序:94℃預(yù)變性3 min,94℃ 15 s、60℃ 30 s,共40個(gè)循環(huán),在72℃ 30 s處收集熒光信號(hào),72℃延伸5 min。目的基因以GAPDH為內(nèi)參基因進(jìn)行校準(zhǔn),以對(duì)照組細(xì)胞中目的基因表達(dá)量作為對(duì)照,并根據(jù)2-△△Ct計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。GAPDH上游引物為:5′-CATCACTGCCACCCAGAAGACTG-3′,下游引物為:5′-ATGCCAGTGAGCTTCCCGTTCAG-3′;ZIP7上游引物為:5′-AGCCATGGGACTTCTAGGGA-3′,下游引物為:5′-GATGAGGTGGAGGAACGCAT-3′。

7.Western blot法檢測(cè)TM4細(xì)胞中ZIP7、JNK、p-JNK、ERK和p-ERK蛋白表達(dá)水平:細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)束后吸棄6孔板中的細(xì)胞培養(yǎng)液,用預(yù)冷的PBS清洗3次,加入適量RIPA蛋白裂解液[按1∶100的比例提前加入絲氨酸蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(PMSF),現(xiàn)用現(xiàn)配]裂解細(xì)胞中的蛋白,將蛋白收集在1.5 ml EP管中,旋渦震蕩20 min,4℃ 12 000 rpm離心10 min,取上清液檢測(cè)蛋白濃度。將等量的蛋白樣品用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離,使用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上;使用5%脫脂牛奶對(duì)PVDF膜封閉2 h;分別加入鼠抗GAPDH單克隆抗體(1∶50 000)、兔抗ZIP7單克隆抗體(1∶1 000)、兔抗JNK多克隆抗體(1∶1 000)、兔抗p-JNK多克隆抗體(1∶1 000)、兔抗ERK多克隆抗體(1∶1 000)、兔抗p-ERK多克隆抗體(1∶1 000),4℃孵育過夜;次日,洗膜后加入HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(H+L)和HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(H+L)(1∶5 000),37℃孵育1 h,洗膜,超敏ECL化學(xué)顯影,化學(xué)發(fā)光成像儀檢測(cè),Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。用JNK、ERK分別對(duì)p-JNK、p-ERK歸一化,p-JNK/JNK和p-ERK/ERK表示對(duì)照組和ZIP7 siRNA組JNK、p-JNK、ERK、p-ERK的蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次,取平均值。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、TM4細(xì)胞的細(xì)胞免疫熒光染色

ZIP7表達(dá)綠色熒光,支持細(xì)胞標(biāo)志物SOX9表達(dá)紅色熒光,細(xì)胞核DAPI染色呈現(xiàn)藍(lán)色熒光,細(xì)胞免疫熒光顯示TM4細(xì)胞表達(dá)支持細(xì)胞標(biāo)志物SOX9和ZIP7(圖1)。

二、ZIP7在TM4細(xì)胞上的表達(dá)定位

本研究采用細(xì)胞免疫熒光染色法檢測(cè)ZIP7的亞細(xì)胞定位,結(jié)果顯示,ZIP7表達(dá)綠色熒光,與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特異性標(biāo)志物PDI的紅色熒光高度重合,兩者重合呈現(xiàn)出黃色熒光,表明ZIP7定位于TM4細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上(圖2)。

圖2 ZIP7在TM4細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位(高內(nèi)涵細(xì)胞成像分析系統(tǒng),×100)

三、敲低ZIP7抑制TM4細(xì)胞增殖

本研究采用siRNA干擾TM4細(xì)胞中的ZIP7水平,并采用qPCR和Western blot方法聯(lián)合驗(yàn)證siRNA轉(zhuǎn)染效果,結(jié)果顯示與對(duì)照組相比,ZIP7 siRNA組的ZIP7 mRNA和蛋白表達(dá)量顯著降低(P分別<0.05和<0.01,圖3A～C),干擾效率分別為41.0%和55.6%。CCK8法檢測(cè)TM4細(xì)胞增殖能力,結(jié)果顯示siRNA轉(zhuǎn)染24 h和48 h后TM4細(xì)胞增殖能力顯著降低(P<0.001),提示ZIP7敲低會(huì)抑制TM4細(xì)胞的增殖(圖4)。

A:qPCR檢測(cè)兩組TM4細(xì)胞中ZIP7 mRNA相對(duì)表達(dá)量:與對(duì)照組比較,**P<0.01;B:Western blot法檢測(cè)兩組TM4細(xì)胞ZIP7蛋白表達(dá);C:兩組TM4細(xì)胞中ZIP7蛋白表達(dá)水平的半定量分析:與對(duì)照組比較,**P<0.01。圖3 TM4細(xì)胞ZIP7轉(zhuǎn)染效率

CCK8法檢測(cè)轉(zhuǎn)染ZIP7 siRNA 24 h和48 h后TM4細(xì)胞的增殖能力:與對(duì)照組比較,#P<0.001。圖4 敲低ZIP7抑制TM4細(xì)胞增殖

四、敲低ZIP7后TM4細(xì)胞ROS水平升高

DHE熒光探針會(huì)使細(xì)胞核呈現(xiàn)紅色熒光,細(xì)胞內(nèi)ROS水平越高,紅色熒光越強(qiáng)。ZIP7 siRNA組較對(duì)照組紅色熒光顯著增強(qiáng)(P<0.001),提示敲低ZIP7后TM4細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高(圖5)。

A:熒光染料DHE檢測(cè)TM4細(xì)胞內(nèi)ROS水平;B:兩組TM4細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度的半定量分析:與對(duì)照組比較,#P<0.001。圖5 敲低ZIP7后TM4細(xì)胞的ROS水平升高

五、敲低ZIP7后激活JNK磷酸化

與對(duì)照組比較,ZIP7 siRNA組JNK蛋白水平表達(dá)無顯著性差異(P>0.05),p-JNK蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05),提示敲低ZIP7后TM4細(xì)胞內(nèi)JNK蛋白磷酸化水平升高。與對(duì)照組比較,ZIP7 siRNA組ERK和p-ERK蛋白水平表達(dá)無顯著性差異(P>0.05),提示ZIP7敲低不明顯影響ERK的磷酸化水平(圖6)。

A:Western blot法檢測(cè)TM4細(xì)胞中JNK和p-JNK、ERK和p-ERK蛋白表達(dá);B:兩組TM4細(xì)胞中JNK和p-JNK、ERK和p-ERK蛋白表達(dá)水平的半定量分析:與對(duì)照組比較,*P<0.05。圖6 敲低ZIP7對(duì)TM4細(xì)胞JNK、p-JNK、ERK和p-ERK蛋白的影響

討 論

睪丸支持細(xì)胞是一種極化的上皮細(xì)胞,可從生精上皮的基底部延伸至生精小管管腔內(nèi)。這類細(xì)胞可以分泌多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以供生殖細(xì)胞的正常發(fā)育成熟,為生殖細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)提供結(jié)構(gòu)性支持,并為精子發(fā)生構(gòu)建了免疫屏障[12]。研究證實(shí),細(xì)胞內(nèi)的鋅離子發(fā)揮著廣泛的生物學(xué)作用,與細(xì)胞膜穩(wěn)定、細(xì)胞內(nèi)基因調(diào)控和物質(zhì)代謝等過程關(guān)系密切[13]。因此,睪丸支持細(xì)胞內(nèi)鋅穩(wěn)態(tài)的維持對(duì)其生理功能的正常發(fā)揮至關(guān)重要。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)重要的鋅儲(chǔ)存庫(kù),對(duì)于維持細(xì)胞質(zhì)鋅離子濃度至關(guān)重要[14]。研究發(fā)現(xiàn)ZIP7是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放鋅離子的關(guān)鍵“守門人”,可以將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的鋅離子轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì),使其在多種細(xì)胞生物學(xué)過程中發(fā)揮正常功能[15-16]。本研究通過細(xì)胞免疫熒光染色觀察到ZIP7定位于TM4細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上,這與之前的報(bào)道[15,17-18]一致。有文獻(xiàn)報(bào)道鋅離子對(duì)細(xì)胞分裂和增殖相關(guān)酶的活性至關(guān)重要,也可通過垂體生長(zhǎng)激素(GH)-胰島素樣生長(zhǎng)因子-I(IGF-I)軸的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)參與細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)[19]。本研究通過CCK8法分別檢測(cè)了TM4細(xì)胞轉(zhuǎn)染ZIP7 siRNA后24 h和48 h的增殖能力,結(jié)果顯示敲低ZIP7后TM4細(xì)胞的增殖活性顯著下降。推測(cè)敲低ZIP7可能通過抑制TM4細(xì)胞從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向細(xì)胞質(zhì)釋放鋅離子的過程,破壞了細(xì)胞內(nèi)的正常鋅離子緩沖與平衡,從而抑制了細(xì)胞的正常增殖活性。

本研究發(fā)現(xiàn)ZIP7敲低后TM4細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高。既往研究顯示高ROS水平可以激活下游的JNK通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等多種信號(hào)通路,從而誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷和凋亡[20-21]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),ROS抑制劑N-乙酰-L-半胱氨酸可以顯著抑制JNK的磷酸化,表明二者密切相關(guān)[22]。JNK是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族的重要成員,在細(xì)胞增殖、分化或死亡等多種細(xì)胞過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[23]。研究證實(shí),ZIP7在磷酸化后可以激活細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶以及JNK和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)磷酸化[24-25]。因此,為進(jìn)一步闡明敲低ZIP7后抑制TM4細(xì)胞增殖的機(jī)制,本研究重點(diǎn)探究了ZIP7與JNK、ERK蛋白磷酸化之間的關(guān)系。結(jié)果顯示,敲低TM4細(xì)胞的ZIP7表達(dá)可以激活JNK蛋白磷酸化,但不影響ERK蛋白的磷酸化水平表達(dá)。大量證據(jù)表明細(xì)胞內(nèi)ROS水平增加與JNK通路的激活對(duì)于抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖至關(guān)重要。Li等[26]研究發(fā)現(xiàn)增加ROS和活化JNK的產(chǎn)生可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖并促進(jìn)凋亡。Wang等[27]研究表明Curcin C蛋白可能通過激活JNK信號(hào)通路從而促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)ROS積累,誘導(dǎo)人骨肉瘤U2OS細(xì)胞周期阻滯、凋亡和自噬,抑制其增殖。因此,本研究推測(cè)敲低ZIP7能通過介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高和JNK磷酸化激活,抑制TM4細(xì)胞增殖能力。但是本研究尚存在一些不足之處,如缺乏挽救實(shí)驗(yàn)等。此外,由于沒有檢測(cè)其他ZIP家族的變化,本研究無法明確ZIP家族之間的綜合作用或代償平衡作用。未來可以嘗試使用ROS抑制劑或JNK通路抑制劑干預(yù)細(xì)胞,深入挖掘ZIP7作用的相關(guān)上下游通路及分子機(jī)制。

綜上所述,敲低ZIP7可以顯著抑制TM4細(xì)胞增殖,該過程可能通過ROS水平的升高以及JNK通路的激活介導(dǎo)。本研究初步探索了鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ZIP7在小鼠睪丸支持細(xì)胞(TM4細(xì)胞)中的分子調(diào)控機(jī)制,為進(jìn)一步闡明鋅穩(wěn)態(tài)在雄性生殖細(xì)胞中發(fā)揮的作用提供理論參考。